Photostimulation motifs avec les périphériques numériques Micromirror chargé d'enquêter sur l'intégration à travers des points dendritiques Direction

Summary

Appareils numériques à micromiroirs (DMD) peut générer des modèles complexes dans le temps et l'espace avec lequel contrôler l'excitabilité neuronale. Questions pertinentes pour la conception, la construction et l'exploitation des systèmes DMD sont discutées. Un tel système a permis la démonstration de la non-linéaires intégration à travers des points de ramification distale dendritiques.

Abstract

La lumière est un moyen souple et précise pour contrôler l'excitabilité neuronale. L'introduction récente de la lumière effecteurs sensibles comme canal rhodopsine et de neurotransmetteurs en cage ont conduit à des intérêts dans le développement de meilleurs moyens pour contrôler les tendances de la lumière dans l'espace et du temps qui sont utiles à des fins expérimentales en neurosciences. Une stratégie classique, employé dans la microscopie confocale et 2-photon, est de focaliser la lumière d'une tache de diffraction limitée et ensuite numériser cet endroit simple séquentielle sur la région d'intérêt. Cette approche devient problématique si des zones de grande taille doivent être stimulés dans une fenêtre de temps bref, un problème plus applicable à photostimulation que pour l'imagerie. Une autre stratégie consiste à projeter le modèle spatiale complète sur la cible à l'aide d'un appareil numérique à micromiroirs (DMD). L'approche DMD est attrayante car les composants matériels sont relativement peu coûteux et est soutenu par des intérêts commerciaux. Parce qu'un tel système n'est pas disponible pour microscopes droits, nous allons discuter des questions critiques dans la construction et l'exploitation d'un tel système DMD. Même si nous sera principalement décrivant la construction du système de photolyse UV, les modifications de la construction du système d'éclairage beaucoup plus simple visibles pour des expériences optogénétique seront également fournis. Le système de photolyse UV a été utilisé pour carryout expériences pour étudier une question fondamentale en neurosciences, comment sont répartis dans l'espace des entrées intégrées dans distale points de branchement dendritique. Les résultats montrent que l'intégration peut être non linéaire à travers des points de branchement et la supralinearity est largement médiatisée par les récepteurs NMDA.

Protocol

Considérations générales de conception

Si la longueur d'onde de la stimulation photo est dans le domaine visible, comme pour les expériences de optogénétique, l'agencement du système sera nettement plus simple que pour des expériences de photolyse UV. Il suffit d'acheter un module de caméra à double port qui est disponible à partir de toutes les entreprises microscope. L'avion DMD peut être positionné dans le plan image conjuguée de l'un des deux ports caméra. Mais dans la photolyse UV de la lumière provenant de la DMD doit être mis en travers du chemin épi-illumination (figure 3A), parce que la lentille de tube imagerie menant à la caméra n'est pas corrigé pour longueur d'onde UV dans l'un des microscopes disponibles commercialement. L'aberration sphérique de la lentille de tube d'imagerie à 350 nm est suffisamment grave pour empêcher la possibilité de focaliser la lumière d'un spot serrés et à générer suffisamment de résolution spatiale. Ce problème ne se rencontre pas en microscopie confocale, car la lentille de tube est enlevé quand un faisceau laser collimaté est amené sur le même axe optique. Le problème de l'éclairage UV peut être résolu en apporter la lumière à travers le chemin épi-fluorescence, car les lentilles du tube, il ya toutes partiellement corrigé pour l'aberration sphérique à longueur d'onde UV. Nous pouvons élargir l'optique des microscopes à aucun degré les souhaits du journal. La communauté scientifique est en général rapidement intéressés à ce sujet et il n'y a pas beaucoup de sources qu'elle enseigne bien.

Afin de minimiser les modifications du microscope et à cause de contraintes d'espace étanche à l'unité épifluorescence, le DMD est placé à un plan image conjugué nouvellement créé créé par une lentille relais (remarquer la position de l'unité de la DMD par rapport au microscope). Un UV commerciaux corrigées lentille de relais a été acheté (Optique Spécialité) (le signaler dans le diagramme et sur le microscope).

Illumination de la DMD

Dès réception de son entrée binaire une micromiroirs pouvez basculer entre un positif et un négatif 12 ° d'inclinaison par rapport au plan de la puce. L'axe de rotation est le long de la diagonales de chaque miroir (45 ° sur les côtés de la puce). L'orientation de la rotation miroir est désigné par un triangle de couleur or dans un coin sur la face avant de la puce. L'angle d'inclinaison de l'micromiroirs dicte l'alignement de la hauteur et azithmus du faisceau d'illumination entrants. La hauteur du faisceau d'éclairage doit être de 24 ° par rapport à l'axe perpendiculaire de la puce DMD et les besoins azithmus à être perpendiculaire à l'axe de rotation miroir. L'alignement précis du faisceau est crucial pour un fonctionnement efficace. Dans le système que nous avons conçu un prototype de multiples ajustements inclinaison manuelle qui nous a permis de corriger les insuffisances de conception et d'usinage. Il en est résulté un système qui est considérablement plus volumineux que nécessaire. Autre, d'un arrangement plus compact pour amener à la lumière est possible (montrer autre conception si cela est jugé utile).

Pour les expériences de photolyse d'une source laser est nécessaire pour générer le faisceau lumineux de haute intensité focalisée nécessaires pour uncaging rapide. Pour les expériences optogénétique où la lumière à haute intensité fortement concentré n'est pas nécessaire, une source de lumière non cohérente serait suffisant. Dans l'expérience décrite ici la photolyse, nous avons employé une diode quasi-continu pompé l'état solide (DPSS) la fréquence a triplé NdVO4 laser (1 W, 355 nm). (Pour une discussion détaillée des choix de sources de lumière pour la photolyse voir référence 2). Un laser de puissance relativement élevée est nécessaire dans les expériences décrites ici, parce que seule une petite fraction de la sortie du laser est effectivement livrée à l'échantillon lors de l'utilisation d'un système de DMD. La quantité de lumière livrés à l'échantillon est proportionnelle au rapport du nombre de ON / OFF miroirs dans la région éclairée par le faisceau laser.

Si une source de lumière laser est nécessaire, il est préférable de lancer la sortie du laser dans une fibre multimode afin qu'il puisse être facilement position et orientée selon l'axe correcte pour éclairer la DMD. Transmettre la lumière à travers la fibre optique permet de résoudre un second problème, comment éliminer les schémas speckle inhérentes à l'éclairage cohérent. La fibre est enroulée autour d'une civière de fibres piézo-électriques (modèle 915, Canadian Instrumentation & Research, Ltd) qui oscille à ~ 40 kHz. (Les indiquer dans la maquette) Le microscopique étirement de la fibre est suffisante pour déplacer le chatoiement fois tendance de nombreux cours de la durée en millisecondes de chaque impulsion de stimulation de photos, ce qui élimine l'effet de mouchetures. La sortie de la fibre optique est alors collimaté avec un objectif de microscope UV (Olympus DApo20UV). (Souligner ce point) Un étalonnage de la résolution optique du système est montré dans la Fig. 3B. La résolution effective physiologiques tel que mesuré par l'amplitude du courant en fonction de la position de la tache de photostimulation est montré dans la Fig. 3C. Les réponses actuelles aux photostimulation d'intensités différentes sont illustrées dans la Fig. 3D.

Fonctionnement du système:

Co-enregistrement des pixels CCD avec les miroirs DMD

Un logiciel interne a été écrite qui détermine la correspondance des particuliers miroirs DMD à des pixels spécifiques de la caméra CCD. L'utilisateur interface graphique (GUI) dans ce logiciel permet à l'utilisateur d'attribuer les miroirs DMD qui correspond à la région sur l'image CCD marqués par la souris. Ainsi, l'emplacement pour la stimulation de photos peuvent être étiquetés en déplaçant simplement le curseur sur l'image affichée sur l'écran d'ordinateur et en cliquant sur la région marqués d'intérêt. (Une image fluorescente d'une tonnelle dendritiques seront affichées sur l'écran d'ordinateur. Étudiants va marquer un certain nombre d'emplacements sur l'image sur l'écran d'ordinateur.)

Programmation des modèles de prestation de lumière

Le modèle marqué sur l'écran d'ordinateur par l'opérateur est stockée sous forme d'une série d'images séparées. La synchronisation des impulsions laser pour chaque configuration spatiale est alors programmé dans le logiciel qui est intégré avec le programme d'acquisition de données (pClamp). (Le démontrer).

Coordination des impulsions laser pour les modèles de la DMD

Le programme d'acquisition de données initie et coordonne le calendrier de l'électronique DMD, le gating du laser, et l'acquisition du patch serré signal électrique du neurone cible. (Simuler cette séquence sur l'ordinateur)

Les données expérimentales:

Non-linéaire sommation travers distale des points de ramification dendritique

L'intégration dendritiques avec des électrodes a été traditionnellement réalisées en faisant varier l'amplitude de la stimulation à des endroits discrets plutôt que d'étendre la zone de stimulation tout en maintenant une intensité constante. Les questions relatives à la saturation du électrogenèse et le recrutement de canaux emplacement dépend peut influencer le résultat et la conclusion. Distribué stimulation dendritiques peuvent être facilement mises en œuvre en utilisant un système basé DMD (figure 4A). L'intensité d'entrée a été modifiée par l'augmentation du nombre de taches de photostimulation. Nous pouvons voir que sommation spatiale peut être non linéaire sur les points de ramification de plus en plus supra-linéaires avec des amplitudes d'entrée croissant d'arriver sur les deux branches fille. Le supra-linéarité est largement médiatisée récepteurs NMDA et non pas à la tension canaux fermée (Fig. 5)

Les résultats représentatifs

Figure 1. Fonctionnement du micromiroirs de la DMD. (Vue latérale) Les forces électrostatiques visant à provoquer des miroirs individuels le miroir pour être incliné dans une des deux orientations possibles de 12 ° à l'horizontale. Dans la position sur un faisceau incident est dirigé suivant l'axe perpendiculaire optique de la puce. En position OFF le faisceau incident est dirigé 48 ° hors axe. Lumière qui frappe les écarts entre les miroirs minces est dirigé 24 ° hors axe. (Vue de dessus) l'inclinaison est orienté à 45 ° par rapport à l'autre des miroirs et des copeaux.

Figure 2. Structure de base d'un microscope moderne fluorescentes. Le cube de filtre est placé dans «l'espace infini" entre l'objectif et la lentille de tube. Il ya un chemin qui mène à l'imagerie de la caméra et il ya une voie d'éclairage qui apporte la lumière à l'échantillon. La lentille de tube pour ces deux parcours de lumière sont habituellement différents dans la conception et à la longueur focale. L'illumination, mais pas de l'imagerie, lentille de tube est conçu pour fonctionner dans le spectre UV.

Figure 3. Disposition des rayons UV du système DMD base. Si l'éclairage est dans le spectre UV, alors elle doit être apporté par la lentille de tube qui est corrigé pour les UV. La lentille de tube dans la voie d'imagerie n'est pas conçu pour les UV. Un système de relais est nécessaire pour créer un plan conjugué facilement accessible de l'image. Les différents plans image conjuguée dans le microscope est marquée par les lignes pointillées rouges. Motifs lumineux dans un plan image sont projetés dans les avions conjugué d'autres. Pendant l'imagerie du motif dans le plan de l'échantillon est projetée sur le détecteur / caméra. Pour l'éclairage du modèle généré par le DMD est projetée sur l'échantillon.

Figure 4. Mise en page pour le système de projection de lumière visible DMD. Si la lumière d'éclairage est dans le domaine du visible, il est possible d'amener la répartition de la lumière DMD générés par le trajet de la lumière d'imagerie. Ceci peut être facilement mis en œuvre avec commerciAl pièces jointes double port caméra et le miroir dichroïque appropriée.

Figure 5. La résolution latérale du système. (A) La résolution optique sur la cible fluorescente est ~ 2 um. (B) La résolution effective telle que mesurée par la photolyse de glutamate en cage dans une dendrite est d'environ 5 um. La distance accrue est due à une combinaison de la diffusion du glutamate et de la largeur finie de la dendrite. (C) La photolyse peut mimer la cinétique des évènements synaptiques. La famille de la tension de serrage des réponses actuelle est due aux variations de l'énergie lumineuse livrés à la dendrite.

Figure 6. Sommation non linéaire à travers des points de ramification dendritique. (A) intrants distribués sont appliqués à deux branches dendritiques séparément. Leurs réponses respectives de tension sont indiquées ci-dessous. (B) Les stimuli sont ensuite donnés simultanément. La réponse mesurée (trace rouge) est différent de la somme arithmétique des deux réponses individuelles (gris trace).

Sommation Figure 7. Supralinear est dépendante des récepteurs NMDA. (A) APV, un antagoniste sélectif des récepteurs NMDA bloque la sommation supralinear. (B) la relation intensité du stimulus et sa sensibilité à l'antagoniste du récepteur NMDA est tracée.

Discussion

L'avantage de l'approche basée photostimulation DMD est le plus évident pour les situations où la cible occupe une superficie relativement grande. Si la cible d'intérêt est très faible, comme un peu d'épines dendritiques, des systèmes de balayage séquentiel confocale et 2-photons sont susceptibles d'être la meilleure approche. Une faiblesse importante de l'approche DMD est son utilisation inefficace de la lumière disponible. La majeure partie de la lumière disponible est nécessairement dirigé vers les miroirs OFF et non utilisés.

Le système DMD base est le mieux adapté pour une utilisation dans le domaine visible. Nous prévoyons DMD systèmes photostimulation base aura un impact significatif lorsqu'il est utilisé avec des expériences optogénétique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355