Nouvel essai de plongée de réservoir : une méthode pour étudier des réponses innées de stress dans zebrafish

Overview

L’article décrit une méthode comportementale pour évaluer le stress chez le poisson zèbre. En réponse au stress, le poisson zèbre a tendance à nager au fond d’un réservoir jusqu’à ce que le stress soit éliminé. Le protocole de l’échantillon décrit la méthode stepwise pour effectuer l’analyse.

Protocol

1. Configuration originale d’essai de réservoir

1. Préparez un bécher de 250 mL prére rempli d’eau du système de pêche et d’au moins deux réservoirs de retenue.
2. Le matin de l’essai, transférez au moins 10 poissons zèbres adultes d’essai à utiliser pour chaque condition expérimentale (témoins et adultes expérimentaux) de l’installation piscifique dans un réservoir de détention, transférez-les dans la salle de comportement et permettez-leur de s’acclimater pendant au moins une heure.
   REMARQUE: Une analyse de puissance doit être effectuée avant l’expérimentation, mais dans nos mains, un n = 10 est généralement suffisant pour détecter la signification statistique. De plus, le réservoir de détention ne doit pas contenir plus de cinq individus par litre d’eau. Une acclimation d’une heure suffit car il a été démontré que les adultes du poisson zèbre s’habituent dans les 30 minutes qui suit un nouveau réservoir. En outre, les rythmes comportementaux sont affectés par les processus circadiens, et donc des répliques expérimentales effectuées sur différents jours doivent être effectuées dans les mêmes heures. Nous effectuons généralement toutes les expériences entre 11h00 et 18h00.
3. Étiquetez les réservoirs de telle sorte que l’état ou le génotype des animaux est aveugle à l’expérimentateur.
   REMARQUE: Les expériences peuvent facilement être aveuglées par l’expérimentateur en étiquetant les réservoirs à l’aide d’un système de lettres ou de nombres (c.-à-d. qu’un réservoir est étiqueté « A », un autre « B », etc.). Une partie qui n’est pas impliquée dans les expériences étiquette les réservoirs avec un tel système, et masque les identités de l’expérimentateur jusqu’à ce qu’après la post-analyse soit terminée.
4. À l’aide d’un filet, placer délicatement un seul adulte dans le bécher prére rempli à partir de l’étape 1.1. Laisser les poissons adultes s’acclimater au bécher pendant 10 minutes.
   REMARQUE: Enregistrez le sexe de l’adulte, car il pourrait être important après l’analyse de rechercher des différences spécifiques au sexe.
5. Après l’acclimation dans le bécher, introduire le poisson dans le nouveau réservoir (mettre en place des détails ci-dessous) en versant doucement l’eau et l’adulte du bécher.
   REMARQUE: Les étapes de cette section décrivent la mise en place du nouvel essai de réservoir. Un diagramme du produit final est donné à la figure 1B.
   1. Placez le nouveau réservoir au milieu de la table.
   2. Placez les lumières infrarouges derrière le réservoir et placez la feuille acrylique blanche ou l’écran diffuseur entre le réservoir et la source de lumière LED.
   3. Placez le diffuseur de façon à ce qu’il diffuse au maximum la lumière provenant des LED, et l’intensité de la lumière est suffisante pour éclairer le nouveau réservoir. Plus la planche est proche de la source lumineuse, plus les lumières seront lumineuses, mais moins elle se diffusera. En revanche, placer le tableau de diffusion loin de la source lumineuse réduira l’intensité lumineuse, mais répandra mieux la lumière.
   4. Remplissez environ les trois quarts du nouveau réservoir d’eau du système de poissons.
      REMARQUE: L’eau du système est générée à l’aide de l’osmose inverse de l’eau du robinet, suivie d’un dosage tel que la conductivité équivaut à 900 ± 100 μS, que le pH est neutre (7,2) et que la température est de 27 ± 1 °C.
   5. Fixez la caméra au support de la caméra et connectez la caméra à l’ordinateur. Ouvrez le logiciel d’acquisition vidéo et ajustez la caméra pour faire face à l’avant du réservoir et assurez-vous que tout le nouveau réservoir peut être vu et qu’il n’y a pas de zones masquées dans la vidéo. Réglez le réservoir et les lumières infrarouges de telle sorte qu’il y ait suffisamment et même d’éclairage dans tout le réservoir lorsqu’il est observé à travers la caméra.
      REMARQUE: Avant de passer à des expériences, il peut souvent être utile d’effectuer un essai, dans lequel la vidéo d’un poisson est capturée et le suivi est effectué. Cela permettra de s’assurer que la configuration est suffisante pour l’expérimentation du comportement.
6. Après avoir introduit l’adulte dans le nouveau réservoir, commencer l’enregistrement de la caméra, et s’éloigner de la configuration pour éviter une détresse supplémentaire pour le poisson.
7. Une fois l’enregistrement terminé, retirez l’individu du nouveau réservoir et placez-le dans un nouveau réservoir de détention.
   REMARQUE: Un réservoir de détention différent de celui de l’étape 1.2 devrait être utilisé pour empêcher les essais répétés sur les mêmes personnes.

Representative Results

Figure 1. Diagramme de la nouvelle configuration du réservoir. (A) Dimensions du réservoir de 1,8 L trapézoïdal roman vu du côté d’enregistrement du réservoir. (B) Diagramme de la configuration, y compris les positions des lumières infrarouges, caméra, et les barrières utilisées pour minimiser les interférences humaines.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology