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Summary
डिजिटल micromirror उपकरणों (डीएमडी) समय और अंतरिक्ष में जटिल पैटर्न के साथ जो neuronal excitability पर नियंत्रण करने के लिए उत्पन्न कर सकते हैं. डिजाइन, निर्माण, और DMD प्रणाली के ऑपरेशन के लिए प्रासंगिक मुद्दे पर चर्चा कर रहे हैं. इस तरह की एक प्रणाली बाहर का वृक्ष के समान शाखा अंक के पार गैर रेखीय एकीकरण के प्रदर्शन सक्षम होना चाहिए.
Abstract
प्रकाश एक बहुमुखी और सटीक neuronal excitability नियंत्रण का मतलब है. चैनल rhodopsin और बंदी न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में प्रकाश के प्रति संवेदनशील effectors के हाल ही के परिचय के बेहतर नियंत्रण का मतलब है कि प्रायोगिक तंत्रिका विज्ञान के लिए उपयोगी होते हैं अंतरिक्ष और समय में प्रकाश के पैटर्न के विकास में हितों के लिए नेतृत्व किया है. एक पारंपरिक रणनीति, confocal और 2-photon माइक्रोस्कोपी में कार्यरत एक विवर्तन सीमित जगह पर प्रकाश ध्यान केंद्रित करने और तब हित के क्षेत्र पर है कि एक स्थान sequentially स्कैन है. इस दृष्टिकोण समस्याग्रस्त हो जाती है अगर बड़े क्षेत्रों के लिए एक संक्षिप्त समय विंडो में, एक इमेजिंग के लिए की तुलना में अधिक photostimulation के लिए लागू समस्या के भीतर प्रेरित किया जा है. एक वैकल्पिक रणनीति के लिए एक डिजिटल micromirror डिवाइस (डीएमडी) की सहायता के साथ पूरा लक्ष्य पर स्थानिक पैटर्न परियोजना है. DMD दृष्टिकोण क्योंकि हार्डवेयर घटकों अपेक्षाकृत सस्ती हैं अपील कर रही है और वाणिज्यिक हितों के द्वारा समर्थित है. क्योंकि एक ऐसी प्रणाली ईमानदार सूक्ष्मदर्शी के लिए उपलब्ध नहीं है, हम और इस तरह के एक DMD प्रणाली के निर्माण और संचालन में महत्वपूर्ण मुद्दों पर चर्चा करेंगे. हालांकि हम मुख्य रूप से यूवी photolysis के लिए किया जाएगा प्रणाली के निर्माण का वर्णन, optogenetic प्रयोगों के लिए बहुत सरल दिखाई प्रकाश व्यवस्था के निर्माण के लिए संशोधन को भी उपलब्ध कराया जाएगा. यूवी photolysis प्रणाली को प्रयोगों carryout करने के लिए तंत्रिका विज्ञान में एक मौलिक सवाल का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, spatially बाहर का वृक्ष के समान शाखा अंक भर में एकीकृत आदानों कैसे वितरित कर रहे हैं. परिणामों का सुझाव है कि गैर रेखीय एकीकरण शाखा अंक के पार हो और supralinearity मोटे तौर पर NMDA रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता है.
Protocol
जनरल डिजाइन विचार
यदि फोटो उत्तेजना की तरंग दैर्ध्य optogenetic प्रयोगों के लिए के रूप में दिखाई रेंज में है, प्रणाली के लेआउट यूवी photolysis प्रयोगों के लिए की तुलना में काफी आसान हो जाएगा. केवल एक दोहरी कैमरा बंदरगाह मॉड्यूल है कि सभी कंपनियों के खुर्दबीन से उपलब्ध है खरीद करने की जरूरत है. DMD विमान दो कैमरा बंदरगाहों में से एक के संयुग्म छवि विमान पर तैनात किया जा सकता है. लेकिन यूवी photolysis में महामारी रोशनी पथ (छवि 3A) के माध्यम से DMD से प्रारंभिक प्रकाश में लाया चाहिए, क्योंकि इमेजिंग ट्यूब कैमरे के लेंस व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किसी भी सूक्ष्मदर्शी में यूवी तरंग दैर्ध्य के लिए सही नहीं है. इमेजिंग ट्यूब लेंस के 350 एनएम पर गोलाकार विपथन एक तंग जगह के लिए प्रकाश ध्यान केंद्रित करने और पर्याप्त स्थानिक संकल्प उत्पन्न करने की क्षमता को रोकने के काफी गंभीर है. इस समस्या confocal माइक्रोस्कोपी में सामना नहीं क्योंकि ट्यूब लेंस जब collimated लेजर बीम में एक ही ऑप्टिकल अक्ष के साथ लाया जाता है हटा दिया जाता है है. यूवी रोशनी की समस्या महामारी फ्लोरोसेंट पथ के माध्यम से प्रकाश में लाने के द्वारा हल किया जा सकता है क्योंकि ट्यूब वहाँ लेंस सभी आंशिक रूप से यूवी तरंग दैर्ध्य में गोलाकार विपथन के लिए सही कर रहे हैं. हम सूक्ष्मदर्शी की प्रकाशिकी पर किसी भी डिग्री पत्रिका की इच्छाओं का विस्तार कर सकते हैं. वैज्ञानिक समुदाय में इस विषय में सामान्य जल्दी दिलचस्पी है और वहाँ कई स्रोतों है कि यह अच्छी तरह से सिखाता है नहीं कर रहे हैं.
माइक्रोस्कोप के आदेश में संशोधनों को कम करने के लिए और क्योंकि महामारी प्रतिदीप्ति इकाई पर तंग जगह की कमी की, DMD एक नव निर्मित संयुग्म छवि एक रिले लेंस (बाहर DMD इकाई की स्थिति के संबंध में बात के द्वारा बनाई गई विमान में रखा है माइक्रोस्कोप). एक वाणिज्यिक यूवी सही रिले लेंस (विशेषता प्रकाशिकी) खरीदा गया था (यह चित्र में और माइक्रोस्कोप पर बाहर बिंदु).
DMD की रोशनी
द्विपदीय इनपुट प्राप्त करने पर एक micromirror एक सकारात्मक और एक नकारात्मक 12 ° झुकाव चिप के विमान सापेक्ष के बीच स्विच कर सकते हैं. प्रत्येक दर्पण (45 चिप के पक्ष °) के विकर्ण कोनों के साथ रोटेशन की धुरी है. दर्पण रोटेशन के उन्मुखीकरण चिप के सामने की सतह पर एक कोने में एक सोने के रंग का त्रिकोण द्वारा नामित है. micromirror के झुकाव कोण और आने वाली रोशनी बीम की पिच azithmus के संरेखण पैदा करती है. रोशनी की किरण की पिच DMD चिप और azithmus की जरूरत दर्पण रोटेशन की धुरी को सीधा सीधा अक्ष से 24 ° करने के लिए की जरूरत है. सटीक बीम संरेखण कुशल संचालन के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटोटाइप प्रणाली में हम कई पुस्तिका झुकाव समायोजन कि हमारे डिजाइन और मशीनिंग अपर्याप्तता के लिए सही करने के लिए अनुमति डिजाइन किए हैं. यह एक प्रणाली है कि काफी अधिक भारी से आवश्यक है है में हुई. वैकल्पिक प्रकाश में लाने के लिए और अधिक कॉम्पैक्ट व्यवस्था संभव है (वैकल्पिक डिजाइन दिखाने के लिए अगर उपयोगी समझा).
Photolysis प्रयोगों के लिए एक लेज़र स्रोत के लिए उच्च प्रकाश तीव्रता केंद्रित बीम तेजी uncaging के लिए आवश्यक उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. जहां उच्च तीव्रता तेजी से ध्यान केंद्रित प्रकाश की आवश्यकता नहीं है optogenetic प्रयोगों के लिए, एक गैर संसक्त प्रकाश स्रोत पर्याप्त होगा. Photolysis प्रयोग में यहाँ वर्णित हम कार्यरत एक अर्ध निरंतर डायोड ठोस राज्य (DPSS) पंप आवृत्ति लेजर NdVO4 (डब्ल्यू 1, 355 एनएम) तीन गुना है. (Photolysis के लिए प्रकाश स्रोतों के विकल्प की एक विस्तृत चर्चा के लिए 2 संदर्भ देखें). एक अपेक्षाकृत उच्च शक्ति लेजर यहाँ वर्णित प्रयोगों में आवश्यक है क्योंकि लेजर उत्पादन का केवल एक छोटा सा अंश वास्तव में नमूना के लिए वितरित किया जाता है जब एक DMD प्रणाली का उपयोग कर. नमूना करने के लिए वितरित प्रकाश की राशि लेजर बीम से प्रबुद्ध क्षेत्र के भीतर बंद / पर दर्पण की संख्या के अनुपात के लिए आनुपातिक है.
यदि एक लेज़र प्रकाश स्रोत की आवश्यकता है, यह सबसे अच्छा है एक बहुपद्वति फाइबर में लेजर के उत्पादन शुरू इतना है कि यह आसानी से और DMD रोशन के लिए सही अक्ष के साथ स्थिति उन्मुख किया जा सकता है. ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से प्रकाश को हस्तांतरित एक दूसरी समस्या हल करती है, कैसे धब्बा सुसंगत रोशनी करने के लिए अंतर्निहित पैटर्न को खत्म करने के लिए. फाइबर एक piezoelectric फाइबर (915 मॉडल, कनाडा इंस्ट्रुमेंटेशन एंड रिसर्च, लिमिटेड) स्ट्रेचर कि ~ 40 kHz पर oscillates के आसपास घाव है. (रिग में इन बाहर बिंदु) फाइबर की सूक्ष्म खींच चालें प्रत्येक तस्वीर उत्तेजना नाड़ी की मिलीसेकेंड की अवधि के दौरान धब्बा पैटर्न कई बार, इस प्रकार प्रभावी ढंग से speckling के प्रभाव को नष्ट करने के लिए पर्याप्त है. ऑप्टिकल फाइबर के उत्पादन में तो एक यूवी माइक्रोस्कोप उद्देश्य (ओलिंप DApo20UV) के साथ collimated है. (इस बाहर बिंदु) प्रणाली की ऑप्टिकल संकल्प के एक अंशांकन छवि में दिखाया गया है. 3B. प्रभावी शारीरिक रूप से तस्वीर की जगह की स्थिति के एक समारोह के रूप में वर्तमान प्रवाह के आयाम से मापा संकल्पउत्तेजना छवि में दिखाया गया है. 3C. विभिन्न तीव्रता के photostimulation वर्तमान प्रतिक्रिया छवि में सचित्र हैं. 3D.
प्रणाली के ऑपरेशन:
सह पंजीकरण DMD दर्पण के साथ पिक्सेल सीसीडी
एक सॉफ्टवेयर घर में लिखा गया था कि इमेजिंग सीसीडी कैमरा की विशिष्ट पिक्सल के लिए व्यक्तिगत DMD दर्पण के पत्राचार निर्धारित करता है. इस सॉफ्टवेयर के भीतर ग्राफिक्स यूजर इंटरफेस (GUI) तब DMD दर्पण है कि क्षेत्र के लिए माउस द्वारा टैग सीसीडी छवि पर संगत असाइन करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. इस प्रकार, फोटो उत्तेजना के लिए स्थान बस कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित छवि पर कर्सर हिल और हित के टैग क्षेत्र पर क्लिक करके टैग किया जा सकता है है. (एक वृक्ष के समान कुंज के एक फ्लोरोसेंट छवि कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाएगा छात्र कंप्यूटर स्क्रीन पर छवि पर स्थानों की संख्या का प्रतीक होगा.)
प्रकाश प्रसव के लिए पैटर्न प्रोग्रामिंग
ऑपरेटर द्वारा कंप्यूटर स्क्रीन पर चिह्नित पैटर्न अलग छवियों की एक श्रृंखला के रूप में संग्रहीत किया जाता है. प्रत्येक स्थानिक पैटर्न के लिए लेजर दालों के समय तो जो डाटा अधिग्रहण (pClamp) कार्यक्रम के साथ एकीकृत सॉफ्टवेयर में क्रमादेशित है. (इस प्रदर्शन).
DMD पैटर्न के लिए लेजर दालों समन्वय
डाटा अधिग्रहण कार्यक्रम शुरू की है और DMD इलेक्ट्रॉनिक्स, लेजर के gating, और पैच के अधिग्रहण के समय निर्देशांक लक्ष्य न्यूरॉन से बिजली के संकेत clamped. (कंप्यूटर पर इस अनुक्रम अनुकरण)
प्रयोगात्मक डेटा:
बाहर का वृक्ष के समान शाखा अंक के पार गैर रेखीय योग
इलेक्ट्रोड के साथ वृक्ष के समान एकीकरण परंपरागत असतत स्थानों पर उत्तेजना के आयाम अलग बजाय उत्तेजना के क्षेत्र का विस्तार करते हुए एक निरंतर तीव्रता को बनाए रखने के द्वारा किया गया है बाहर ले. Electrogenesis की संतृप्ति और स्थान निर्भर चैनलों की भर्ती से संबंधित मुद्दे परिणाम और निष्कर्ष को प्रभावित कर सकते हैं. वितरित वृक्ष के समान उत्तेजना को आसानी से एक DMD आधारित प्रणाली (4A छवि) का उपयोग कर कार्यान्वित कर सकते हैं. इनपुट तीव्रता photostimulation के धब्बे की संख्या में वृद्धि से विविध किया गया था. हम देख सकते हैं कि स्थानिक योग गैर रेखीय शाखा अंक भर में बढ़ती इनपुट आयाम दो बेटी शाखाओं पर पहुंचने के साथ तेजी से ऊपर अर्थ का उपसर्ग रेखीय बनने. ऊपर अर्थ का उपसर्ग linearity काफी हद तक NMDA रिसेप्टर्स मध्यस्थता है और करने के लिए gated चैनलों (छवि 5) नहीं वोल्टेज
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 DMD में micromirrors के ऑपरेशन. (साइड देखें) Electrostatic व्यक्तिगत दर्पण पर निर्देशित बलों दर्पण दो संभावित 12 क्षैतिज से झुकाव ° में झुका के कारण. पर स्थिति में एक घटना बीम चिप के ऑप्टिकल अक्ष सीधा के साथ निर्देशित है. बंद की स्थिति में घटना बीम 48 ° बंद अक्ष निर्देशित है. लाइट है कि दर्पण के बीच पतली अंतराल हिट 24 ° बंद अक्ष को निर्देश दिया है. (शीर्ष दृश्य) झुकाव दर्पण और चिप के पक्षों के लिए सम्मान के साथ 45 उन्मुख ° है.
चित्रा 2 आधुनिक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के मूल लेआउट. फिल्टर क्यूब उद्देश्य ट्यूब और लेंस के बीच "अनंत अंतरिक्ष में तैनात है. वहाँ है कि कैमरे के लिए जाता है और वहाँ एक रोशनी रास्ता है कि नमूना प्रकाश लाता है एक इमेजिंग पथ है. इन दो प्रकाश पथ के लिए ट्यूब के लेंस आम तौर पर कर रहे हैं डिजाइन में और नाभीय लंबाई में अलग है. रोशनी, लेकिन इमेजिंग नहीं, ट्यूब लेंस यूवी स्पेक्ट्रम में ऑपरेशन के लिए डिज़ाइन किया गया है.
चित्रा 3 यूवी आधारित DMD प्रणाली के लिए लेआउट . यदि रोशनी पराबैंगनी स्पेक्ट्रम में है, तो यह ट्यूब लेंस यूवी के लिए सही है के माध्यम से लाया जाना चाहिए. इमेजिंग रास्ते में ट्यूब लेंस यूवी के लिए तैयार नहीं है. एक रिले प्रणाली के लिए एक आसानी से सुलभ संयुग्म छवि विमान बनाने की जरूरत है. माइक्रोस्कोप में विभिन्न संयुग्म छवि विमानों बिंदीदार लाल रेखाओं द्वारा चिह्नित है. एक छवि विमान में तेज पैटर्न अन्य संयुग्म विमानों में पेश कर रहे हैं. इमेजिंग के दौरान नमूना विमान में पैटर्न डिटेक्टर / कैमरे पर अनुमान है. रोशनी के लिए DMD के द्वारा उत्पन्न पैटर्न नमूना पर अनुमान है.
चित्रा 4 प्रकाश दिखाई DMD प्रक्षेपण प्रणाली के लिए लेआउट. यदि रोशनी प्रकाश दिखाई रेंज में है, यह संभव है DMD उत्पन्न इमेजिंग प्रकाश पथ के माध्यम से प्रकाश पैटर्न लाने. यह आसानी से commerci के साथ लागू किया जा सकता हैअल दोहरी कैमरा बंदरगाह संलग्नक और उचित dichroic दर्पण.
चित्रा 5 प्रणाली के पार्श्व संकल्प. (ए) फ्लोरोसेंट लक्ष्य पर ऑप्टिकल संकल्प ~ 2 सुक्ष्ममापी है. (बी) के रूप में एक dendrite भर में बंदी ग्लूटामेट की photolysis द्वारा मापा प्रभावी संकल्प ~ 5 सुक्ष्ममापी है. वृद्धि हुई दूरी ग्लूटामेट और dendrite के परिमित चौड़ाई के प्रसार का एक संयोजन के कारण है. (सी) Photolysis synaptic घटनाओं के कैनेटीक्स की नकल कर सकते हैं. वोल्टेज के परिवार clamped वर्तमान प्रतिक्रियाओं dendrite के लिए वितरित प्रकाश ऊर्जा में बदलाव के कारण है.
चित्रा 6 वृक्ष के समान शाखा अंक भर में गैर रेखीय संकलन. (ए) वितरित आदानों दो वृक्ष के समान शाखाओं को अलग से लागू कर रहे हैं. उनके संबंधित वोल्टेज प्रतिक्रियाओं नीचे दिखाया गया हैं. (बी) उत्तेजनाओं फिर एक साथ दिया जाता है. मापा प्रतिक्रिया (लाल ट्रेस) में दो व्यक्ति की प्रतिक्रियाएं (ग्रे ट्रेस) के गणित राशि से अलग है.
7 चित्रा Supralinear योग NMDA रिसेप्टर निर्भर है. (ए) APV, एक चयनात्मक NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी ब्लॉक supralinear संकलन. (बी) उत्तेजना तीव्रता रिश्ते और NMDA रिसेप्टर प्रतिपक्षी को संवेदनशीलता प्लॉट है.
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Discussion
DMD आधारित photostimulation दृष्टिकोण का लाभ सबसे स्थितियों में, जहां लक्ष्य एक अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र में रह रहे हैं के लिए स्पष्ट है. यदि ब्याज का लक्ष्य बहुत कुछ वृक्ष के समान spines के रूप में छोटे, है, अनुक्रमिक स्कैनिंग confocal और 2-photon प्रणाली के लिए बेहतर दृष्टिकोण होने की संभावना हैं. एक DMD दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण कमजोरी उपलब्ध प्रकाश का अकुशल प्रयोग है. उपलब्ध प्रकाश के थोक जरूरी रवाना दर्पण को निर्देश दिया है और उपयोग नहीं किया.
DMD आधारित प्रणाली सबसे अच्छा दृश्य रेंज में ऑपरेशन के लिए उपयुक्त है. हम आशा करते DMD आधारित photostimulation सिस्टम एक महत्वपूर्ण प्रभाव बनाने के लिए जब optogenetics प्रयोगों के साथ कार्यरत है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NIH और मेरिट समीक्षा से एक वीए अनुसंधान सेवा से सी. मीट्रिक टन के लिए RO1 द्वारा समर्थित किया गया था, और CWL के लिए एक व्यक्ति एनआरएसए
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modern upright fluorescent microscope | |||
| CCD camera and image acquisition software | |||
| Computer and data acquisition/interface system | |||
| DLP Discovery Developer Kit | |||
| ALP3 USB interface | |||
| S2 + Optics w/LED | |||
| Dual camera port unit | |||
| 355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W) | DPSS Laser Inc. | ||
| Laser shutter Model LS6 | Uniblitz | ||
| Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915 | Canadian Instrument and Research, Ltd | 100 um core multimode fiber | |
| Multimode Fiber launcher | Oz Optics | ||
| Signal generator | up to 50 kHz | ||
| Beam collimator | Olympus Corporation | DApo20UV340 | |
| UV relay lens | Special Optics | #: 54-25-60-355 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Tang, C. Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery. Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).
- Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated. Nature. 456, 826-827 (2008).
- Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V.
- Hornbeck, L. J. Digital Light Processing and MEMs: An overview. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.
Tags
बायोइन्जिनियरिंग 49 अंक DMD photolysis dendrite photostimulation DLP optogeneticsErratum
Formal Correction: Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points
Posted by JoVE Editors on 03/24/2011.
Citeable Link.
A correction was made to Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. There was an error with an author's name. The author's middle name had a typo, this corrected to:
M. Daniel Santos
instead of:
M. Danial Santos.
