Summary
L'iniezione di sangue autologo modello di emorragia intracerebrale in topi descritti in questo protocollo utilizza la tecnica di iniezione doppio per minimizzare il rischio di reflusso del sangue il percorso dell'ago, non anticoagulanti nel sistema di pompaggio, ed elimina tutto lo spazio morto e tubi espandibili nel sistema.
Protocol
1. La preparazione delle attrezzature
- Pulire la struttura stereotassica e la pompa con il 75% di etanolo per minimizzare la contaminazione batterica.
- Sterilizzare siringa Hamilton e l'ago di silice fusa.
Nota: Se la sterilizzazione chimica è usato, assicuratevi di risciacquare più volte in acqua sterile prima dell'uso. - Pulire la superficie della carta paraffina con il 75% di etanolo e lasciare asciugare.
2. Preparazione del mouse per iniezione
Nota: i topi hanno trasportato al vostro impianto animale almeno 7 giorni prima dell'intervento per consentire loro di acclimatarsi nel nuovo ambiente e ridurre lo stress.
- Pesare mouse per pre-operatoria di base.
- Indurre l'anestesia con il 30% di ossigeno, il 70% di ossido di azoto, e il 4% isoflurano fino a che non risponde a pizzico coda
- Iniettare mouse con buprenorfina 0.1mg/kg intraperitoneale per analgesia post-operatoria
- Rasatura del cuoio capelluto
- Occhi cappotto con vaselina sterile
- Preparare cuoio capelluto con betadine x 3 salviette, quindi lasciare asciugare cuoio capelluto
- Fare 1 incisione mediana sagittale centimetro di cuoio capelluto usando bisturi chirurgici sterili
Nota: Un generoso incisione permetterà l'esposizione completa dei punti di riferimento cranio. - Shave 1 cm di superficie ventrale della coda a partire dal 1 cm dalla base e preparare con betadine x 3 salviette
- Posizionare il mouse sul telaio stereotassico
Nota: è importante garantire il mouse sia correttamente inserita nel telaio con superficie del cranio parallelo con la base del telaio, con ottima esposizione di bregma e almeno 3 mm a destra del bregma.
3. Emorragia intracerebrale chirurgia
Note: Durante l'intervento intero il mouse è anestetizzato con il 30% di ossigeno, il 70% di ossido di azoto, e 1-3% isoflurano, continuamente mantenuto a 37 ± 0,5 ° C con un termistore controllato piastra elettrica e monitorato da termometro rettale.
- Attaccare sterile 27 ago g su 1 siringa cc sul telaio.
- Regolare il braccio fino a quando l'ago stereotassica è esattamente sopra bregma.
- Regolare il braccio in modo che l'ago è a 2,5 millimetri di bregma laterale e inferiore alla superficie del cranio.
- Ruotare manualmente siringa per fare buca bava sulla superficie del cranio durante l'applicazione dolce movimento verso il basso del quadro facendo attenzione a non forare completamente cranio.
- Rimuovere l'ago e completo buco radica manualmente con siringa / ago
Nota: Completare il buco bava a mano consente l'immediato riconoscimento quando si ha perforato la tabella interna del cranio e minimizza il rischio di spingere inavvertitamente ago nel parenchima cerebrale. - Fai incisione trasversale sulla superficie ventrale della coda con lama chirurgica sterile e lasciare 2-3 gocce di sangue arterioso per cadere su carta paraffina. Poi rapidamente arrestare le emorragie con la pressione con garza sterile.
- Prelevare 17 microlitri di sangue nella siringa Hamilton e siringa posto sulla pompa.
- Regolare il braccio stereotassica al punto 5 ° medialmente rispetto all'asse verticale.
- Regolare con cura braccio stereotassica in modo che punta dell'ago è sopra il foro nel cranio bave e quindi abbassare l'ago da 3,5 mm.
- Attendere 2 minuti e poi ritirare il 0,5 millimetri ago (in modo che punta è di 3 mm di profondità)
- Attendere 5 minuti per permettere al cervello di ri-espandersi intorno all'ago e minimizzare il rischio di reflusso di sangue la traccia inserimento dell'ago durante l'iniezione.
- Iniettare sangue 1 ml / minuto per 7,5 microlitri.
- Attendere 5 minuti per consentire iniziale coagulazione del sangue e per i turni di tessuto che si verifichi per ridurre al minimo innalzamento della pressione intracranica.
- Iniettare il restante 7,5 microlitri di 1 ml / minuto
- Lasciare l'ago di rimanere in posizione per 25 minuti per consentire la coagulazione del sangue
Nota: non aspettate la coagulazione del sangue si tradurrà nel sangue refluisce il sito di inserimento dell'ago quando ritirare l'ago - Estrarre lentamente l'ago e subito risciacquare con acqua calda per evitare residui di sangue l'ago dalla coagulazione e garantire riutilizzo di aghi.
- Rimuovere il mouse dal telaio e chiudere la coda e incisioni cuoio capelluto con colla chirurgica veterinaria.
- Spegnere l'anestesia.
- Permettono di mouse per risvegliare pur essendo continuamente riscaldato con accesso gratuito al cibo umido.
- Ritorna mouse per gabbia con fratellini quando è completamente sveglio. Luogo umido cibo precipitato sul fondo della gabbia per aiutare gli animali in accesso al cibo.
4. Rappresentante dei risultati:
Figura 1. Sezione coronale di cervello di topo 15 minuti dopo l'intervento chirurgico ICH. Immediatamente dopo il sacrificio del cervello è stato ispezionato per il successo ICH sulla base di un'ispezione lorda di una sezione coronale nel punto di inserimento dell'ago. Emorragie che rintracciato alla base del cervello, il percorso dell'ago passato il corpo calloso, o nei ventricoli sono state ritenute successo e che il mouse è stato eliminato da tutte le analisi. Nel complesso ICH succetassi ss erano il 75-85% in 50 topi con 0% di mortalità.
Test Figura 2. Cilindro dimostra emiparesi destra a sinistra dopo emorragia intracerebrale gangli della base. (A) topo posteriore del campione dopo l'intervento chirurgico ICH. Nota la posizione del solo dell'arto anteriore destro sulla parete del cilindro dopo sinistra ICH gangli della base. (B) Grafico di test cilindro 1 risultati di coorte di topi dopo ICH chirurgia (n = 5) rispetto alla farsa (n = 4). Topi Sham aveva tutte le procedure ad eccezione di iniezione del sangue (l'ago è stato inserito nel cervello). Ogni mouse è stato posto in un cilindro di 12 cm di diametro in vetro chiaro e osservati per 20 posteriori. Il posizionamento iniziale degli arti anteriori sulla parete del cilindro è stato segnato al posteriore. Movimenti successivi (come l'esplorazione laterale) non sono stati segnati con il mouse fino a quando tornò a terra e la parte posteriore prossimo segnato. L'indice di lateralità è stato calcolato come (# tirocini zampa anteriore destra sul lato del cilindro - # sinistra tirocini forelimb) / (+ # # destra sinistra + # entrambi), dove 0 non hanno indicato alcuna preferenza zampa anteriore e 1 indicata solo la zampa anteriore destra è stata utilizzata .
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Discussion
Questo modello chirurgico dell'emorragia intracerebrale in topi con la coda risultati autologo del sangue dell'arteria in un modello riproducibile di emorragia spontanea gangli della base. Un modello ICH nei topi offre il vantaggio della disponibilità di animali transgenici per studiare fisiopatologia, tuttavia, la loro piccola dimensione rende le procedure neurochirurgiche più tecnicamente difficile che in animali più grandi.
Il modello di collagenasi e l'iniezione di sangue autologo modello sono due consolidati modelli sperimentali di emorragia intracranica. Mentre il modello collagenasi offre una procedura più semplice e una emorragia altamente riproducibili 2, la proteina batterica utilizzata per degradare la membrana basale potrebbe effettuare qualsiasi indagine innata risposte infiammatorie. Inoltre, collagenasi-interrotto BBB potrebbe innaturale facilitare l'accesso della droga al cervello durante farmacologici (per esempio, neuroprotezione) esperimenti. Un warfarin associato modello ICH ha recentemente sviluppato 3, che permette di indagine di espansione emorragia per questo sottogruppo di pazienti. I vantaggi del modello di iniezione di sangue autologo includono la presenza di danni meccanici associati con effetto massa, un sistema di sterile senza proteine esogene, la capacità di eliminare anticoagulante al fine di indagare la coagulazione naturale e percorsi di infiammazione dopo emorragia spontanea, e il controllo squisito sulla dimensione dell'emorragia. Poiché tutti i topi hanno la stessa dimensione emorragia, gli effetti degli interventi terapeutici su entrambi i tessuti e risultato funzionale può essere studiato con precisione con campioni di dimensioni relativamente piccole.
La procedura chirurgica qui descritta è simile ad altri modelli pubblicati utilizzando l'iniezione di sangue autologo (4-7), e diversi passaggi nel nostro protocollo sono stati basati su questi protocolli pubblicati. Miglioramenti significativi in questa tecnica comprendono l'eliminazione di tutti i tubi espandibili e lo spazio morto del sistema, che potrebbe interferire con la misurazione accurata del volume di sangue iniettato, l'eliminazione di tutti gli anticoagulanti, e un volume emorragia moderatamente grande rispetto ad altri modelli della non -il sangue coagulato. A 15 ICH uL in una media di 450 conti uL cervello di topo adulto per il 3% del volume del cervello. Questo è grosso modo paragonabile ad un ICH 40 ml nell'uomo, assumendo normale volume medio del cervello adulto è di 1400 ml. Questo volume ICH risultati misurabili in deficit neurologici che persistono più di due settimane per lo studio del recupero, pur mantenendo a zero il tasso di mortalità, che è di importanza pratica quando si utilizzano costosi animali transgenici.
Visualizzazione diretta di questo intervento dovrebbe eliminare gli errori più comuni e gli aiuti in termini di facilità di replica. Speriamo che questo si tradurrà in ulteriori indagini sui meccanismi di danno e di accelerare lo sviluppo di potenziali terapie.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro è stato finanziato da una borsa di studio presso l'Istituto di Medicina Traslazionale e Therapeutics, e una borsa di formazione presso l'Istituto di Medicina e Ingegneria (T32HL007954) presso l'Università della Pennsylvania e della Marlene L. Cohen e Jerome H. Fleisch Scholar sovvenzione al University of Connecticut Health Center (LHS) e NIH NS-029331 (FAW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereotaxic frame for mouse neurosurgery (St–lting, 51925) | |||
| Microinfusion pump and processor (UMP-3 and Micro4, World Precision Instruments, Sarasota, FL) | |||
| Mouse warmer (St–lting, 50300) | |||
| Inhalational mouse anesthesia (Braintree Scientific, EZ-AF9000) | |||
| 25 μL gastight borosilicate Hamilton syringe with coated plunger and no needle | |||
| (Hamilton company, Reno, NV, 1702RN syringe: 765401, ferrule: 30949, spacer: 30946) | |||
| fused silica needle cut to 2 cm length (Hamilton, 17739) | note Hamilton syringe and fused silica needle may be reused for multiple surgeries if sterilized prior to each surgery. These materials are crucial to avoid blood clotting. | ||
| Sterile surgical gloves | |||
| Surgical gown, bonnet and mask | |||
| Betadine | |||
| 75% ethanol | |||
| sterile 27 g needle (single use) | |||
| sterile 1 cc syringe (single use) | |||
| sterile surgical blade | |||
| Cidex | |||
| sterile water | |||
| buprenorphine and isoflurane | |||
| sterile gauze | |||
| paraffin wax paper squares | |||
| Veterinary surgical glue (Vetbond, 3M, St. Paul, MN) |
References
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