Узорные Фотостимуляция с цифровыми устройствами Micromirror по расследованию Дендритные интеграции между точками ветвления

Summary

Цифровой микрозеркальным устройства (DMD) может генерировать сложные структуры во времени и пространстве, с которой для управления нейронной возбудимости. Вопросы, касающиеся проектирования, строительства и эксплуатации DMD системах. Такая система позволила демонстрации нелинейных интеграции между дистальной дендритных точками ветвления.

Abstract

Свет является универсальным и точным средством контроля нейронной возбудимости. Недавнее введение светочувствительных эффекторов, таких как канал-родопсина и клетках нейротрансмиттеров привели к интересам в разработке более эффективных средств контроля шаблонов света в пространстве и времени, которые являются полезными для экспериментальной неврологии. Одна условная стратегия, занятых в конфокальной и 2-фотонной микроскопии, является для фокусировки света на дифракционной ограниченное место, а затем сканировать, что одно пятно последовательно по области интереса. Такой подход становится проблематичным, если большие площади должны быть стимулированы в течение короткого временного окна, проблема больше относится к фотостимуляции, чем для работы с изображениями. Альтернативный способ связан с проектом полной пространственной картины на цель с помощью цифровых устройств микрозеркальным (DMD). ДМД подход привлекательны тем, что аппаратные компоненты являются относительно недорогими и поддерживается коммерческими интересами. Потому что такие системы не доступны для вертикальной микроскопы, мы будем обсуждать важнейшие вопросы строительства и эксплуатации таких DMD системы. Хотя у нас будет в первую очередь описания построения системы для УФ-фотолиза, модификации для построения более простой видимый свет система для экспериментов optogenetic также будет оказана. УФ-системы фотолиза был использован для carryout экспериментов по изучению фундаментального вопроса в области неврологии, как пространственно распределенных входов интегрированы во дистальных дендритных точками ветвления. Результаты показывают, что интеграция может быть нелинейными через точки ветвления и supralinearity в значительной степени опосредовано NMDA-рецепторов.

Protocol

Общие соображения дизайна

Если длина волны фото стимуляция в видимом диапазоне, например, для optogenetic экспериментов, расположение системы будет значительно проще, чем для УФ-фотолиза экспериментов. Нужно только приобрести модуль двойного порта камеры, которая доступна из всех микроскоп компаний. ДМД плоскости могут быть размещены на сопряженной плоскости образ либо один из двух портов камеры. Но в УФ фотолиза свете происходящих из ДМД, должны быть привлечены через эпи-освещения пути (рис. 3А), потому что объектив изображение трубки, ведущие к камере не корректируется для УФ-волны в любой из коммерчески доступных микроскопов. Сферической аберрации линзы трубки изображения при 350 нм, достаточно серьезны, чтобы предотвратить возможность фокусировки света в узком месте и генерировать достаточное пространственное разрешение. Эта проблема не встречается в конфокальной микроскопии, поскольку труба линза удаляется при коллимированный лазерный луч принес вдоль одной оптической оси. Проблема УФ освещения может быть решена путем привести в свет через эпи-флуоресцентного путь, потому что трубка линзы Есть все частично скорректированного на сферическую аберрацию в УФ-волны. Мы можем расширить по оптике микроскопов той или иной степени журнала желает. Научное сообщество в целом заинтересованы в быстрой эту тему и Есть не так много источников, которая учит ее хорошо.

Для того чтобы минимизировать модификациях микроскоп и из-за жестких ограничений пространства на эпи-флуоресценции блок, DMD размещается на вновь созданный сопряженной плоскости образ, созданный реле объектив (указать положение DMD единицы по отношению к микроскопом). Коммерческих УФ исправлены реле объектив был куплен (специальность оптика) (точка его в схему и по микроскопом).

Освещение DMD

После получения его двоичный вход микрозеркальным можете переключаться между положительным и отрицательным наклоном 12 ° по отношению к плоскости чипа. Осью вращения по диагонали углах каждого зеркала (45 ° к сторонам чипа). Ориентация вращения зеркала обозначается золотистые треугольник в углу на передней поверхности чипа. Угол наклона микрозеркальным диктует согласование тангажа и azithmus входящего пучка освещения. Шаг освещении луч должна быть 24 ° от перпендикуляра оси DMD чипа и azithmus должна быть перпендикулярна к оси вращения зеркала. Точное выравнивание луч имеет решающее значение для эффективной работы. В прототипе системы мы разработали несколько ручных регулировок наклона, что позволило нам правильно для проектирования и обработки недостатков. Это привело к системе, которая является значительно более громоздким, чем это необходимо. Альтернативный, более компактное расположение для привлечения света возможно (показать альтернативный дизайн если это будет сочтено полезным).

Для фотолиза экспериментов лазерный источник требуется для генерации света высокой интенсивности сфокусированного пучка, необходимые для быстрого uncaging. Для optogenetic экспериментах, где высокая интенсивность резко сфокусированный свет не требуется, некогерентных источников света будет достаточно. В фотолиза эксперимента, описанного здесь мы использовали квазинепрерывного диодной накачкой твердом состоянии (DPSS) частотой три раза NdVO4 лазер (1 Вт, 355 нм). (Для детального обсуждения выбор источников света для фотолиза см. ссылку 2). Относительно высокая мощность лазера требуется в экспериментах, описанных здесь, потому что только малая часть излучения лазера на самом деле доставляется образца при использовании DMD системы. Количество света, доставлены в образце пропорциональна отношению числа ON / OFF зеркала в регионе освещенный лучом лазера.

Если лазерного источника света не требуется, лучше всего начать выход лазера в многомодового волокна, так что она может быть легко позиции и ориентированы вдоль оси правильной для освещения МДД. Передача света через оптическое волокно решает второй проблемы, как устранить спекл-картин присущие когерентного освещения. Волокно наматывается пьезоэлектрических носилках волокна (модели 915, канадские и инструментария исследований, Ltd), которая колеблется в ~ 40 кГц. (Точка в эти установки) микроскопические растяжения волокна достаточно движется спекл-картины много раз в течение миллисекунд, длительность каждого импульса стимуляции фото, тем самым фактически устраняет влияние speckling. Выход из оптического волокна, затем коллимированный с УФ объективный микроскоп (Olympus DApo20UV). (Указать на это) калибровка оптическое разрешение системы показана на рис. 3B. Эффективные физиологические резолюции измеряется амплитуда тока в зависимости от положения пятна фотостимуляция показана на рис. 3C. Текущий ответы на фотостимуляции разной интенсивности приведены на рис. 3D.

Эксплуатация системы:

Сотрудничество регистрации ПЗС пикселей с DMD зеркала

В доме программное обеспечение было написано, что определяет соответствие отдельных зеркал DMD конкретных пикселей камера CCD. Графический пользовательский интерфейс (GUI) в рамках данного форума, то позволяет пользователю назначить DMD зеркала, что соответствует области на ПЗС, помеченной как мышь. Таким образом, место для фото-стимуляции могут быть помечены, просто перемещая курсор на изображение, отображаемое на экране компьютера и нажав меткой области интереса. (Флуоресцентное изображение дендритных беседки будет отображаться на экране компьютера. Студенческая будет отмечать в ряде мест на изображение на экране компьютера.)

Программирование шаблоны для легкой доставки

Картина отмечена на экране компьютера оператора хранится в виде ряда отдельных изображений. Сроки лазерных импульсов для каждой пространственной структурой, то запрограммирован в программное обеспечение, которое интегрируется с программой сбора данных (pClamp). (Это продемонстрировать).

Координационный лазерных импульсов на DMD моделей

Программа сбора данных инициирует и координирует сроки DMD электроники, стробирование лазерного и приобретение патч зажат электрический сигнал от целевого нейрона. (Имитировать эту последовательность на компьютере)

Экспериментальные данные:

Нелинейные суммирование по дистальной дендритных ветвлений

Дендритные интеграции с электродами традиционно осуществляется путем изменения амплитуды стимуляции в дискретных местах, а не расширение области стимуляция при сохранении постоянной интенсивности. Вопросы, связанные с насыщением электрогенеза и вербовки месте зависимые каналы могут повлиять на результаты и выводы. Распределенные дендритных стимуляция может быть легко реализован с использованием DMD система (рис. 4). Входной интенсивность варьировалась за счет увеличения числа пятен фотостимуляции. Мы видим, что пространственное суммирование может быть нелинейными через точки ветвления становится все выше-линейный вход с увеличением амплитуды, прибывающих на две ветви дочь. Сверх-линейность во многом опосредовано NMDA-рецепторы, а не напряжения закрытого канала (рис. 5)

Представитель Результаты

Рисунок 1. Эксплуатация микрозеркал в DMD. (Вид сбоку) электростатических сил, направленных на отдельных зеркал причиной зеркало, чтобы быть наклонена в одну из двух возможных ориентаций 12 ° от горизонтали. В положении ВКЛ падающий луч направлен вдоль оптической оси, перпендикулярной микросхемы. В выключенном положении падающий луч направлен 48 ° от оси. Свет, который поражает тонкий пробелы между зеркалами направлено 24 ° от оси. (Вид сверху) наклон ориентирован 45 ° по отношению к сторонам зеркала и чип.

Рисунок 2. Макет Простая современного флуоресцентного микроскопа. Фильтр куб располагается в «бесконечность пространства" между объективным и трубки объектива. Существует изображений путь, который ведет к камере и есть освещение путь, который приносит свет образца. Трубки линзы для этих двух пути света, как правило, отличаются по дизайну и фокусного расстояния. Освещение, но не с изображениями, трубки объектив предназначен для работы в УФ-спектре.

Рисунок 3. Макет для УФ основан DMD системы. Если освещение в УФ-спектра, то оно должно быть привлечены через трубку объектива, с поправкой на УФ. Трубки линзы в визуализации пути не предназначен для УФ. Реле системы, необходимые для создания легко доступной плоскости сопряженная изображения. Различных сопряженных изображений самолетов в микроскоп отмечен пунктирными красными линиями. Яркие модели в одной плоскости изображения проецируются в других плоскостях сопряжены. Во время визуализации картины в плоскости образца проецируется на детекторе / камеры. Для освещения картины порожденных DMD проецируется образца.

Рисунок 4. Макет для видимого света DMD проекционной системы. Если освещение свет в видимом диапазоне, можно привести DMD генерируемого света узор по пути света изображения. Это может быть легко реализован с commerciдр. двойной порт камеры вложения и соответствующие дихроичных зеркал.

Рисунок 5. Латеральное разрешение системы. (А) Оптическое разрешение на флуоресцентных цель ~ 2 мкм. (В) Эффективное разрешение измеряемый фотолиза клетке глутамата через дендрит составляет ~ 5 мкм. Увеличить расстояние из-за сочетания диффузии глутамата и конечной шириной дендрита. (C) Фотолиз могут имитировать кинетики синаптических событий. Семейство напряжения зажат текущих ответов из-за изменений в световую энергию доставлены дендрита.

Рисунок 6. Нелинейные суммирование по дендритных точками ветвления. () Распределенные входы применяется к двум дендритных ветвей отдельно. Их соответствующие ответы напряжения приведены ниже. (Б) стимулы затем передаются одновременно. Взвешенный ответ (красная линия) отличается от арифметической суммы двух индивидуальных ответов (серая линия).

Рисунок 7. Supralinear суммирование NMDA-рецепторов зависит. (А), АПВ, селективный антагонист NMDA-рецепторов блоков supralinear суммирования. (B) отношения интенсивности раздражителя и его чувствительности к антагонист рецепторов NMDA построена.

Discussion

Преимущество подхода, основанного на DMD фотостимуляции наиболее очевидно в ситуациях, когда цель занимает довольно большую площадь. Если цель интерес очень мало, например, несколько шипов дендритные, последовательный сканирующей конфокальной и 2-фотонных систем, вероятно, быть лучшим подходом. Одним из важных слабость DMD подхода является неэффективное использование имеющегося света. Большая часть имеющегося света обязательно направлены на OFF зеркала и не используется.

ДМД система лучше всего подходит для работы в видимом диапазоне. Мы ожидаем, DMD систем фотостимуляции будет иметь значительное влияние, когда заняты с optogenetics экспериментов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355