Ny tankdykningsanalys: En metod för att studera medfödda stressreaktioner hos zebrafisk

Overview

Artikeln beskriver en beteendemetod för att bedöma stress hos zebrafisk. Som svar på stress tenderar zebrafisk att simma längst ner i en tank tills stressen avlägsnas. Exempelprotokollet beskriver stegvis metod för att utföra analysen.

Protocol

1. Ny tanktestinställning

1. Förbered en 250 ml bägare förfylld med fisksystemvatten och minst två avloppstankar.
2. På testmorgonen överför du minst 10 test vuxna zebrafiskar som ska användas för varje experimentellt tillstånd (kontroller och experimentella vuxna) från fiskanläggningen till en anläggningstank, överför dem till beteenderummet och låter dem acklimatisera sig i minst en timme.
   OBS: En effektanalys bör utföras före experiment, men i våra händer är en n = 10 vanligtvis tillräcklig för att upptäcka statistisk signifikans. Dessutom börhållningstanken innehålla högst fem personer per liter vatten. En acklimatisering på en timme är tillräcklig eftersom zebrafisk vuxna har visat sig vana inom 30 minuter efter en ny tank. Beteenderytmer påverkas också av dygnsrytmprocesser, och därmed bör experimentella replikat som görs på olika dagar utföras inom samma timmar. Vi utför vanligtvis alla experiment mellan kl. 11.00 och 18.00.
3. Märk tankarna så att djurens tillstånd eller genotyp är blind för försöksdjuret.
   OBS: Experiment kan lätt förblindas för experimenteraren genom att märka tankar med hjälp av ett bokstavs- eller nummersystem (dvs. en tank är märkt "A", ett annat "B" osv.). En part som inte deltar i experimenten märker tankarna med ett sådant system och maskerar identiteterna från experimenteraren tills efter efteranalysen är klar.
4. Använd ett nät och placera försiktigt en enda vuxen i den förfyllda bägaren från steg 1.1. Låt den vuxna fisken acklimatisera sig i bägaren i 10 minuter.
   OBS: Spela in den vuxnas kön, eftersom det kan vara viktigt efter analysen att leta efter könsspecifika skillnader.
5. Efter acklimatisering i bägaren, introducera fisken i den nya tanken (ställ in detaljer nedan) genom att försiktigt hälla ut vattnet och vuxen från bägaren.
   OBS: Stegen i det här avsnittet beskriver hur du ställer in den nya tankanalysen. Ett diagram över slutprodukten anges i figur 1B.
   1. Placera den nya tanken i mitten av bordet.
   2. Placera de infraröda lamporna bakom tanken och placera den vita akrylplåten eller diffusorskärmen mellan tanken och LED-ljuskällan.
   3. Placera spridaren så att den maximalt sprider ljuset som kommer från lysdioderna, och ljusets intensitet är tillräcklig för att belysa den nya tanken. Ju närmare brädan är ljuskällan, desto ljusare blir lamporna, men desto mindre kommer det att spridas. Att placera diffusorbrädan bort från ljuskällan minskar däremot ljusintensiteten, men sprider ljuset bättre.
   4. Fyll ungefär tre fjärdedelar av den nya tanken med fisksystemvatten.
      OBS: Systemvatten genereras med omvänd osmos av kranvatten, följt av dosering så att ledningsförmågan motsvarar 900 ± 100 μS, att pH är neutralt (7.2) och att temperaturen är 27 ± 1 °C.
   5. Anslut kameran till kamerastativet och anslut kameran till datorn. Öppna videoförvärvsprogramvaran och justera kameran för att möta tankens framsida och se till att hela den nya tanken kan ses och att det inte finns några dolda områden i videon. Justera tanken och de infraröda lamporna så att det finns tillräcklig och jämn belysning i hela tanken när den observeras genom kameran.
      OBS: Innan du fortsätter till experiment kan det ofta vara användbart att utföra en provkörning, där video av en fisk fångas och spårning utförs. Detta säkerställer att inställningen är tillräcklig för experimentering av beteende.
6. Efter att ha introducerat den vuxna i den nya tanken, starta kamerainspelningen och flytta bort från installationen för att förhindra ytterligare ångest för fisken.
7. När inspelningen är klar, ta bort individen från den nya tanken och placera i en ny hålltank.
   OBS: En annan hålltank än den i steg 1.2 bör användas för att förhindra upprepade tester på samma individer.

Representative Results

Figur 1. Diagram över den nya tankens inställning. A)Mått på den 1,8 L trapetsformade nya tanken sett från tankens inspelningssida. B)Diagram över inställningen, inklusive positioner för de infraröda lampor, kameror och barriärer som används för att minimera störningar hos människor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology