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Biology

उच्च throughput अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता chromatin immunoprecipitation डीएनए टेम्पलेट की पीढ़ी (चिप seq)

Published: April 19, 2013 doi: 10.3791/50286
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Division of Human Genetics, Children's Hospital of Philadelphia Research Institute, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

chromatin immunoprecipitation और अति उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के संयोजन एक दिया ऊतक या सेल लाइन में प्रोटीन डीएनए बातचीत की पहचान और नक्शा कर सकते हैं. दिये एक उदाहरण के रूप में प्रतिलेखन कारक TCF7L2 साथ अनुभव का उपयोग करते हुए बाद में अनुक्रमण के लिए एक उच्च गुणवत्ता चिप टेम्पलेट, उत्पन्न करने के लिए है.

Abstract

Chromatin immunoprecipitation (चिप) के संयोजन और व्यापक समानांतर अनुक्रमण विवो में प्रतिलेखन कारकों से बंधे स्तनधारी डीएनए दृश्यों के प्रदर्शनों की सूची की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जहां चिप अनुक्रमण (चिप seq) तरीकों सीधे, पूरे जीनोम कवरेज प्रदान करते हैं. "अगली पीढ़ी" जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों हो सकता है कि अनुक्रम की राशि में परिमाण वृद्धि 1-2 आदेश प्रदान लागत प्रभावी ढंग से इस प्रकार सीधे स्तनधारी की प्रभावी रूपरेखा के लिए पूरे जीनोम कवरेज प्रदान करने के लिए चिप seq तरीकों की अनुमति के लिए पुराने प्रौद्योगिकियों पर उत्पन्न प्रोटीन डीएनए बातचीत.

सफल चिप seq दृष्टिकोण के लिए, एक उच्च गुणवत्ता चिप डीएनए टेम्पलेट सबसे अच्छा अनुक्रमण परिणामों को प्राप्त करने के लिए उत्पन्न होगा. विवरण सबसे जोरदार टाइप 2 मधुमेह, अर्थात् प्रतिलेखन कारक प्रतिलेखन कारक 2 7 की तरह (TCF7L2 के रोगजनन में फंसा जीन के प्रोटीन उत्पाद के साथ अनुभव के आसपास आधारित है). यह पहलू भी विभिन्न तरह के कैंसर में फंसा दिया गया.

दिये रोगजनन में अपनी प्रमुख भूमिका में और अधिक जानकारी देने, TCF7L2 से बंधे निर्धारित करने के जीन अनुक्रमण के माध्यम से एक उच्च संकल्प नक्शे बनाने के लिए, कोलोरेक्टल कार्सिनोमा सेल लाइन, HCT116 से व्युत्पन्न उच्च गुणवत्ता चिप डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए है जटिल लक्षण की.

Introduction

कई सालों के लिए विशेष रूप से किसी दिए गए प्रोटीन जीनोम चौड़ा, प्रतिलेखन कारक वर्ग में उन लोगों से बंधे और विनियमित जीन के सेट की पहचान करने के लिए एक unmet की आवश्यकता हुई है.

Odom एट अल. 1 व्यवस्थित मानव यकृत और अग्नाशय islets में पूर्व निर्धारित transcriptional नियामकों के कब्जे में जीनों की पहचान करने के लिए प्रमोटर प्रोटीन के साथ संयुक्त chromatin immunoprecipitation (चिप) का इस्तेमाल किया. इसके बाद जॉनसन एट अल. 2 व्यापक पूरे स्तनधारी जीनोम भर में प्रोटीन डीएनए बातचीत नक्शा करने के क्रम में प्रत्यक्ष अल्ट्रा उच्च throughput डीएनए अनुक्रमण (चिप seq) के आधार पर एक बड़े पैमाने पर chromatin immunoprecipitation परख विकसित. एक परीक्षण के मामले के रूप में, वे vivo में मानव जीनोम में 1946 स्थानों पर न्यूरॉन प्रतिबंधात्मक रवशामक कारक (NRSF) के बंधन मैप किया. डेटा मैं दोनों में मदद की जो बाध्यकारी स्थिति के तेज संकल्प (+ 50 आधार जोड़े), प्रदर्शितरूपांकनों और NRSF बाध्यकारी रूपांकनों की पहचान की solation. ये चिप seq डेटा भी उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता और सांख्यिकीय विश्वास (पी <10 -4), नए उम्मीदवार बातचीत inferring के लिए महत्वपूर्ण हैं कि गुण था.

रॉबर्टसन एट अल. 3 भी में STAT1 लक्ष्य नक्शा करने के क्रम में चिप seq इस्तेमाल किया इंटरफेरॉन γ (IFN-γ) उत्तेजित और vivo में मानव हेला S3 कोशिकाओं unstimulated. चिप seq करके, 15.1 और 12.9 मिलियन विशिष्ट मैप किया अनुक्रम पढ़ता है, और कम से कम 0,001 की अनुमानित झूठे खोज दर का उपयोग कर, वे क्रमशः, उत्तेजित और unstimulated कोशिकाओं में 41582 और 11004 ख्यात STAT1 बाध्यकारी क्षेत्रों की पहचान की. STAT1 इंटरफेरॉन उत्तरदायी बाध्यकारी साइटों 4-8 रोकने के लिए जाना जाता है 34 स्थलों की, चिप seq 24 (71%) पाया. चिप seq लक्ष्य जाना जाता STAT1 बाध्यकारी रूपांकनों के लिए इसी तरह के दृश्यों में समृद्ध थे. दो मौजूदा चिप पीसीआर डेटा के साथ तुलना सुझाव सेटउस चिप seq संवेदनशीलता 70% और 92% और विशिष्टता थी कम से कम 95% के बीच था. इसके अतिरिक्त, यह चिप seq गहराई अनुक्रमण के साथ बढ़ जाती है कि कम विश्लेषणात्मक जटिलता और संवेदनशीलता दोनों प्रदान करता है कि स्पष्ट था.

इस तरह, "अगली पीढ़ी" जीनोम अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों 9 पुराने प्रौद्योगिकियों पर उत्पन्न प्रभावी ढंग से लागत जा सकता है कि अनुक्रम की राशि में परिमाण वृद्धि 1-2 आदेश प्रदान करते हैं. चिप seq तरीकों इसलिए सीधे स्तनधारी प्रोटीन डीएनए बातचीत 3 के प्रभावी रूपरेखा के लिए पूरे जीनोम कवरेज प्रदान करते हैं.

2006 में, प्रतिलेखन कारक 2 7 की तरह (TCF7L2) टाइप 2 मधुमेह के साथ जीन में वेरिएंट की एक मजबूत संघ 10 की खोज की थी. अन्य जांचकर्ताओं पहले से ही स्वतंत्र रूप से प्रकृति 11,12 में प्रकाशित टाइप 2 मधुमेह के पहले जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन से, दिलचस्प, विभिन्न जातियों में इस खोज दोहराया और है विज्ञान 13-15 और 16,17 ऊपर, मजबूत सहयोग TCF7L2 साथ वास्तव में था, यह अब 18-20 तारीख करने के लिए टाइप 2 मधुमेह में सबसे महत्वपूर्ण आनुवंशिक निष्कर्ष माना जाता है. इसके अलावा, TCF7L2 कैंसर के खतरे को 21,22 से जोड़ा गया है, कोलोरेक्टल कार्सिनोमा सहित कैंसर के एक नंबर, के जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन से पता चला 8q24 ठिकाना, एक चरम नदी के ऊपर के कारण होना दिखाया गया था, जब वास्तव में, इस संबंध में अधिक स्पष्ट हो गया TCF7L2 बाध्यकारी तत्व MYC 23,24 के प्रतिलेखन चला. जैसे, इस कुंजी प्रतिलेखन कारक द्वारा विनियमित बहाव के जीन का पता लगाने में बहुत रुचि है.

कार्यप्रणाली का एक उदाहरण के रूप में TCF7L2 के साथ अनुभव के आधार पर, इस कागज उच्च गुणवत्ता चिप डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए रूपरेखा. चिप एक उच्च Resol बनाने के क्रम में बाद में अनुक्रमण के लिए, कोलोरेक्टल कार्सिनोमा सेल लाइन, HCT116 में बाहर किया गया थाजटिल लक्षण के रोगजनन में अपनी प्रमुख भूमिका में आगे अंतर्दृष्टि उपज के लिए एक प्रयास में TCF7L2 25 से बंधे जीन की ution नक्शा.

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Protocol

1. क्रॉस लिंक Chromatin

  1. 100x20mm सेल संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं को विकसित. कोशिकाओं की राशि 1 से सेल प्रकार के आधार पर पकवान प्रति 10 लाख की कोशिकाओं को लेकर कर सकते हैं. लगभग 2 मिलियन कोशिकाओं एक immunoprecipitation के लिए पर्याप्त है.
  2. सामयिक कमाल के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 1% formaldehyde में क्रॉस लिंक कोशिकाओं.
  3. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 125 मिमी ग्लाइसिन और सेते के अंतिम एकाग्रता जोड़कर पार से जोड़ने बुझाने.
  4. 1X फास्फेट के साथ कोशिकाओं को धो छानना पीबीएस, दो बार खारा (पीबीएस) buffered, और फिर पीबीएस के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. एक microcentrifuge ट्यूब में एक प्लास्टिक सेल खुरचनी के साथ हार्वेस्ट कोशिकाओं.
  6. 4 में 5 मिनट के लिए 2000 rpm पर कोशिकाओं स्पिन डिग्री सेल्सियस
  7. तैरनेवाला Aspirate. पूरे सेल के लिए एसडीएस lysis बफर में Resuspend कोशिकाओं (1% एसडीएस, 10mM ईडीटीए, 50mm Tris-एचसीएल पीएच 8.1) lysate या परमाणु निकासी के लिए एक गोली के रूप में उन्हें रखने के लिए.
  8. कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस या एक immediat आगे बढ़ सकते हैं -80 में बचाया जा सकता हैsonication के साथ इली.

2. (साबुत सेल lysate के लिए 3.5 चरण के लिए आगे बढ़ें) नाभिक तैयार

  1. 1X proteinase अवरोध करनेवाला एक प्रयोग के साथ (5 मिमी पाइप 8.0 पीएच, 85 मिमी KCl, 0.5% एनपी 40) सेल बफर अनुपूरक.
  2. लगभग 10 गुना सेल बफर के साथ गोली मात्रा में thawed सेल गोली Resuspend.
  3. मूसल के साथ Dounce-homogenize 10 बार फिर 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  4. 4 में 5 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 4000 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और परमाणु गोली बचा.

3. Sonication *

  1. एसडीएस lysis बफर और proteinase अवरोध करनेवाला के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए बफर की पूरक मात्रा में गर्म.
  2. एसडीएस lysis बफर में Resuspend परमाणु गोली (1-10 मिलियन कोशिकाओं प्रति बफर के लगभग 0.5 मिलीलीटर)
  3. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
  4. Microcentrifuge ट्यूबों के लिए नमूने के 0.5 मिलीलीटर aliquots जोड़ें.
  5. सेकंड पर और 45 से 30 सेकंड के साथ Misonix sonicator का उपयोग कर गीला बर्फ पर Sonicateबंद 2 के एक आयाम स्थापित करने में. आदर्श टुकड़ा आकार के लिए चक्रों की संख्या पहले विभिन्न चक्र संख्या (उदाहरण 2, 4, 8, 12, 16, और 20 या अधिक चक्र) की कोशिश कर रहा द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Sonicator की एक अलग ब्रांड, तथापि, की स्थिति भिन्न हो जाएगा इस्तेमाल किया जा सकता है. चक्र और पर समय की राशि की संख्या के साथ प्रयोग और बंद आदर्श स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जाना चाहिए.
  6. Sonication के परिणामों की जांच के लिए और मात्रा का ठहराव करने के लिए प्रत्येक नमूने के 20 μl लीजिए. नमूना के बाकी -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
  7. 0.1X ते बफर के 30 μl जोड़कर नमूना के 20 μl पतला.
  8. RNase की 1 μl के साथ नमूना समझो एक 37 पर 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस तो 2 घंटे के लिए 62 डिग्री सेल्सियस पर proteinase कश्मीर और सेते की 1 μl जोड़ें.
  9. एक 2% agarose जेल पर नमूने के 20 μl चलाएँ.
  10. तब NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग यों QIAquick पीसीआर शोधन किट के साथ नमूने की शेष राशि शुद्ध.

* देशी ची के लिएपी, microccocal nuclease पाचन कतरनी डीएनए के लिए विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. ब्लॉक agarose मोती *

  1. मोती पहले से ही अवरुद्ध कर रहे हैं, 5.1 कदम आगे बढ़ना.
  2. एक प्रोटीन या प्रोटीन जी agarose का प्रयोग करें. 5 immunoprecipitations लिए (आईपी), 50% मनका घोल (300 μl मनका गोली) के 600 μl उपयोग
  3. मोती धोने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 800 rpm पर उन्हें नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. जोड़ें थोड़ा अधिक 2 मिलीलीटर चिप कमजोर पड़ने बफर (0.01% एसडीएस, 1.2 मिमी EDTA, 167 मिमी NaCl, 1.1% ट्राइटन X-100, 16.7 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.1) और धीरे inverting के ट्यूब 10X द्वारा मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 800 rpm पर फिर से स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. धोने 2 अधिक बार दोहराएँ.
  4. अवरुद्ध समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर घूर्णन द्वारा मोती ब्लॉक. अवरुद्ध समाधान का नुस्खा के लिए 1 टेबल को देखें.

5. पूर्व स्पष्ट Chromatin

  1. पिघलना बर्फ पर क्रोमेटिन sonicated.
  2. 12,000 आरपीएम पर च स्पिनया 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस तो एसडीएस (सफेद गोली) को हटाने के लिए सही दूर बर्फ पर डाल दिया.
  3. तैरनेवाला लीजिए, गोली त्यागें, और यदि आवश्यक हो तो नमूने गठबंधन.
  4. गणना (आईपी प्रति chromatin के 1-10 स्नातकीय) के आधार पर प्रयोग के लिए आवश्यक मात्रा में बाहर ले जाओ.
  5. Proteinase अवरोध करनेवाला के साथ पूरक चिप कमजोर पड़ने बफर में 10X क्रोमेटिन पतला.
  6. आईपी ​​प्रति अवरुद्ध मोतियों की 100 μl जोड़ें.
  7. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं.

6. Immunoprecipitation

  1. 1 मिनट के लिए 800 rpm पर नमूने स्पिन और एक ताजा ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  2. 1 मिनट और एक और साफ ट्यूब को हस्तांतरण के लिए 800 rpm पर तैरनेवाला स्पिन.
  3. -20 डिग्री सेल्सियस पर, इनपुट नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए, सतह पर तैरनेवाला के 20 μl सहेजें
  4. प्रयोग में किया जाना आईपी की संख्या को अशेष क्रोमेटिन.
  5. प्रत्येक नमूने के chromatin के 1-10 स्नातकीय प्रति एंटीबॉडी के 2 स्नातकीय जोड़ें.
  6. रोटेशन के साथ रात में 4 डिग्री सेल्सियस सेते हैं.
  7. प्रत्येक IP नमूना को अवरुद्ध मोतियों की 100 μl जोड़ें.
  8. डिग्री सेल्सियस रोटेशन के साथ 4 पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  9. गोली 1 मिनट के लिए 800 rpm पर नीचे कताई और संभव के रूप में सतह पर तैरनेवाला के रूप में ज्यादा त्यागने से मोती.
  10. कम नमक इम्यून कॉम्प्लेक्स धोने बफर के साथ एक बार मोती धो लें. प्रत्येक ट्यूब बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें, 5-8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बारी बारी से, 1 मिनट के लिए 800 rpm पर नीचे स्पिन, फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागने. उच्च नमक इम्यून कॉम्प्लेक्स धोने बफर और LiCl इम्यून कॉम्प्लेक्स धोने बफर के साथ एक बार धोने दोहराएँ और दो ​​बार 5 धोने (तालिका 2) की कुल के लिए ते बफर के साथ.

7. क्षालन

  1. पिछले दिन से पिघलना इनपुट नमूने eluants के साथ कार्रवाई की जाएगी.
  2. क्षालन बफर ताजा (तालिका 3) बनाओ.
  3. आईपीएस और इनपुट नियंत्रण नमूने प्लस 1-2 अतिरिक्त नमूने लिए आवश्यक पर्याप्त क्षालन बफर के एक मास्टर मिश्रण बनाओ.
  4. प्रत्येक IP नमूना के लिए 100 μl क्षालन बफर जोड़ें और 15 मीटर के लिए कमरे में अस्थायी पर सेतेरोटेशन के साथ में.
  5. 1 मिनट के लिए 800 rpm पर स्पिन और एक ताजा ट्यूब तैरनेवाला जोड़ें.
  6. मोतियों की प्रत्येक ट्यूब क्षालन बफर का एक और 100 μl जोड़ें और रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए कमरे अस्थायी पर सेते हैं.
  7. ऊष्मायन के बाद 15 सेकंड के लिए भंवर, 1 मिनट के लिए 5000 rpm पर नीचे स्पिन, तो पहले क्षालन से सतह पर तैरनेवाला के साथ सतह पर तैरनेवाला गठबंधन. (कोई supernatants में मोती वहाँ पर छोड़ दिया जाता है सुनिश्चित करें. अनिश्चित हैं, तो 1 मिनट के लिए 5000 rpm पर फिर से सतह पर तैरनेवाला नीचे स्पिन और एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा.
  8. इनपुट नियंत्रण के नमूने के 20 μl को क्षालन बफर के 180 μl जोड़ें.

8. क्रॉस लिंक रिवर्स

  1. Eluants और इनपुट नियंत्रण के 200 μl के लिए, 5 एम NaCl के 8 μl जोड़ें.
  2. 65 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर नहाने के पानी में parafilm और सेते साथ सील ट्यूब.

9. डीएनए शोधन

  1. 37 पर 1 घंटे के लिए RNase ए की 1 μl के साथ प्रत्येक नमूने समझो डिग्री सेल्सियस
  2. 4 μ जोड़ें0.5 एम EDTA, 8 μl 1M Tris-एचसीएल, मिश्रण, की मैं तो 2 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक नमूना और सेते proteinase कश्मीर की 1 μl जोड़ें.
  3. QIAquick पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर नमूने शुद्ध. नमूने एक बाद की तारीख पर किया जा सकता है -20 डिग्री सेल्सियस और पीसीआर जांच में बचाया जा सकता है.

* वैकल्पिक रूप से, चिप ग्रेड चुंबकीय मोतियों immunoprecipitation के हिस्से के लिए agarose के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.

10. पीसीआर की जांच

  1. पीसीआर की जांच के लिए ब्याज की प्रोटीन से बंधे होने के लिए जाना जाता क्षेत्रों के लिए प्राइमर का उपयोग करें. इसके अलावा, नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर बाध्यकारी क्षेत्रों के लिए प्राइमर का उपयोग करें.
  2. प्रतिक्रिया के लिए अभिकर्मकों मिश्रण. 1:100 (3 टेबल) पर इनपुट नमूना पतला.
  3. प्रतिक्रिया चलाएँ. पीसीआर कार्यक्रम:

चरण 1: 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट

चरण 2: 94 डिग्री सेल्सियस 20 सेकंड
59 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
72 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड
(कम से कम 30 cycl के लिए चरण 2 दोहराएँतों)

चरण 3: 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट

  1. 1% agarose जेल पर नमूने चलाएँ.
  2. संवर्धन भी वास्तविक समय पीसीआर के साथ मात्रात्मक निर्धारित किया जा सकता है.

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Representative Results

क्रोमेटिन sonicated किया गया है और RNase और proteinase के साथ इलाज किया गया है एक बार, 2% agarose जेल पर चलाने के नमूने वांछित आकार में डीएनए के थोक के साथ एक धब्बा मौजूद होना चाहिए. कई अलग चक्र का परीक्षण कर रहे हैं, आकार में एक क्रमिक कमी चक्र में वृद्धि की संख्या (चित्रा 2) के रूप में देखा जाना चाहिए.

प्रोटोकॉल के immunoprecipitation के भाग को पूरा करने के बाद संवर्धन या तो पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर द्वारा जाँच की जा सकती. एक agarose जेल पर चलने पीसीआर नमूने के लिए इनपुट और चिप में बैंड (इस मामले में TCF7L2 है, जो ब्याज की प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का उपयोग) नमूना गलियों और कुछ भी नहीं है या सबसे कम, में एक बहुत ही बेहोश बैंड (पृष्ठभूमि शोर) नहीं होनी चाहिए सकारात्मक बाध्यकारी क्षेत्र के लिए आईजीजी (नकारात्मक) नियंत्रण लेन. नकारात्मक बाध्यकारी क्षेत्र के लिए बहुत ही बेहोश या आईजीजी नियंत्रण और चिप गलियों के लिए कोई बैंड होना चाहिए. इनपुट लेन (चित्रा 3) में एक बैंड होना चाहिए.

चित्रा 4 वास्तविक समय पीसीआर द्वारा जांच एक ही नमूनों से पता चलता है. पिछले आंकड़े के साथ के रूप में, आईजीजी नियंत्रण पर चिप नमूना के लिए सकारात्मक बाध्यकारी क्षेत्र की एक महत्वपूर्ण गुना संवर्धन होना चाहिए. इसके अलावा, नकारात्मक बाध्यकारी क्षेत्र में देखा बहुत कम संवर्धन, यदि कोई हो, वहाँ होना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1. चिप प्रक्रिया का प्रवाह आरेख. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. जेल डीएनए sonication के जांच ले.

"> चित्रा 3
चित्रा 3. पीसीआर चिप की जाँच करें.

चित्रा 4
4 के बाहर चित्रा. TCF7L2 चिप की वास्तविक समय पीसीआर.

अभिकर्मक खंड
मनका गोली 300 μl
बीएसए (50 मिलीग्राम / एमएल) 30 μl
100X proteinase अवरोध 10 μl
चिप कमजोर पड़ने बफर 660 μl
संपूर्ण 1000 μl

तालिका 1. Agarose रोकने के लिए पकाने की विधि.

बफर अवयव
कम नमक इम्यून कॉम्प्लेक्स धो बफर 0.1% एसडीएस
1% ट्राइटन X-100
2 मिमी EDTA
20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.1
150 मिमी NaCl
उच्च नमक इम्यून कॉम्प्लेक्स धो बफर 0.1% एसडीएस
1% ट्राइटन X-100
2 मिमी EDTA
20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.1
500 मिमी NaCl
LiCl इम्यून कॉम्प्लेक्स धो बफर 0.25 एम LiCl
1% एनपी 40
1% Deoxycholate
1 मिमी EDTA
10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.1
ते बफर 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8.1
1 मिमी EDTA पीएच 8.0

तालिका 2. चिप धोने बफ़र्स.

अभिकर्मक खंड
10 μl
1 एम 3 NaHCO 20 μl
एच 2 हे 170 μl

तालिका 3. एक आईपी के लिए क्षालन बफर.

अभिकर्मक 50 μl रिएक्शन 20 μl रिएक्शन
पानी 27 μl 10.8 μl
5X पीसीआर प्रतिक्रिया बफर 10 μl 4 μl
2 MgCl 4 μl 1.6 μl
dNTP (10 मिमी) 1 μl 0.4 μl
प्राइमर मिश्रण (5 उम प्रत्येक) 2 μl 0.8 μl
Taq (Promega HotStart) 1 μl </ P> 0.4 μl
चिप डीएनए 5 μl 2 μl

तालिका 4. पीसीआर प्रतिक्रिया संस्करणों.

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Discussion

बहुत हाल ही में अन्य प्रतिलेखन कारक 2,3 के साथ प्रदर्शित किया गया है, क्योंकि यह अब चिप seq का उपयोग कर प्रोटीन डीएनए बातचीत संघ की एक जीनोम चौड़ा प्रोफ़ाइल से बाहर ले जाने के लिए संभव है. एक सफल अनुक्रमण परिणाम के लिए कुंजी एक उच्च गुणवत्ता chromatin immunoprecipitation डीएनए टेम्पलेट की पीढ़ी है.

डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न और पर्याप्त रूप से समृद्ध होने की निधारित किया गया है, एक तो बाद में अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय तैयारी में ले जा सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक विक्रेता, Illumina द्वारा प्रदान की अनुक्रमण पुस्तकालय प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं. इस पुस्तकालय के आकार के चयन ~ 200 में जेल वैद्युतकणसंचलन और डीएनए के बाद छांटना और शुद्धि के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है - 700 बीपी श्रृंखला के लिए. आकार को कम करने और जेल शुद्धि से एकत्र DNAs का आकार रेंज चिप seq की स्थितीय संकल्प में सुधार करना है संकुचन. पूर्णांक के कारक के लिए बाध्य इनपुट डीएनए के छोटे टुकड़ों के लिए समृद्धerest, एक साइट है कि स्थान संकल्प होगा लाभ की उम्मीद है. तंग आकार चयन भी Illumina मंच पर उत्पादित आणविक कालोनियों का आकार एकरूपता में सुधार. इस तरह कॉलोनी आकार एकरूपता भी प्राप्त प्रभावी पढ़ने संख्या बढ़ जाती है. कम इनपुट डीएनए आकार भी Illumina मंच पर अधिक मजबूत कालोनियों पैदा करता है, और यह कि किसी भी इनपुट नमूना वितरण भीतर कम डीएनए टुकड़े ही वितरण से लंबे समय तक निवेश के टुकड़े कर रहे हैं की तुलना में अंतिम दृश्य उत्पादन में और अधिक कुशलता से प्रतिनिधित्व किया जाएगा मतलब हो सकता है.

"अगली पीढ़ी" अनुक्रम विश्लेषण करने Bioinformatic दृष्टिकोण आगे शोधन के लिए उनके सॉफ्टवेयर खुला स्रोत बनाने के कई विक्रेताओं के साथ विकसित करने के लिए जारी कर रहे हैं. एक एक डीएनए टुकड़ा ओवरलैप प्रोफ़ाइल में अद्वितीय जीनोमिक स्थानों के लिए कि नक्शे पढ़ता बदल सकते हैं. महत्वपूर्ण चोटियों एक अनुमान के झूठे खोज दर के बराबर ऊंचाई पर threshholding प्रोफाइल द्वारा पहचाना जा सकता है. स्थिति सपाइस काम से प्राप्त ecific की आवृत्ति matrices एक दिया कारक के लिए मानव जीनोम में डीएनए बाध्यकारी साइटों की पहचान करने और स्थानीय बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

लेकिन एक सम्मान के साथ करने के लिए क्या कारकों चिप seq के साथ अध्ययन करने के लिए किसी की इच्छा. सतर्क होना चाहिए एक गरीब एंटीबॉडी एक की प्रयोगात्मक परिणामों पर बहुत हानिकारक प्रभाव हो सकता है के रूप में एक एंटीबॉडी, चिप की स्थापना में प्रयोग करने योग्य है कि बाजार में उपलब्ध है, तो इस तरह के एक अध्ययन पर तैयार कर पहले एक आकलन करना चाहिए. अध्ययन के तहत प्रोटीन का ब्याह isoforms अगर वहाँ इसके अलावा, एक विचार करना चाहिए, हम इस प्रतिलेखन कारक के सभी मुख्य isoforms में लगातार मौजूद अमीनो एसिड के लिए बाध्य है कि एक एंटीबॉडी के चयन में विशेष रूप से सतर्क थे तो वास्तव में, TCF7L2 कई isoforms के लिए जाना जाता है 25.

सारांश में, chromatin immunoprecipitation और अति उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के संयोजन एक दिया ऊतक या ग में प्रोटीन डीएनए बातचीत की पहचान और नक्शा कर सकते हैंपक्ष लाइन. हम बाद में अनुक्रमण के लिए एक उच्च गुणवत्ता चिप टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए रेखांकित किया है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

काम फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल से एक संस्थान विकास पुरस्कार द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
EZ-ChIP Kit Millipore 17-371
GoTaq Hot Start Polymerase Promega M5001
Misonix Sonicator Qsonica XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo-Scientific
Positive control primer sequences (TCF7L2-1)
Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3'
Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3'
Negative control primer sequences (CTRL-1)
Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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