Fotostimolazione modellato con i dispositivi digitali Micromirror per Indagare integrazione dendritiche Attraverso punti di ramificazione

Summary

Dispositivi digitali micromirror (DMD) in grado di generare modelli complessi nel tempo e nello spazio con cui controllare l'eccitabilità neuronale. Questioni rilevanti per la progettazione, costruzione e funzionamento dei sistemi di DMD sono discussi. Tale sistema ha permesso la dimostrazione di non-lineare integrazione tra distale punti di ramificazione dendritica.

Protocol

Considerazioni generali di progettazione

Se la lunghezza d'onda di stimolazione foto è nel campo del visibile, come per gli esperimenti optogenetic, il layout del sistema sarà notevolmente più semplice per gli esperimenti di fotolisi UV. Basta acquistare un doppio modulo porta macchina fotografica che è disponibile presso tutte le aziende microscopio. L'aereo DMD può essere posizionato sul piano dell'immagine sia coniugato di una delle due porte della fotocamera. Ma nella fotolisi UV la luce che proviene dalla DMD devono essere portati attraverso l'epi-illuminazione del percorso (fig. 3A), perché la lente del tubo che porta l'imaging per la fotocamera non è corretto per lunghezza d'onda UV in uno qualsiasi dei microscopi in commercio. L'aberrazione sferica della lente tubo di imaging a 350 nm è abbastanza grave da impedire la possibilità di concentrare la luce in un punto stretto e di generare sufficiente risoluzione spaziale. Questo problema non si riscontra in microscopia confocale perché la lente del tubo viene rimosso quando un raggio laser collimato viene portato in lungo lo stesso asse ottico. Il problema di illuminazione UV può essere risolto da portare alla luce attraverso l'epi-fluorescenza percorso perché le lenti del tubo ci sono tutti parzialmente corretto per l'aberrazione sferica alla lunghezza d'onda UV. Siamo in grado di espandere l'ottica dei microscopi a qualsiasi grado i desideri rivista. La comunità scientifica è in generale interessato veloce in questo argomento e non ci sono molte fonti che insegna bene.

Al fine di minimizzare le modifiche del microscopio ed a causa di vincoli di spazio stretto in epi-fluorescenza unità, il DMD è posto a un aereo di nuova creazione immagine coniugato creata da una lente relé (indicare la posizione dell'unità DMD in relazione alle microscopio). Un UV commerciale corretto lente relè è stato acquistato (Ottica Specialità) (punto nel diagramma e sul microscopio).

L'illuminazione del DMD

Dopo aver ricevuto il suo input binario uno microspecchio può passare da uno positivo e uno negativo 12 ° di inclinazione rispetto al piano del chip. L'asse di rotazione si trova lungo la diagonale gli angoli di ogni specchio (45 ° rispetto ai lati del chip). L'orientamento della rotazione dello specchio è designato da un triangolo color oro in un angolo sulla superficie anteriore del chip. L'angolo di inclinazione dei microspecchi dettami l'allineamento del campo e azithmus del fascio di luce in entrata. Il passo del raggio di illuminazione deve essere di 24 ° rispetto all'asse perpendicolare del chip DMD e azithmus deve essere perpendicolare all'asse di rotazione dello specchio. Allineamento del fascio preciso è fondamentale per il funzionamento efficiente. Nel sistema prototipo abbiamo progettato diverse regolazioni di inclinazione manuale che ci ha permesso di correggere le carenze di progettazione e lavorazione. Il risultato è un sistema che è molto più ingombrante di quanto sia necessario. Alternato, soluzione più compatta per portare alla luce è possibile (mostra di design alternativo se ritenuto utile).

Per gli esperimenti fotolisi una sorgente laser è necessaria per generare l'alta intensità del fascio di luce concentrata necessari per uncaging rapida. Per gli esperimenti optogenetic dove la luce ad alta intensità nettamente focalizzata non è richiesto, un non-coerente, sorgente di luce sarebbero adeguati. Nell'esperimento fotolisi descritto qui abbiamo impiegato un quasi-continua pompato a diodi a stato solido (DPSS) frequenza triplicata NdVO4 laser (1 W, 355 nm). (Per una discussione dettagliata delle scelte delle fonti di luce per la fotolisi vedi riferimento 2). Un laser di potenza relativamente alta è necessaria nel esperimenti descritti qui perché solo una piccola frazione della potenza laser viene effettivamente consegnato al campione quando si utilizza un sistema di DMD. La quantità di luce consegnato al campione è proporzionale al rapporto tra il numero di ON / OFF specchi all'interno della regione illuminata dal fascio laser.

Se una sorgente di luce laser è richiesto, è meglio per lanciare l'uscita del laser in una fibra multimodale in modo che possa essere facilmente posizione e orientato lungo l'asse corretto per l'illuminazione della DMD. La trasmissione della luce attraverso la fibra ottica risolve un secondo problema, come eliminare l'speckle pattern inerenti all'illuminazione coerente. La fibra è avvolto attorno ad una barella fibra piezoelettrico (modello 915, Strumentazione canadese e Ricerca, Ltd) che oscilla a ~ 40 kHz. (Punto in tal senso nel rig) Il microscopico allungamento della fibra è sufficiente per spostare il speckle modello molte volte durante la durata millisecondi di ogni impulso stimolazione foto, così eliminando efficacemente l'effetto di screziature. L'uscita della fibra ottica è poi collimato con un obiettivo microscopio UV (Olympus DApo20UV). (Notare questo) Una calibrazione della risoluzione ottica del sistema è mostrato in fig. 3B. La risoluzione effettiva fisiologica misurata dalla ampiezza del flusso di corrente in funzione della posizione del punto di fotostimolazione è mostrato in fig. 3C. Attuali risposte fotostimolazione di diversa intensità sono illustrati nella fig. 3D.

Funzionamento del sistema:

Co-registrazione del pixel del CCD con gli specchi DMD

Un in-house software è stato scritto che determina la corrispondenza dei singoli specchi DMD ai pixel specifiche della macchina fotografica di immagini CCD. L'interfaccia utente grafica (GUI) all'interno di questo software permette poi all'utente di assegnare gli specchi DMD che corrisponde alla regione l'immagine CCD tag con il mouse. Così, il luogo per la stimolazione foto può essere etichettato semplicemente spostando il cursore sopra l'immagine visualizzata sullo schermo del computer e cliccando la regione tag di interesse. (Una immagine fluorescente di un dendritiche pergolato sarà visualizzato sullo schermo del computer. Student segnerà un certo numero di posizioni sopra l'immagine sullo schermo del computer.)

Programmazione dei modelli per la consegna della luce

Il modello segnato sullo schermo del computer da parte dell'operatore è memorizzato come una serie di immagini separate. La tempistica degli impulsi laser per ogni modello spaziale è poi programmato il software che si integra con il programma di acquisizione dati (pClamp). (Lo dimostrano).

Coordinare gli impulsi laser per i modelli di DMD

Il programma di acquisizione dati avvia e coordina i tempi dell'elettronica DMD, il gating del laser, e l'acquisizione della patch bloccato segnale elettrico dal neurone bersaglio. (Simulare questa sequenza sul computer)

I dati sperimentali:

Non lineare sommatoria tra distale punti di ramificazione dendritica

Integrazione dendritiche con elettrodi è stata tradizionalmente eseguite variando l'ampiezza di stimolazione in luoghi distinti, piuttosto che ampliare l'area di stimolazione pur mantenendo una intensità costante. Le questioni relative alla saturazione dei elettrogenesi e il reclutamento di canali posizione dipendente può influenzare il risultato e la conclusione. Distribuito stimolazione dendritiche possono essere facilmente implementata utilizzando un sistema basato DMD (Fig. 4A). Intensità di input è stato variato aumentando il numero di macchie di fotostimolazione. Possiamo vedere che la sommatoria spaziale può essere non lineare attraverso punti di ramificazione sempre più sovra-lineare con ampiezze di input che arrivano sempre più sui due rami figlia. Il sovra-linearità è in gran parte mediata recettori NMDA e non alla tensione di canali gated (Fig. 5)

Rappresentante Risultati

Figura 1. Funzionamento dei microspecchi nella DMD. (Vista laterale) forze elettrostatiche dirette a singoli specchi causa allo specchio per essere inclinato in una delle due possibili orientazioni 12 ° rispetto al piano orizzontale. In posizione ON un fascio incidente è diretto lungo l'asse ottico perpendicolare del chip. In posizione OFF il fascio incidente è diretto fuori asse 48 °. Luce che colpisce il divario sottile tra gli specchi è diretto 24 ° fuori asse. (Vista dall'alto), l'inclinazione è orientata a 45 ° rispetto ai lati degli specchi e di chip.

Figura 2. Layout di base del microscopio a fluorescenza moderna. Il cubo filtro è posizionato nel "spazio infinito" tra l'obiettivo e la lente del tubo. C'è un percorso di immagini che conduce alla fotocamera e vi è un percorso di illuminazione che porta la luce al campione. La lente del tubo per il percorso di questi due leggeri sono tipicamente differenti nel design e nella lunghezza focale. L'illuminazione, ma non l'immagine, lente del tubo è progettato per il funzionamento nello spettro UV.

Figura 3. Layout per UV sistema basato DMD. Se l'illuminazione è nello spettro UV, allora deve essere portato attraverso la lente del tubo che è stato corretto per UV. La lente del tubo nel percorso di imaging non è progettato per UV. Un sistema di relè è necessario per creare un facile accesso piano dell'immagine coniugato. I diversi piani di coniugare immagine nel microscopio è caratterizzata da linee tratteggiate rosse. Modelli luminosi in un unico piano dell'immagine vengono proiettate su piani coniugato altri. Durante l'imaging lo schema del piano di campionamento è proiettata sul sensore / fotocamera. Per l'illuminazione del modello generato dalla DMD è proiettata sul campione.

Figura 4. Layout per la luce visibile sistema di proiezione DMD. Se la luce illuminazione è nel campo del visibile, è possibile portare il modello DMD luce generata attraverso il percorso della luce di imaging. Questo può essere facilmente implementato con commerciAl doppia fotocamera allegati porta e lo specchio dicroico appropriato.

Figura 5. Risoluzione laterale del sistema. (A) Risoluzione ottica sul target fluorescente è ~ 2 micron. (B) La risoluzione effettiva, misurata dalla fotolisi di glutammato ingabbiato in una dendrite è ~ 5 micron. La distanza è aumentata a causa di una combinazione di diffusione di glutammato e la larghezza finita della dendrite. (C) Fotolisi in grado di simulare la cinetica di eventi sinaptici. La famiglia di tensione bloccato attuali risposte è dovuto alle variazioni di energia luminosa consegnato al dendrite.

Figura 6. Sommatoria non lineare attraverso punti di ramificazione dendritica. (A) gli ingressi distribuiti sono applicati a due rami dendritici separatamente. Le loro risposte rispettivi tensione sono riportati di seguito. (B) Gli stimoli vengono poi somministrati contemporaneamente. La risposta misurata (traccia rossa) è diversa dalla somma aritmetica delle due risposte individuali (grigio traccia).

Sommatoria figura 7. Sopralineare è recettore NMDA dipendente. (A) APV, un antagonista selettivo del recettore NMDA blocca la sommatoria sopralineare. (B) Il rapporto intensità dello stimolo e la sua sensibilità di antagonista del recettore NMDA è tracciata.

Discussion

Il vantaggio di DMD approccio basato fotostimolazione è più evidente nelle situazioni in cui il target occupa un'area relativamente grande. Se il bersaglio di interesse è molto piccolo, come un paio di spine dendritiche, sistemi di scansione sequenziale confocale e 2-fotoni possono essere l'approccio migliore. Un punto debole significativo dell'approccio DMD è il suo uso inefficiente della luce disponibile. La maggior parte della luce disponibile è necessariamente rivolta al specchi OFF e non utilizzati.

Il sistema basato DMD è più adatto per il funzionamento nel campo del visibile. Anticipiamo DMD sistemi fotostimolazione base avrà un impatto significativo quando impiegato con esperimenti optogenetics.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modern upright fluorescent microscope
CCD camera and image acquisition software
Computer and data acquisition/interface system
DLP Discovery Developer Kit
ALP3 USB interface
S2 + Optics w/LED
Dual camera port unit
355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)	DPSS Laser Inc.
Laser shutter Model LS6	Uniblitz
Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915	Canadian Instrument and Research, Ltd		100 um core multimode fiber
Multimode Fiber launcher	Oz Optics
Signal generator			up to 50 kHz
Beam collimator	Olympus Corporation	DApo20UV340
UV relay lens	Special Optics	#: 54-25-60-355