ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
يمكن الرقمية micromirror الأجهزة (DMD) توليد أنماط معقدة في الزمان والمكان الذي السيطرة على استثارة العصبية. وتتم مناقشة القضايا ذات الصلة لبناء وتصميم وتشغيل نظم DMD. مكن هذا النظام تظاهرة غير خطية التكامل عبر نقاط القاصي فرع شجيري.
Abstract
الضوء هو وسيلة مرنة ودقيقة للسيطرة على استثارة العصبية. وقد أدى إدخال الأخيرة من المستجيبات الحساسة للضوء مثل قناة رودوبسين والنواقل العصبية في قفص للمصالح في تطوير وسائل أفضل للسيطرة على أنماط الضوء في المكان والزمان التي هي مفيدة لعلم الأعصاب التجريبي. استراتيجية واحدة التقليدية ، المستخدمة في المجهر مبائر و 2 الفوتون ، هو تركيز الضوء على بقعة محدودة والحيود ثم تفحص تلك البقعة واحد بالتتابع على المنطقة من الفائدة. هذا النهج يصبح مشكلة اذا مناطق واسعة يجب أن تكون ضمن إطار تحفيز فترة وجيزة ، وهي مشكلة أكثر مما ينطبق على ضوئي للتصوير. استراتيجية بديلة لإكمال المشروع نمط المكاني على الهدف بمساعدة جهاز micromirror الرقمية (DMD). نهج DMD جذابة لأن مكونات الأجهزة غير مكلفة نسبيا ، ومعتمد من قبل المصالح التجارية. لأن مثل هذا النظام غير قابل للمجاهر تستقيم ، وسوف نناقش هذه القضايا الحاسمة في بناء وتشغيل مثل هذا النظام DMD. على الرغم من أننا سوف تصف في المقام الأول على بناء نظام للتحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية ، سيتم أيضا التعديلات لبناء نظام أبسط بكثير الضوء المرئي للتجارب optogenetic تقديمها. تم استخدام نظام التحليل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية إلى وقوف تجارب لدراسة المسألة الأساسية في علم الأعصاب ، وكيف يتم توزيعها مكانيا المدخلات المتكاملة عبر نقاط القاصي فرع شجيري. وتشير النتائج إلى أن الاندماج يمكن أن يكون غير الخطية عبر نقاط فرع وساطة إلى حد كبير عن طريق المستقبلات NMDA supralinearity.
Protocol
اعتبارات التصميم العامة
إذا كان الطول الموجي من التحفيز الصورة هي في حدود واضحة ، مثل optogenetic للتجارب ، والتخطيط لنظام يكون أبسط بكثير من التحليل الضوئي للتجارب الأشعة فوق البنفسجية. يحتاج المرء فقط لشراء كاميرا مزدوجة المنفذ وحدة ما هو متاح من جميع الشركات المجهر. يمكن وضعه على متن الطائرة نائب العضو المنتدب في الطائرة صورة المتقارن إما واحدة من الموانئ كاميرا اثنين. ولكن يجب أن يكون للأشعة فوق البنفسجية في التحلل الضوئي جلبت ضوء مصدره DMD في المسار من خلال برنامج التحصين الموسع ، الإضاءة (الشكل 3A) ، لأنه لم يتم تصحيح عدسة التصوير أنبوب مما يؤدي إلى الكاميرا لطول موجة الأشعة فوق البنفسجية في أي من المجاهر متاحة تجاريا. والزيغ الكروي للعدسة التصوير أنبوب في 350 نانومتر شديدة بما فيه الكفاية لمنع القدرة على تركيز الضوء على بقعة ضيقة ولتوليد ما يكفي من القرار المكانية. لم يتم مواجهة هذه المشكلة في المجهر مبائر لأن إزالة العدسة أنبوب عندما يتم إحضارها شعاع ليزر على طول محور موازى في البصري نفسه. ويمكن حل مشكلة الإضاءة فوق البنفسجية التي تجلب في ضوء المسار من خلال برنامج التحصين الموسع ، فلوري لأن كل العدسات أنبوب هناك تصحيح انحراف جزئيا عن كروية في الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية. يمكننا التوسع في البصريات من المجاهر إلى أي درجة يرغب المجلة. الأوساط العلمية المهتمة في عامة وسريعة في هذا الموضوع وليس هناك العديد من المصادر أن يعلم ذلك جيدا.
من أجل تقليل التعديلات المجهر وبسبب ضيق المساحة الضيقة في وحدة البرنامج الموسع للتمنيع ومضان ، يوضع على طائرة DMD الصورة المزدوجة التي أنشئت حديثا إنشاؤها بواسطة عدسة التتابع (نشير إلى الموقف من وحدة DMD في ما يتعلق ميكروسكوب). الأشعة فوق البنفسجية A تصحيح التجارية تم شراؤها تتابع عدسة (بصريات التخصص) (النقطة في الرسم البياني وعلى المجهر).
الإضاءة لDMD
لدى استقباله مدخلاته ثنائي يمكن micromirror التبديل بين الايجابية والسلبية لمدة 12 ° الميل النسبي لطائرة من الرقاقة. محور الدوران هو طول كل الزوايا المائلة مرآة (45 درجة على الجانبين من الشريحة). تم تعيينه لاتجاه دوران المرآة التي كتبها مثلث بلون الذهب في زاوية واحدة على السطح الأمامي للرقاقة. زاوية الميل للاملاءات micromirror محاذاة الملعب وazithmus من شعاع الإضاءة واردة. الملعب من شعاع الإضاءة يحتاج إلى 24 درجة من المحور العمودي للرقاقة DMD والاحتياجات azithmus أن يكون عمودي على محور دوران المرآة. دقة محاذاة الشعاع هو أمر حاسم لعملية فعالة. في نموذج أولي لنظام قمنا بتصميم عدة تعديلات الميل اليدوية التي سمحت لنا لتصحيح أوجه القصور تصميم وتصنيع الآلات. وأدى ذلك إلى النظام الذي هو أكثر بكثير مما هو ضروري الضخمة. بديل ، وترتيب أكثر إحكاما لتحقيق ذلك في ضوء ممكن (إظهار تصميم بديل إذا ما تراه مفيدا).
التحلل الضوئي للتجارب مطلوب مصدر الليزر لتوليد شعاع ضوء ارتفاع كثافة تركز اللازمة لuncaging السريع. للتجارب optogenetic حيث لا يشترط ضوء ارتفاع كثافة وتركيز حاد ، ومصدر ضوء غير متماسكة تكون كافية. التحلل الضوئي في التجربة الموصوفة هنا استخدمنا الصمام الثنائي شبه المستمر ضخ الحالة الصلبة (DPSS) ثلاث مرات NdVO4 تردد الليزر (1 واط و 355 نانومتر). (للاطلاع على مناقشة مفصلة لاختيارات مصادر الضوء للتحلل الضوئي أنظر المرجع 2). مطلوب ليزر عالية الطاقة نسبيا في التجارب المذكورة هنا ليتم تسليمها في الواقع سوى جزء صغير من الانتاج ليزر لالعينة عند استخدام نظام DMD. كمية الضوء تسليمها الى العينة يتناسب مع نسبة عدد ON / OFF المرايا داخل المنطقة المضاءة بواسطة شعاع ليزر.
إذا كنت بحاجة لمصدر ضوء الليزر ، فمن الأفضل لبدء انتاج الليزر في الألياف المتعدد بحيث يمكن بسهولة موقف وموجهة على طول المحور الصحيح من أجل إلقاء الضوء على DMD. يحيل بها الضوء عبر الألياف الضوئية يحل المشكلة الثانية ، وكيفية القضاء على أنماط رقطة الملازمة لإنارة متماسكة. وجرح نحو محفة الألياف الألياف كهرضغطية (طراز 915 ، والتهوية والأبحاث الكندية المحدودة) التي تتأرجح عند 40 كيلوهرتز ~. (نقطة في هذه الحفار) والمجهرية التي تمتد من الالياف هي كافية لنقل رقطة نمط مرات عديدة خلال فترة الالف من كل صورة نبض التحفيز ، وبالتالي القضاء على نحو فعال من تأثير التنقيط. وموازى ثم خرج من الألياف البصرية مع الهدف المجهر الأشعة فوق البنفسجية (أوليمبوس DApo20UV). (أشير إلى هذه النقطة) ويرد معايرة القرار البصري للنظام في الشكل. 3B. القرار الفعال الفسيولوجية مقاسا سعة التدفق الحالي بوصفها وظيفة من موقف البقعة من الصورةهو مبين في الشكل التحفيز. 3C. موضحة الاستجابات الحالية لضوئي من كثافات مختلفة في الشكل. 3D.
تشغيل النظام :
شارك في تسجيل بكسل CCD مع المرايا DMD
وقد كتب أحد البرامج في المنزل الذي يحدد المراسلات من المرايا DMD فردية محددة إلى بكسل للكاميرا CCD التصوير. الرسومات واجهة المستخدم (GUI) ضمن هذا البرنامج يسمح للمستخدم ثم تعيين المرايا DMD الذي يتوافق مع المنطقة على الصورة CCD الموسومة بواسطة الفأرة. وبالتالي ، يمكن الموسومة الموقع لتحفيز الصورة بمجرد تحريك المؤشر على الصورة المعروضة على شاشة الكمبيوتر والنقر على المنطقة الموسومة المصالح. (سوف تظهر صورة لجذع الفلورسنت شجيري على شاشة الكمبيوتر. الطلابية سيمثل عدد من المواقع أكثر من الصورة على شاشة الكمبيوتر.)
البرمجة الأنماط لتسليم الخفيفة
يتم تخزين نمط ملحوظ على شاشة الكمبيوتر من قبل المشغل على شكل سلسلة من الصور منفصلة. ثم يتم برمجة توقيت نبضات الليزر لكل نمط المكاني في البرنامج والتي تتكامل مع برنامج الحصول على البيانات (pClamp). (تثبت ذلك).
تنسيق نبضات الليزر إلى أنماط DMD
برنامج الحصول على البيانات يبدأ وينسق توقيت الالكترونيات DMD ، وتبوب من الليزر ، والحصول على التصحيح فرضت الإشارة الكهربائية من الخلايا العصبية المستهدفة. (محاكاة هذا التسلسل على الكمبيوتر)
البيانات التجريبية :
غير الخطية عبر جمع نقاط القاصي فرع شجيري
وقد جرت العادة على التكامل مع أقطاب شجيري نفذت من خلال تغيير السعة من التحفيز في مواقع منفصلة بدلا من توسيع مجال التحفيز مع الحفاظ على كثافة ثابتة. يمكن للمسائل المتعلقة تشبع electrogenesis وتوظيف قنوات الموقع يعتمد التأثير على النتيجة والاستنتاج. ويمكن تحفيز شجيري توزيع تنفيذها بسهولة باستخدام نظام يستند DMD (الشكل 4A). وتفاوتت شدة المدخلات عن طريق زيادة عدد البقع من ضوئي. يمكننا أن نرى أن الجمع المكاني يمكن أن تكون غير خطية عبر نقاط فرع يتزايد فوق خطي مع زيادة سعة الإدخال وصوله إلى فروع ابنة اثنين. وتوسطت إلى حد كبير فوق الخطي مستقبلات NMDA وعدم الجهد قنوات بوابات (الشكل 5)
ممثل النتائج
الشكل 1. عملية لmicromirrors في DMD. (عرض الجانبية) التي تستهدف قوات كهرباء المرايا الفردية يؤدي إلى إمالة المرآة في واحد من اثنين من التوجهات المحتملة 12 درجة من الأفقي. في موقف بشأن توجه شعاع عمودي الحادث على طول المحور البصري للرقاقة. في موقف OFF يتم توجيه شعاع الحادث 48 ° محور قبالة. يتم توجيه الضوء الذي يضرب رقيقة الفجوات بين المرايا 24 درجة قبالة المحور. (عرض أعلى) الميل يتجه 45 درجة فيما يتعلق الجانبين من المرايا ورقاقة.
الشكل 2. التخطيط الأساسي للالمجهر الفلورسنت الحديثة. يتم وضع المكعب التصفية في "الفضاء اللانهاية" بين الهدف والعدسة الأنبوب. هناك مسار التصوير الذي يؤدي الى الكاميرا ، وهناك مسار الإضاءة التي تجمع الضوء على العينة. العدسة أنبوب لهذه الطريق ضوء هما عادة مختلفة في التصميم والبعد البؤري. الإضاءة ، ولكن ليس في التصوير ، وهو مصمم لتشغيل أنبوب العدسة في طيف الأشعة فوق البنفسجية.
الشكل 3. الأشعة فوق البنفسجية لنظام تخطيط يستند DMD. إذا كانت الإضاءة في الطيف للأشعة فوق البنفسجية ، ثم يجب أن يقدم من خلال عدسة الأنبوب الذي يتم تصحيح للأشعة فوق البنفسجية. لم يتم تصميم العدسة في مسار أنبوب التصوير للأشعة فوق البنفسجية. هناك حاجة إلى نظام الترحيل إلى خلق صورة المتقارن يمكن الوصول إليها بسهولة الطائرة. يتم وضع علامة على صورة مختلفة المتقارن طائرات في المجهر من قبل الخطوط الحمراء المنقطة. ومن المتوقع أن أنماط مشرق في صورة واحدة في الطائرة المتقارن طائرات أخرى. أثناء التصوير من المتوقع أن النمط السائد في الطائرة على عينة كاشف / الكاميرا. لإنارة يتوقع أن نمط إنشاؤها بواسطة DMD على العينة.
الشكل 4. التخطيط لإسقاط نظام الضوء المرئي DMD. إذا كانت الإضاءة الخفيفة هي في حدود واضحة ، فمن الممكن لجعل نائب العضو المنتدب للنمط ضوء تولد عن طريق التصوير مسار الضوء. ويمكن تنفيذها بسهولة مع هذا commerciشركة ميناء الكاميرا المزدوجة والتجهيزات المناسبة المرآة مزدوج اللون.
الشكل 5. القرار الجانبي للنظام. (أ) القرار الضوئية على الهدف هو الفلورسنت ~ 2 ميكرون. (ب) القرار الفعال مقاسا من التحلل الضوئي الغلوتامات قفص عبر تغصن هو ~ 5 ميكرون. المسافة زادت بسبب وجود مزيج من نشر الغلوتامات وعرض محدود للتغصن. (ج) يمكن التحلل الضوئي حركية تحاكي الأحداث متشابك. فرضت عائلة الجهد الاستجابات الحالية يرجع إلى الاختلافات في الطاقة الضوئية تسليمها إلى تغصن.
الشكل 6 : عدم الجمع بين خطي نقطة فرع شجيري. (أ) يتم تطبيق المدخلات الموزعة إلى فرعين شجيري بشكل منفصل. وترد ردودها الجهد منهما أدناه. (B) ثم يتم إعطاء محفزات في الوقت نفسه. استجابة قياس (أحمر التتبع) مختلفة من مجموع العمليات الحسابية من الاستجابات الفردية two (رمادي التتبع).
الشكل 7. Supralinear هو الجمع NMDA مستقبلات التابعة. (A) APV ، ومستقبلات NMDA انتقائية خصم بحظر الجمع supralinear. (ب) يتم رسم العلاقة شدة حساسيتها والتحفيز لمستقبلات NMDA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميزة DMD نهج ضوئي يستند على ما يبدو لمعظم الحالات التي يكون فيها الهدف وتحتل مساحة واسعة نسبيا. إذا كان الهدف من الفائدة صغيرة جدا ، مثل العمود الفقري شجيري قليلة ، وأنظمة المسح المتسلسل مبائر و 2 الفوتون ومن المحتمل أن يكون النهج الأفضل. إحدى نقاط ضعف كبيرة في نهج DMD هو استخدام غير فعالة من الضوء المتاح. يتم توجيه الجزء الأكبر بالضرورة من الضوء المتاح للخارج المرايا وعدم استخدامها.
هو الانسب للنظام DMD استنادا للعمل في نطاق مرئية. نتوقع DMD نظم ضوئي يستند سيجعل تأثير كبير عندما يعملون مع التجارب optogenetics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة من RO1 والمراجعات تقدير من دائرة البحوث VA - إلى C. طن متري ، وNRSA الفردية إلى CWL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modern upright fluorescent microscope | |||
| CCD camera and image acquisition software | |||
| Computer and data acquisition/interface system | |||
| DLP Discovery Developer Kit | |||
| ALP3 USB interface | |||
| S2 + Optics w/LED | |||
| Dual camera port unit | |||
| 355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W) | DPSS Laser Inc. | ||
| Laser shutter Model LS6 | Uniblitz | ||
| Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915 | Canadian Instrument and Research, Ltd | 100 um core multimode fiber | |
| Multimode Fiber launcher | Oz Optics | ||
| Signal generator | up to 50 kHz | ||
| Beam collimator | Olympus Corporation | DApo20UV340 | |
| UV relay lens | Special Optics | #: 54-25-60-355 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Tang, C. Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery. Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).
- Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated. Nature. 456, 826-827 (2008).
- Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V.
- Hornbeck, L. J. Digital Light Processing and MEMs: An overview. , Texas Instrument White Papers. Forthcoming.
Tags
الهندسة الحيوية ، العدد 49 ، DMD ، التحلل الضوئي ، تغصن ، ضوئي ، DLP ، optogeneticsErratum
Formal Correction: Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points
Posted by JoVE Editors on 03/24/2011.
Citeable Link.
A correction was made to Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. There was an error with an author's name. The author's middle name had a typo, this corrected to:
M. Daniel Santos
instead of:
M. Danial Santos.
