Nuovo saggio di immersione in vasca: un metodo per studiare le risposte allo stress innate in Zebrafish

Overview

L'articolo descrive un metodo comportamentale per valutare lo stress nel pesce zebra. In risposta allo stress, il pesce zebra tende a nuotare sul fondo di un serbatoio fino a quando lo stress non viene rimosso. Il protocollo di esempio descrive il metodo stepwise per l'esecuzione del test.

Protocol

1. Nuova configurazione del test del serbatoio

1. Preparare un becher da 250 mL preriempito con acqua del sistema ittico e almeno due serbatoi di detenzione.
2. La mattina del test, trasferire almeno 10 zebrafish adulti di prova da utilizzare per ogni condizione sperimentale (controlli e adulti sperimentali) da un impianto di pesce in un serbatoio di detenzione, trasferirli nella sala di comportamento e consentire loro di acclimatarsi per almeno un'ora.
   NOTA: Un'analisi della potenza dovrebbe essere eseguita prima della sperimentazione, ma nelle nostre mani, un n = 10 è di solito sufficiente per rilevare la significatività statistica. Inoltre, il serbatoio di contenimento dovrebbe contenere non più di cinque individui per litro d'acqua. Un'acclimatazione di un'ora è sufficiente in quanto agli adulti zebrafish è stato dimostrato di abituarsi entro 30 minuti da un nuovo serbatoio. Inoltre, i ritmi comportamentali sono influenzati dai processi circadiani, e quindi le repliche sperimentali eseguite in giorni diversi dovrebbero essere eseguite entro le stesse ore. In genere eseguiamo tutti gli esperimenti tra le 11:00 e le 18:00.
3. Etichettare i serbatoi in modo tale che la condizione o il genotipo degli animali sia cieco allo sperimentatore.
   NOTA: Gli esperimenti possono essere facilmente accecati allo sperimentatore etichettando i serbatoi utilizzando un sistema di lettere o numeri (cioè, un serbatoio è etichettato come "A", un altro "B", ecc.). Una parte non coinvolta negli esperimenti etichetta i serbatoi con un tale sistema e maschera le identità dello sperimentatore fino al completamento della post-analisi.
4. Usando una rete, posizionare delicatamente un singolo adulto nel becher precompilati dal passaggio 1.1. Lasciare che il pesce adulto si acclimati nel becher per 10 minuti.
   NOTA: Registra il sesso dell'adulto, in quanto potrebbe essere importante dopo l'analisi cercare differenze specifiche del sesso.
5. Dopo l'acclimatazione nel becher, introdurre il pesce nel nuovo serbatoio (impostare i dettagli di seguito) versando delicatamente l'acqua e l'adulto dal becher.
   NOTA: I passaggi di questa sezione descrivono l'impostazione del saggio del nuovo serbatoio. Un diagramma del prodotto finale è fornito nella figura 1B.
   1. Posizionare il nuovo serbatoio al centro del tavolo.
   2. Posizionare le luci a infrarossi dietro il serbatoio e posizionare il foglio acrilico bianco o lo schermo del diffusore tra il serbatoio e la sorgente luminosa a LED.
   3. Posizionare il diffusore in modo che diffonda al massimo la luce proveniente dai LED e l'intensità della luce sia sufficiente per illuminare il nuovo serbatoio. Più la tavola è vicina alla sorgente luminosa, più luminose saranno le luci, ma meno si diffonderà. Al contrario, posizionare la scheda del diffusore lontano dalla sorgente luminosa ridurrà l'intensità della luce, ma diffonderà meglio la luce.
   4. Riempire circa tre quarti del nuovo serbatoio con acqua del sistema ittico.
      NOTA: L'acqua di sistema viene generata utilizzando l'osmosi inversa dell'acqua del rubinetto, seguita da un dosamento tale che la conduttività è uguale a 900 ± 100 μS, che il pH è neutro (7,2) e che la temperatura è di 27 ± 1 °C.
   5. Collegare la fotocamera al supporto della fotocamera e collegare la fotocamera al computer. Apri il software di acquisizione video e regola la fotocamera per affrontare la parte anteriore del serbatoio e assicurati che l'intero nuovo serbatoio possa essere visto e che non ci siano aree oscurate nel video. Regolare il serbatoio e le luci a infrarossi in modo che vi sia sufficiente e uniforme illuminazione in tutto il serbatoio quando osservato attraverso la fotocamera.
      NOTA: Prima di procedere agli esperimenti, può spesso essere utile eseguire una prova, in cui il video di un pesce viene catturato e viene eseguito il tracciamento. Ciò garantirà che la configurazione sia sufficiente per la sperimentazione del comportamento.
6. Dopo aver introdotto l'adulto nel nuovo serbatoio, avviare la registrazione della fotocamera e allontanarsi dalla configurazione per evitare ulteriori disagi al pesce.
7. Al termine della registrazione, rimuovere l'individuo dal nuovo serbatoio e posizionarsi in un nuovo serbatoio di tenuta.
   NOTA: Un serbatoio di tenuta diverso da quello del passaggio 1.2 deve essere utilizzato per evitare ripetuti test sugli stessi individui.

Representative Results

Figura 1. Diagramma della nuova configurazione del serbatoio. (A) Dimensioni del serbatoio del romanzo trapezoidale da 1,8 L viste dal lato di registrazione del serbatoio. (B) Diagramma della configurazione, incluse le posizioni delle luci a infrarossi, della telecamera e delle barriere utilizzate per ridurre al minimo le interferenze umane.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology