Yeni Tank Dalışı Tahlil: Zebra Balıklarında Doğuştan Gelen Stres Tepkilerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Overview

Makalede zebra balıklarındaki stresi değerlendirmek için davranışsal bir yöntem açıklanmaktadır. Strese yanıt olarak, zebra balığı stres giderilene kadar bir tankın dibinde yüzme eğilimindedir. Örnek protokol, tahlil gerçekleştirmek için adım adım yöntemi açıklar.

Protocol

1. Yeni tank testi kurulumu

1. Balık sistemi suyu ve en az iki tutma tankı ile önceden doldurulmuş 250 mL'lik bir beher hazırlayın.
2. Test sabahı, her deneysel durum (kontroller ve deneysel yetişkinler) için kullanılacak en az 10 test yetişkin zebra balığını bir tutma tankına aktarın, davranış odasına aktarın ve en az bir saat alışmalarına izin verin.
   NOT: Deneyden önce bir güç analizi yapılmalıdır, ancak elimizde istatistiksel önemi tespit etmek için genellikle bir n = 10 yeterlidir. Ayrıca, tutma tankı litre su başına en fazla beş kişi içermelidir. Zebra balığı yetişkinlerinin yeni bir tankın 30 dakika içinde alıştıkları gösterildiğinden, bir saatlik bir alışma yeterlidir. Ayrıca davranış ritimleri sirkadiyen süreçlerden etkilenir ve bu nedenle farklı günlerde yapılan deneysel çoğalmalar aynı saatler içinde yapılmalıdır. Tüm deneyleri genellikle 11:00 ile 18:00 saatleri arasında gerçekleştiririz.
3. Tankları, hayvanların durumu veya genotipi deneyciye kör olacak şekilde etiketlenin.
   NOT: Deneyler, tankları bir harf veya sayı sistemi kullanarak etiketlenerek deneyciye kolayca kör edilebilir (yani, bir tank 'A', başka bir 'B' vb.) etiketlenmiştir. Deneylerde yer almayan bir taraf tankları böyle bir sistemle etiketler ve analiz sonrası tamamlanana kadar deneyciden kimlikleri maskeler.
4. Bir ağ kullanarak, adım 1.1'den itibaren önceden doldurulmuş kabın içine tek bir yetişkini hafifçe yerleştirin. Yetişkin balıkların 10 dakika boyunca kabın içinde alışmasına izin verin.
   NOT: Cinsiyete özgü farklılıkları aramak için analiz sonrası önemli olabileceğinden, yetişkinin cinsiyetini kaydedin.
5. Behere alıştıktan sonra, suyu ve yetişkini beherden hafifçe dökerek balığı yeni tanka sokun (aşağıda ayrıntıları ayarlayın).
   NOT: Bu bölümdeki adımlar, yeni tank testini ayarlamayı açıklar. Şekil 1B'deson ürünün diyagramı verilmiştir.
   1. Yeni tankı masanın ortasına yerleştirin.
   2. Kızılötesi ışıkları tankın arkasına yerleştirin ve beyaz akrilik levhayı veya difüzör ekranını tank ile LED ışık kaynağı arasına yerleştirin.
   3. Difüzörü LED'lerden gelen ışığı maksimum şekilde yayacak şekilde yerleştirin ve ışığın yoğunluğu yeni tankı aydınlatmak için yeterlidir. Tahta ışık kaynağına ne kadar yakınsa, ışıklar o kadar parlak olur, ancak o kadar az yayılır. Bunun aksine, difüzör tahtasını ışık kaynağından uzağa yerleştirmek ışık yoğunluğunu azaltır, ancak ışığı daha iyi yayar.
   4. Yeni tankın yaklaşık dörtte üçünü balık sistemi suyuyla doldurun.
      NOT: Sistem suyu, musluk suyunun ters ozmozu kullanılarak üretilir, ardından iletkenlik 900 ± 100 μS'ye eşit olacak, pH nötr (7,2) ve sıcaklığın 27 ± 1 °C olacak şekilde yapılır.
   5. Kamerayı kamera standına takın ve kamerayı bilgisayara bağlayın. Video alma yazılımını açın ve kamerayı tankın ön tarafına bakacak şekilde ayarlayın ve tüm yeni tankın görülebildiğinden ve videoda gizlenmiş alan olmadığından emin olun. Tankı ve kızılötesi ışıkları, kamera aracılığıyla gözlemlendiğinde tank boyunca yeterli ve eşit aydınlatma olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Deneylere geçmeden önce, genellikle bir balığın videosunun yakalandığı ve izlemenin gerçekleştirildiği bir deneme çalışması yapmak yararlı olabilir. Bu, kurulumun davranış denemeleri için yeterli olmasını sağlar.
6. Yetişkini yeni tanka soktuktan sonra, kamera kaydını başlatın ve balıklara ek sıkıntıyı önlemek için kurulumdan uzaklaşın.
7. Kayıt bittikten sonra, bireyi yeni tanktan çıkarın ve yeni bir tutma tankına yerleştirin.
   NOT: Aynı kişiler üzerinde tekrarlanan testleri önlemek için 1.2 adımındakinden farklı bir tutma tankı kullanılmalıdır.

Representative Results

Şekil 1. Yeni tank kurulumu şeması. (A) Tankın kayıt tarafından görüldüğü gibi 1.8 L trapez roman tankının boyutları. (B) İnsan parazitini en aza indirmek için kullanılan kızılötesi ışıkların, kameranın ve engellerin konumlarını içeren kurulumun şeması.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology