Overview
この記事では、ゼブラフィッシュのストレスを評価する行動方法について説明します。ストレスに応じて、ゼブラフィッシュはストレスが取り除かれるまでタンクの底で泳ぐ傾向があります。サンプルプロトコルは、アッセイを実行するためのステップワイズ法を説明する。
Protocol
1. 新規タンクテストのセットアップ
- 魚のシステムの水で事前に満たされた250 mLビーカーと、少なくとも2つの保持タンクを準備します。
- 試験の朝、各実験条件(コントロールと実験成人)に使用される少なくとも10個の試験用成体ゼブラフィッシュを魚の施設から保持タンクに移し、行動室に移し、少なくとも1時間順応できるようにします。
注: パワー分析は実験前に実行する必要がありますが、私たちの手では、n = 10は通常、統計的有意性を検出するのに十分です。さらに、保持タンクは、水のリットル当たり5個以下を含む必要があります。ゼブラフィッシュの成人は新しいタンクから30分以内に習慣化することが示されているので、1時間の順応で十分です。また、行動リズムは概日プロセスの影響を受けるため、異なる日に行われる実験的複製は同じ時間内に行われるべきである。通常、11:00 から午後 6:00 までの間に、すべての実験を行います。 - 動物の状態や遺伝子型が実験者に盲目になるようにタンクにラベルを付けます。
注: 実験は、文字または数字システムを使用してタンクにラベルを付ける(すなわち、1つのタンクが'A'、別の「B」など)を使用して実験者に簡単に盲目にすることができます。実験に関与していない当事者は、このようなシステムでタンクにラベルを付け、分析後の完了後まで実験者から身元をマスクします。 - ネットを使用して、ステップ1.1から事前に充填されたビーカーに1人の大人をそっと置きます。大人の魚がビーカーで10分間順応できるようにします。
注: 性特有の違いを探すために重要な事後分析かもしれないので、大人の性別を記録します。 - ビーカーで順応した後、ビーカーから水と大人をそっと注いで、新しいタンクに魚を導入します(詳細は以下に設定してください)。
注: このセクションの手順では、新規タンクアッセイの設定について説明します。最終的な製品の図は図 1Bに示されています。- テーブルの中央に新しいタンクを置きます。
- タンクの後ろに赤外線ライトを設置し、白いアクリルシートまたはディフューザースクリーンをタンクとLED光源の間に配置します。
- LEDからの光を最大限に広げ、光の強度が新しいタンクを照らすのに十分なようにディフューザーを配置します。ボードが光源に近いほど、ライトは明るくなりますが、拡散は少なくなります。対照的に、ディフューザーボードを光源から離すと、光の強度は低下しますが、光をより良く広げます。
- 新しいタンクの約4分の3を魚のシステム水で満たします。
注: 水道水の逆浸透を用いて水を生成し、その後、導電率が900±100μSに等しく、pHが中性(7.2)、温度が27±1°Cになるように投射する。 - カメラをカメラスタンドに取り付け、カメラをコンピュータに接続します。ビデオ取得ソフトウェアを開き、タンクの前面に向くようにカメラを調整し、新しいタンク全体が見えるようにし、ビデオに隠された領域がないことを確認します。カメラを通して観察されたときタンク全体で十分な、さらには照明があるようなタンクと赤外線ライトを調整します。
注: 実験に進む前に、魚のビデオをキャプチャして追跡を行う試運転を行うことがしばしば役立ちます。これにより、セットアップで動作を実験するのに十分な状態が保証されます。
- 新しいタンクに大人を導入した後、カメラの記録を開始し、魚への追加の苦痛を防ぐためにセットアップから離れて移動します。
- 録音が終了したら、新しいタンクから個人を取り出し、新しい保持タンクに入れます。
注: ステップ1.2のものとは別の保持タンクは、同じ個人で繰り返しテストを防ぐために使用する必要があります。
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Representative Results
図 1.新しいタンクのセットアップの図。(A)タンクの記録側から見た1.8 L台形の新型タンクの寸法。(B) 人間の干渉を最小限に抑えるために使用される赤外線ライト、カメラ、バリアの位置を含む設定の図。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Camera | We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics. | ||
| Infrared filter | Edmund Optics | ||
| Video Acquisition Program | Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set. | ||
| Infrared LED lights | |||
| Assay tank | Aquaneering | Part number ZT180 | Size: M3 1.8 liter |
| Stand and clamp, or standard tripod for camera | |||
| 250mL beaker | |||
| Tracking software | We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology |
