Summary
La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.
Abstract
Métodos de secuenciación (chip-chip-ss) ofrecen directamente la cobertura de todo el genoma, en donde la combinación de inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) y secuenciación masiva en paralelo puede ser utilizado para identificar el repertorio de secuencias de ADN de mamíferos vinculados por factores de transcripción en vivo. "La próxima generación de" tecnologías de secuenciación del genoma proporcionan 1-2 órdenes de magnitud aumento en la cantidad de secuencia que puede ser rentable generado más viejas tecnologías lo que permite métodos de chip-ss para proporcionar directamente la cobertura de todo el genoma de perfiles efectiva de los mamíferos interacciones proteína-DNA.
Para exitosos enfoques chip-ss, hay que generar chip molde de ADN de alta calidad para obtener los mejores resultados de secuenciación. La descripción se basa en la experiencia con el producto de proteína del gen más fuertemente implicados en la patogénesis de la diabetes tipo 2, a saber, el factor de transcripción factor de transcripción 7-como 2 (TCF7L2). Este factor también ha sido implicado en varios tipos de cáncer.
Contorno es cómo generar plantilla de chip de ADN de alta calidad derivada de la línea celular de carcinoma colorrectal, HCT116, con el fin de construir un mapa de alta resolución a través de la secuenciación para determinar los genes vinculados por TCF7L2, dando más detalles en a su papel clave en la patogénesis de rasgos complejos.
Introduction
Durante muchos años ha habido una necesidad no satisfecha para identificar el conjunto de genes vinculados y regulado por una proteína dada genoma de ancho, en particular los de la clase de factor de transcripción.
Odom et. Al 1 utiliza la cromatina immunoprecipitation (CHIP) en combinación con el promotor microarrays para identificar sistemáticamente los genes ocupados por reguladores transcripcionales pre-especificados en el hígado humano y los islotes pancreáticos. Posteriormente, Johnson et al. 2 desarrollaron un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina a gran escala basada en la secuenciación directa de ultra alto rendimiento de ADN (chip-ss) para asignar globalmente las interacciones proteína-ADN a través de todo los genomas de mamíferos. Como caso de prueba, se asignan in vivo la unión del factor silenciador restrictivo neuronal (NRSF) a 1.946 localizaciones en el genoma humano. Los datos muestran una nítida resolución de la posición de encuadernado (+ 50 pares de bases), lo que facilitó la isolation de motivos y la identificación de motivos NRSF vinculantes. Estos datos chip-seq también tenían una alta sensibilidad y especificidad y la confianza estadística (P <10 -4), propiedades que son importantes para inferir nuevas interacciones candidatos.
Robertson et al. 3 también se utiliza chip-ss con el fin de asignar STAT1 objetivos en interferón-γ (IFN-γ)-estimulado y células HeLa S3 humanos no estimulados in vivo. Por chip-ss, con 15,1 y 12,9 millones de secuencia asignado únicamente lee, y se estima una tasa de falso descubrimiento de menos de 0.001, se identificaron 41.582 y 11.004 supuestos regiones STAT1 vinculante en células estimuladas y no estimuladas, respectivamente. De los 34 loci se sabe que contienen STAT1 que responden al interferón vinculante sitios 4-8, chip-ss encontraron 24 (71%). Objetivos chip-ss fueron enriquecidos en secuencias similares a conocidos STAT1 vinculante motivos. Las comparaciones con los datos de dos chip-PCR existentes establece sugirióque la sensibilidad chip-ss fue entre 70% y 92% y la especificidad fue de al menos 95%. Además, estaba claro que el chip-ss ofrece tanto de baja complejidad analítica y la sensibilidad que aumenta con la secuenciación de profundidad.
Como las tecnologías de secuenciación tal, genoma "de nueva generación" ofrecen 1-2 órdenes de magnitud aumento en la cantidad de secuencia que puede ser rentable generado más viejas tecnologías 9. Por lo tanto, los métodos de chip-ss proporcionan directamente la cobertura de todo el genoma de perfiles eficaz de mamíferos interacciones proteína-ADN 3.
En 2006, una fuerte asociación de variantes en el factor de transcripción 7-like 2 (TCF7L2) gen con la diabetes tipo 2 fue descubierto 10. Otros investigadores ya han replicado este hallazgo independiente en diferentes etnias y, curiosamente, a partir de los primeros estudios de asociación de todo el genoma de la diabetes tipo 2, publicados en la revista Nature 11,12 Ciencia 13-15 y en otros 16,17, la asociación más fuerte fue hecho con TCF7L2, lo que ahora se considera el hallazgo genético más importante en la diabetes tipo 2 al día 18-20. Además, TCF7L2 se ha relacionado con el riesgo de cáncer 21,22, de hecho, esta conexión se hizo más evidente cuando el locus 8q24 revelado por estudios de asociación en todo el genoma de un número de cánceres, incluyendo carcinomas colorrectales, se demostró que era debido a un extremo aguas arriba TCF7L2 elemento de unión a conducir la transcripción de MYC 23,24. Como tal, hay un gran interés en la determinación de los genes aguas abajo regulados por este factor de transcripción clave.
Basándose en la experiencia con TCF7L2 como un ejemplo de la metodología, este documento describe cómo generar chip plantilla de ADN de alta calidad. Chip se llevó a cabo en la línea celular de carcinoma colorrectal, HCT116, para la posterior secuenciación para construir una alta resollución mapa de los genes vinculados por TCF7L2 25 en un esfuerzo para producir una mayor comprensión en a su papel clave en la patogénesis de los rasgos complejos.
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Protocol
1. Cross-link cromatina
- Se cultivan las células en placas de cultivo celular 100x20mm. La cantidad de células puede variar de 1 a 10 millones de células por plato dependiendo del tipo de célula. Aproximadamente 2 millones de células es suficiente para una inmunoprecipitación.
- Células Cross-link en el 1% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.
- Se inactiva la reticulación mediante la adición de una concentración final de 125 mM de glicina y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) dos veces, se decanta PBS, y a continuación, añadir 0,2 ml de PBS.
- Células de la cosecha con un rascador de células de plástico en un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar las células a 2000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en tampón de lisis (SDS al 1% de SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,1) para lisado de células enteras o mantenerlos como una pastilla para la extracción nuclear.
- Las células se pueden guardar a -80 ° C o se puede proceder immediately con ultrasonidos.
2. Prepare Núcleos (Continúe con el paso 3.5 para Todo el lisado celular)
- Suplemento Tampón de Lisis Celular (TUBOS 5 mM, pH 8,0, 85 mM de KCl, 0,5% de NP-40) con 1X inhibidor de la proteinasa cada experimento.
- Resuspender el sedimento celular descongelado en aproximadamente 10 veces el volumen de pellets con Tampón de Lisis Celular.
- Dounce-homogeneizar 10 veces con mano de mortero y luego se incuban en hielo durante 10 min.
- Centrifugar la muestra a 4000 rpm durante 5 min a 4 ° C, desechar el sobrenadante, y guardar pellet nuclear.
3. Sonicación *
- Calentar SDS tampón de lisis y la cantidad de suplemento de tampón para ser utilizado con el inhibidor de proteinasa.
- Resuspender el sedimento nuclear en SDS tampón de lisis (aproximadamente 0,5 ml de tampón por 1 a 10.000.000 células)
- Incubar en hielo durante 10 min.
- Añadir alícuotas de 0,5 ml de las muestras a tubos de microcentrífuga.
- Someter a ultrasonidos en hielo usando Misonix ultrasonidos con 30 segundos encendido y 45 segundosbajar en un ajuste de amplitud de 2. Número de ciclos para el tamaño ideal fragmento puede ser determinada por tratando primero a cabo varios números de ciclos (por ejemplo 2, 4, 8, 12, 16, y 20 o más ciclos). Una marca diferente de aparato de ultrasonidos puede utilizarse, sin embargo, las condiciones pueden variar. La experimentación con el número de ciclos y la cantidad de tiempo de encendido y apagado deben llevarse a cabo con el fin de determinar las condiciones ideales.
- Recoge 20 l de cada muestra para comprobar los resultados de sonicación y hacer cuantificación. El resto de la muestra puede ser almacenada a -80 ° C.
- Se diluye la 20 l de muestra mediante la adición de 30 l de 0,1 X tampón TE.
- Tratar la muestra con 1 l de RNasa A a 37 ° C durante 1 hr a continuación, añadir 1 l de proteinasa K y se incuba a 62 ° C durante 2 horas.
- Ejecutar 20 l de la muestra en un gel de agarosa al 2%.
- Purificar la cantidad restante de la muestra con el kit de purificación de PCR QIAquick entonces cuantificar utilizando espectrofotómetro NanoDrop.
* Para ChI nativaP, microccocal la digestión con nucleasa puede usarse alternativamente para cortar el ADN.
4. Cuentas bloque de agarosa *
- Si los granos ya están bloqueados, vaya al paso 5.1.
- Utilice una proteína o proteína G agarosa. Para 5 inmunoprecipitaciones (IPs), utilice 600 l de 50% de suspensión de perlas (300 l sedimento de perlas)
- Para lavar las perlas, girar hacia abajo a 800 rpm durante 1 min a 4 ° C y desechar el sobrenadante. Añadir un poco más de 2 ml de tampón de dilución de chip (0,01% de SDS, 1,2 mM de EDTA, 167 mM de NaCl, 1,1% de Triton X-100, Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1) y mezclar lentamente invirtiendo el tubo 10 veces. Girar de nuevo a 800 rpm durante 1 min a 4 ° C y desechar el sobrenadante. Repita el lavado 2 veces más.
- Bloque perlas por rotación a 4 º C durante la noche en solución de bloqueo. Consulte la Tabla 1 para la receta de la solución de bloqueo.
5. Cromatina Pre-clear
- Thaw ultrasonidos cromatina en hielo.
- Centrifugar a 12.000 rpm fo 10 min a 4 ° C y luego se puso en hielo inmediatamente para eliminar el SDS (blanco pellet).
- Recoger el sobrenadante, deseche pellet y combinar las muestras si es necesario.
- Sacar las cantidades necesarias para el experimento sobre la base de cálculos (1-10 ug de la cromatina por IP).
- Diluir 10 veces la cromatina en el tampón de dilución chip complementado con inhibidor de la proteinasa.
- Añadir 100 l de cuentas bloqueadas por IP.
- Girar a 4 ° C durante 1 hora.
6. Immunoprecipitation
- Centrifugar las muestras a 800 rpm durante 1 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
- Decantar el sobrenadante a 800 rpm durante 1 min y la transferencia a otro tubo limpio.
- Guardar 20 l del sobrenadante, para servir como el control de entrada, a -20 ° C.
- Alícuota de la cromatina en el número de direcciones IP que se harán en el experimento.
- Añadir 2 g de anticuerpo por ug 1-10 de la cromatina a cada muestra.
- Incubar toda la noche 4 º C con rotación.
- Añadir 100 l de cuentas bloqueadas a cada muestra IP.
- Incubar durante 1 hora a 4 ° C con rotación.
- Pellet las perlas por hilatura hacia abajo a 800 rpm durante 1 min y desechar tanto del sobrenadante como sea posible.
- Lávese las cuentas una vez con sal baja Inmune tampón de lavado Complex. Añadir 1 ml de tampón a cada tubo; girar a temperatura ambiente durante 5-8 min; girar hacia abajo a 800 rpm durante 1 min, a continuación, eliminar el sobrenadante. Repetir el lavado una vez con sal de alta Inmune tampón de lavado y el tampón de lavado Complejo complejo inmunológico LiCl y dos veces con tampón TE para un total de 5 lavados (Tabla 2).
7. Elución
- Descongelar las muestras de entrada a partir del día anterior a procesar con los eluyentes.
- Hacer elución Tampón A nuevo (Tabla 3).
- Hacer una mezcla maestra de suficiente tampón de elución necesario para IPs y muestras de control de entrada más 1-2 muestras adicionales.
- Añadir 100 l de tampón de elución a cada muestra de IP e incubar a temperatura ambiente durante 15 mcon rotación.
- Centrifugar a 800 rpm durante 1 min y añadir sobrenadante a un tubo nuevo.
- Añadir otra 100 l de tampón de elución a cada tubo de bolas y se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación.
- Vortex durante 15 segundos después de la incubación; centrifugar a 5.000 rpm durante 1 min, a continuación, combinar el sobrenadante con el sobrenadante de la primera elución. (Asegúrese de que no existen sobrantes cuentas en los sobrenadantes. Si no está seguro, la desaceleración sobrenadante de nuevo a 5.000 rpm durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.
- Añadir 180 l de tampón de elución al 20 l de muestras de control de entrada.
8. Cross-link inversa
- Para los 200 l de eluyentes y controles de entrada, agregue 8 l de 5 M NaCl.
- Tubos sello con parafilm y se incuba en un baño de agua a 65 ° C durante la noche.
9. Purificación de ADN
- Tratar a cada muestra con 1 l de RNasa A durante 1 hora a 37 ° C.
- Añadir 4 μl de EDTA 0,5 M, 8 l 1 M Tris-HCl, la mezcla, a continuación, añadir 1 l de proteinasa K a cada muestra y se incuba a 45 ° C durante 2 horas.
- Purificar las muestras usando kit de purificación QIAquick PCR. Las muestras pueden guardarse a -20 ° C y verificación PCR se puede hacer en una fecha posterior.
* Alternativamente, perlas magnéticas chip-grado se pueden utilizar en lugar de agarosa para la porción de inmunoprecipitación.
10. Cheque PCR
- Para la comprobación de PCR, use cebadores para las regiones que se sabe están obligados por la proteína de interés. Asimismo, el uso cebadores para las regiones no vinculantes como controles negativos.
- Mezcle los reactivos para la reacción. Diluir la muestra de entrada a 1:100 (Tabla 3).
- Ejecutar reacción. Programa de PCR:
Paso 1: 94 ° C 3 min
Paso 2: 94 ° C 20 seg
59 ° C 30 seg
72 ° C 30 seg
(Repita el paso 2 durante al menos 30 cycles)
Paso 3: 72 ° C 2 min
- Corra las muestras en gel de agarosa 1%.
- Enriquecimiento también se puede determinar cuantitativamente con PCR en tiempo real.
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Representative Results
Una vez que la cromatina se ha sonicó y han sido tratados con RNasa y proteinasa, las muestras se ejecutan en el gel de agarosa al 2% deben presentar un frotis con la mayor parte del ADN en el tamaño deseado. Si se prueban varios ciclos diferentes, una disminución gradual en el tamaño debe ser visto como el número de ciclos de aumento (Figura 2).
Después de completar la porción de inmunoprecipitación del protocolo el enriquecimiento o bien se puede comprobar por PCR o PCR en tiempo real. Para las muestras de PCR se ejecutan en un gel de agarosa debe haber bandas en la entrada y chip (utilizando el anticuerpo para la proteína de interés, que es TCF7L2 en este caso) carriles de muestra y nada o a lo sumo, una banda muy débil (ruido de fondo) en el IgG (negativo) Una vía de control de la región de unión positiva. Para la región de unión negativo no debe ser muy débil o ninguna banda para el control de IgG y carriles de chip. No debe haber una banda en el carril de entrada (Figura 3).
La Figura 4 muestra las mismas muestras examinadas por PCR en tiempo real. Al igual que con la figura anterior, debería haber un veces enriquecimiento significativo de la región de unión positiva para la muestra de patata frita sobre la IgG de control. Además, no debe ser muy poco enriquecimiento, en su caso, visto en la región de unión negativo.
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de chip. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Gel comprobación de ultrasonidos ADN.
Figura 3. PCR La comprobación del chip.
La Figura 4. PCR en tiempo real de TCF7L2 chip.
| Reactivo | Volumen |
| Sedimento de perlas | 300 l |
| BSA (50 mg / ml) | 30 l |
| 100X inhibidor de la proteinasa | 10 l |
| Tampón de dilución chip | 660 l |
| Total | 1000 l |
Tabla 1. Receta para el bloqueo de agarosa.
| Buffer | Componentes |
| Sal baja Inmune tampón de lavado Complex | 0,1% de SDS 1% de Triton X-100 2 mM de EDTA Tris-HCl 20 mM, pH 8,1 150 mM de NaCl |
| Salinidad Inmune tampón de lavado Complex | 0,1% de SDS 1% de Triton X-100 2 mM de EDTA Tris-HCl 20 mM, pH 8,1 500 mM de NaCl |
| LiCl Inmune tampón de lavado Complex | 0,25 M LiCl 1% de NP-40 1% de desoxicolato 1 mM de EDTA Tris-HCl 10 mM, pH 8,1 |
| Tampón TE | Tris-HCl 10 mM, pH 8,1 1 mM de EDTA pH 8,0 |
Tabla 2. Tampones de lavado chip.
| Reactivo | Volumen |
| 10 l | |
| 1 M NaHCO3 | 20 l |
| H 2 O | 170 l |
Tabla 3. Tampón de elución para una dirección IP.
| Reactivo | 50 l Reacción | 20 l Reacción |
| Agua | 27 l | 10,8 l |
| 5X tampón de reacción de PCR | 10 l | 4 l |
| MgCl 2 | 4 l | 1,6 l |
| dNTP (10 mM) | 1 l | 0,4 l |
| Mezcla Primer (5 uM cada uno) | 2 l | 0,8 l |
| Taq (Promega hot start) | 1 l </ Td> | 0,4 l |
| Chip de ADN | 5 l | 2 l |
Tabla 4. Volúmenes de reacción de PCR.
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Discussion
Ahora es posible llevar a cabo un genoma en todo el perfil de asociación interacciones proteína-ADN utilizando chip-ss, como se ha demostrado muy recientemente con otros factores de transcripción 2,3. La clave para un resultado exitoso secuenciación es la generación de una cromatina immunoprecipitation molde de ADN de alta calidad.
Una vez que la plantilla de ADN se ha generado y se cercioró de ser enriquecido adecuada, uno puede entonces tomar en preparación biblioteca para posterior secuenciación. Por ejemplo, se puede utilizar el protocolo biblioteca secuenciación proporcionada por el vendedor, Illumina. La selección del tamaño de esta biblioteca se puede realizar mediante electroforesis en gel y posterior escisión y purificación de ADN en el ~ 200 - a la gama de 700-pb. La reducción del tamaño y reduciendo el intervalo de tamaño de ADN recogidas de la purificación en gel está destinado a mejorar la resolución de posición de chip-ss. Por enriquecedora para piezas más pequeñas de ADN de entrada con destino al factor de interest, sería de esperar que la ubicación del sitio ganará resolución. Selección de tamaño más estrecha también mejora la uniformidad de tamaño de las colonias moleculares producidos en la plataforma Illumina. Tal uniformidad de tamaño colonia también aumenta el número de lectura efectiva obtenida. De entrada en corto de tamaño de ADN también produce colonias más robustas en la plataforma Illumina, y esto puede significar que las piezas más cortas de ADN dentro de cualquier distribución de la muestra de entrada dado estarán representados de manera más eficiente en la salida secuencia final son piezas de entrada más largos de la misma distribución.
Los enfoques bioinformáticas para el análisis de secuencia de "próxima generación" están en continua evolución, con muchos vendedores hacen su software de código abierto para un mayor refinamiento. Uno puede transformar las lecturas que se asignan a ubicaciones genómicas únicas en un fragmento de ADN de solapamiento perfil. Los picos significativos se pueden identificar por perfiles threshholding a una altura equivalente a una tasa de falso descubrimiento estimado. La posición spmatrices de frecuencia ecific derivados de este trabajo se pueden utilizar para identificar y localizar los sitios de unión de ADN de todo el genoma humano para un factor dado.
Pero hay que tener cuidado con respecto a los factores que se desea estudiar con chip-ss. Antes de embarcarse en un estudio de este tipo se debe evaluar si un anticuerpo que está disponible en el mercado que se puede utilizar en el entorno de chips, como un anticuerpo pobre puede tener efectos muy perjudiciales sobre uno de los resultados experimentales. Además, se debe considerar si existen isoformas de empalme de la proteína en estudio y, de hecho, TCF7L2 se sabe que tiene muchas isoformas así que estábamos especial cuidado en la selección de un anticuerpo que se une a los aminoácidos consistentemente presentes en todas las isoformas principales de este factor de transcripción 25.
En resumen, la combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o c dadoline ell. Hemos esbozado cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El trabajo es apoyado por una concesión del Instituto de Desarrollo del Hospital de Niños de Filadelfia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| EZ-ChIP Kit | Millipore | 17-371 | |
| GoTaq Hot Start Polymerase | Promega | M5001 | |
| Misonix Sonicator | Qsonica | XL-2000 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo-Scientific | ||
| Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3' Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3' |
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