Novo ensaio de mergulho de tanque: um método para estudar respostas inatas de estresse em zebrafish

Overview

O artigo descreve um método comportamental para avaliar o estresse em zebrafish. Em resposta ao estresse, o zebrafish tende a nadar no fundo de um tanque até que o estresse seja removido. O protocolo de amostra descreve o método stepwise para a realização do ensaio.

Protocol

1. Configuração do teste do tanque novo

1. Prepare um béquer de 250 mL pré-preenchido com água do sistema de peixes, e pelo menos dois tanques de retenção.
2. Na manhã do teste, transfira pelo menos 10 zebrafish adultos para serem usados para cada condição experimental (controles e adultos experimentais) de instalações de peixes para um tanque de retenção, transfira-os para a sala de comportamento e permita que eles se aclimatem por pelo menos uma hora.
   NOTA: Uma análise de energia deve ser realizada antes da experimentação, mas em nossas mãos, um n = 10 é geralmente suficiente para detectar significância estatística. Além disso, o tanque de retenção não deve conter mais de cinco indivíduos por litro de água. Uma aclimatação de uma hora é suficiente, pois os adultos de zebrafish têm sido mostrados habituando dentro de 30 minutos de um novo tanque. Além disso, os ritmos comportamentais são afetados por processos circadianos e, portanto, as réplicas experimentais feitas em dias diferentes devem ser realizadas nas mesmas horas. Normalmente realizamos todos os experimentos entre as 11:00 e as 18:00.
3. Rotule os tanques de tal forma que a condição ou genótipo dos animais seja cego para o experimentador.
   NOTA: Os experimentos podem ser facilmente cegos para o experimentador rotulando tanques usando um sistema de letras ou números (ou seja, um tanque é rotulado como 'A', outro 'B', etc.). Uma parte não envolvida nos experimentos rotula os tanques com tal sistema, e mascara as identidades do experimentador até que a pós-análise seja concluída.
4. Usando uma rede, coloque suavemente um único adulto no béquer pré-preenchido a partir do passo 1.1. Deixe o peixe adulto se aclimatar no béquer por 10 minutos.
   NOTA: Regisso o sexo do adulto, pois pode ser importante após a análise procurar diferenças específicas para o sexo.
5. Após a aclimatação no béquer, introduza o peixe no novo tanque (configure detalhes abaixo) derramando suavemente a água e o adulto do béquer.
   NOTA: Os passos nesta seção descrevem a configuração do novo ensaio do tanque. Um diagrama do produto final é dado na Figura 1B.
   1. Coloque o tanque novo no meio da mesa.
   2. Posicione as luzes infravermelhas atrás do tanque e coloque a folha de acrílico branco ou a tela do difusor entre o tanque e a fonte de luz LED.
   3. Coloque o difusor para que ele espalhe ao máximo a luz proveniente dos LEDs, e a intensidade da luz é suficiente para iluminar o novo tanque. Quanto mais perto a placa estiver da fonte de luz, mais brilhantes serão as luzes, mas menos ela irá difundir. Em contrapartida, colocar a placa do difusor longe da fonte de luz reduzirá a intensidade da luz, mas espalhará melhor a luz.
   4. Encha aproximadamente três quartos do novo tanque com água do sistema de peixes.
      NOTA: A água do sistema é gerada utilizando osmose reversa da água da torneira, seguida pela dosagem de tal forma que a condutividade equivale a 900 ± 100 μS, que o pH é neutro (7.2), e que a temperatura é de 27 ± 1 °C.
   5. Conecte a câmera ao suporte da câmera e conecte a câmera ao computador. Abra o software de aquisição de vídeo e ajuste a câmera para ficar de frente para a frente do tanque e garantir que todo o novo tanque possa ser visto e que não haja áreas obscurecidas no vídeo. Ajuste o tanque e as luzes infravermelhas de modo que haja iluminação suficiente e uniforme em todo o tanque quando observado através da câmera.
      NOTA: Antes de prosseguir para experimentos, muitas vezes pode ser útil para realizar um teste, no qual o vídeo de um peixe é capturado e o rastreamento é realizado. Isso garantirá que a configuração seja suficiente para experimentação de comportamento.
6. Depois de introduzir o adulto no novo tanque, inicie a gravação da câmera e afaste-se da configuração para evitar sofrimento adicional aos peixes.
7. Após o término da gravação, remova o indivíduo do tanque da novela e coloque em um novo tanque de retenção.
   NOTA: Um tanque de retenção diferente do da etapa 1.2 deve ser usado para evitar testes repetidos nos mesmos indivíduos.

Representative Results

Figura 1. Diagrama da nova configuração do tanque. (A) Dimensões do tanque trapezoidal 1.8 L, como visto do lado de gravação do tanque. (B) Diagrama da configuração incluindo posições das luzes infravermelhas, câmera e barreiras usadas para minimizar a interferência humana.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology