Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

أرجينين-فاسوبريسين (AVP) تسيطر على صقل الجسم توازن المياه من خلال تسهيل استيعاب المياه بواسطة الخلايا الرئيسية الكلوي. هنا، نقدم بروتوكول لزراعة النخاع الفئران الداخلية الابتدائي جمع خلايا القناة مناسبة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء إعادة امتصاص الماء AVP بوساطة.

Abstract

أرجينين-فاسوبريسين (AVP) يسهل إعادة امتصاص الماء بواسطة الكلى جمع الخلايا الرئيسية لاصق، وبالتالي غرامة الإيقاعات الجسم توازن الماء. AVP تربط لمستقبلات V2 فاسوبريسين (V2R) على سطح الخلايا وبالتالي يدفع توليف المخيم. هذا يحفز عمليات الإشارات الخلوية مما يؤدي إلى تغييرات في الفسفرة من قناة المياه aquaporin-2 (AQP2). بروتين كيناز A phoshorylates AQP2 وبالتالي يتسبب في إزفاء من AQP2 من حويصلات داخل الخلايا في غشاء البلازما تسهيل استيعاب الماء من البول الابتدائي. الانحرافات الإفراج AVP من إشارات النخامية أو AVP تنشيط في الخلايا الرئيسية يمكن أن يسبب مرض السكري الكاذب المركزي أو كلوي، على التوالي؛ يرتبط على الدم مرتفعة البلازما مستوى AVP مع أمراض القلب والأوعية الدموية مثل قصور القلب المزمن ومتلازمة غير لائق المضاد لإدرار البول إفراز الهرمون.

هنا، نقدم بروتوكول للcultivatiعلى من الفئران النخاعية الداخلية الابتدائي جمع مجاري الهواء (IMCD) الخلايا والتي تعبر V2R وAQP2 التطور الطبيعي. الخلايا هي مناسبة لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء سيطرة AQP2 وبالتالي لاكتشاف الأهداف المخدرات رواية لعلاج الأمراض المرتبطة التقلبات من استيعاب المياه AVP بوساطة. ويتم الحصول على الخلايا IMCD من الفئران للنخاع الداخلية الكلوي وتستخدم للتجارب بعد ستة إلى ثمانية أيام البذر. يمكن تربيتها خلايا IMCD في الأطباق العادية خلية ثقافة والقوارير واللوحات عيار الصغرى من الأشكال المختلفة، فإن الإجراء يتطلب بضع ساعات فقط، وغير مناسبة للمختبرات زراعة الخلايا القياسية.

Introduction

في الكلى جمع الخلايا الرئيسية لاصق، أرجينين-فاسوبريسين (AVP) تسيطر على استيعاب المياه من خلال تحفيز الإدراج من الماء قناة aquaporin-2 (AQP2) في غشاء البلازما. AVP بربط البروتين يقترن G فاسوبريسين نوع 2 مستقبلات (V2R) تحفيز محلقة أدينيليل وبالتالي تشكيل المخيم. بدء هذه السلسلة يشير يؤدي إلى تنشيط بروتين كيناز ألف (PKA). PKA phosphorylates AQP2 في سيرين 256 (S256)، والذي هو المحرك الرئيسي لإعادة توزيعها في الفترة من حويصلات داخل الخلايا في غشاء البلازما. إدراج غشاء يسهل استيعاب المياه على طول الانحدار ناضح وغرامة الإيقاعات الجسم التوازن المياه.

ويرتبط التقلبات من استيعاب المياه AVP بوساطة، وذلك بسبب الانحرافات من إفراز AVP أو أسباب إشارات AVP تنشيط أو يعانون من أمراض حادة. انخفضت استيعاب المياه التي تسببها طفرات من V2R أو AQP2 يؤدي إلى مرض السكري الكاذب كلوي، في حين أن ELEVويرتبط انبعاث العوادم بلازما الدم مستوى AVP مع استيعاب المفرط للمياه في أمراض القلب والأوعية الدموية مثل قصور القلب المزمن ومتلازمة غير لائق المضاد لإدرار البول إفراز هرمون (SIADH).

أهمية استيعاب المياه AVP بوساطة لا ينبع فقط من آثاره في المرض. وإزفاء AVP التي يسببها من الحويصلات AQP2 الحاملة لوالانصهار مع غشاء البلازما يمثل عملية exocytic بدقة مخيم معتمدة، وهو حاليا غير مفهومة جيدا. أمثلة أخرى لإيماس التي تعتمد على المخيم إفراز الرينين في الكلى وH + إفراز في المعدة. ولذلك، توضيح من الآليات الجزيئية التي تنظم AQP2-إزفاء في الخلايا الرئيسية الكلوي لا يساعد فقط على فهم العمليات الجزيئية مماثلة في أنواع الخلايا الأخرى ولكن أيضا قد يمهد الطريق لعلاجات جديدة لعلاج الأمراض المرتبطة اضطرابات من استيعاب المياه AVP بوساطة .

Elucidating آليات السيطرة AQP2 يتطلب جمع القناة نماذج الخلية الرئيسية. لهذا عدد من مختلف الثدييات خطوط الخلايا الكلى متوفرة. ومع ذلك، هذه النماذج لديها العديد من السلبيات. في كثير من النظم خلية مستوى البروتين من AQP2 منخفضة (الجدول 1؛ M1، HEK293، COS-7، MDCK، LLC-PK1) 1-10، والبعض الآخر ectopically overexpress الإنسان (MCD4، WT10) 11،12 أو الفئران (CD8) 13 AQP2. في MCD4 وCOS-7 الخلايا لا يتم التعبير عن مستقبلات V2. على حد علمنا ليس هناك خط خلية دائمة كنموذج المتاحة، والتي هي مستمدة من النخاعية الداخلية الكلى جمع القناة، أن جزءا من الكلى حيث AQP2 التعبير هو الأكثر وفرة، ولكن من القشرية جمع القناة 1،11،13-16 . نماذج الخلية مثل هذه هي على سبيل المثال تستخدم على نطاق واسع خلد mpkCCD (مثلا 17) أو mTERT-CCD 14 خطوط الخلايا التي أنشئت مؤخرا. كلا الخطين الخلية التطور الطبيعي صريحة AQP2 ولكن منذ V2R أنها مشتقة منالقشرية القناة جمع الأرجح تحتوي على بروتيوم مختلفة مقارنة النخاعية الداخلية جمع مجاري الهواء (IMCD) الخلايا. يجب عليهم على سبيل المثال التعبير عن مختلف نا + أنظمة النقل.

هنا، نقدم بروتوكول لثقافة الخلايا IMCD الابتدائية تعبر عن V2R وAQP2 التطور الطبيعي. هذا النموذج، وبالتالي، يمثل أكثر عن كثب الوضع الفسيولوجية في القناة جمع الكلوي. كما يتطلب إنشاء ثقافة فقط المعدات المختبرية القياسية مختبرات أخرى يمكن اعتماد هذا النهج بسهولة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد

  1. إعداد أطباق ثقافة
    1. ذوبان الكولاجين النوع الرابع O / N عند 4 ° C وحلها في 0.1٪ حامض الخليك العقيمة. حجم لاستخدام يعتمد على نوع وعدد من الأطباق التي كانت الخلايا ليكون المصنف. استخدام 2 ميكروغرام / سم 2.
    2. احتضان الأطباق على الأقل لمدة 1 ساعة على RT ويغسل مرتين مع الماء المقطر (A. tridest).
    3. السماح للأطباق لتجف بشكل صحيح.
  2. مكملات من المتوسطة
    1. زيادة مستوى الجلوكوز يصل إلى 4.5 جرام / لتر وذلك بإضافة 1.75 ز الجلوكوز إلى 500 مل المتوسطة. لضبط المتوسطة إلى 600 mosmol، إضافة 100 ملي مول كلوريد الصوديوم واليوريا 100 ملم، لزيادة الأسمولية بنسبة 200 mosmol و 100 mosmol، على التوالي.
    2. إضافة 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ ultroser، 500 DBcAMP ميكرومتر، 20 U / مل نيستاتين و 0.25 ميكروغرام / مل جنتاميسين (1:200 التخفيف من محلول المخزون مع تركيز 50 ميكروغرام / مل) إلى 600 mosmol DMEM المتوسطة طازجة في اليوم من التحضير.
    حل انزيم
    1. إضافة 1 ملغ / مل هيالورونيداز و 2.2 ملغ / مل كولاجيناز إلى DPBS المحتوية على 0.25 ميكروغرام / مل جنتاميسين والنيستاتين. إعداد 1 مل من هذا الحل انزيم لهضم 2 الكلى للنخاع الداخلية. يجب تعقيم الحل عن طريق الترشيح ويتم تخزينها في 50 مل أنابيب فالكون.

2. زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع مجاري الهواء (IMCD) خلايا

جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات هي التي يتعين الاضطلاع بها في الامتثال للتشريعات المحلية والاتحادية.

  1. تخدير الفئران في CO 2 (في مربع مشبعة CO 2) أو isoflurane و(U-400 وحدة التخدير، Univentor المحدودة، مالطة؛ تدفق الهواء 350-400 مل / دقيقة مع 2-2.5٪ isoflurane و). قطع رأس الحيوانات لوقف نزيف الذي يسمح الكشف الدقيق للحدود بين بيضاء الداخلية والنخاع الخارجي أكثر قتامة. وبالإضافة إلى ذلك، النزيف يقلل من عدد كرات الدم الحمراء المعزولة. إزالة الكلى وغسلها في DPBS العقيمة تستكمل مع الجنتاميسين والنيستاتين (انظر أعلاه) على الجليد. جميع خطوات أخرى هي التي يتعين الاضطلاع بها تحت ظروف معقمة مقاعد البدلاء النظيفة.
  2. نقل الكلى من حل DPBS على ضغط معقمة لإزالة السائل الزائد. إزالة الكبسولة الكلى الدهنية مع ملقط معقم، ومقص.
  3. وبعد أن زال الكلى ثابتة في ضغط، وقطع قليلا بجانب المحور الطولي للجانب الخارجي (القشرية). تأكد من عدم قطع طريق تماما، ولكن ترك الأمر في قطعة واحدة، مرتبطة في الحوض الكلوي.
  4. مع مقص منحني تشريح بعناية للنخاع الداخلية بيضاء، والتي تحيط بها النخاع الخارجي متلألئ روز. جمعها في DPBS، التي تحتوي على جنتاميسين والنيستاتين في 60 ملم صحن الثقافة على الجليد.
  5. مرة واحدة يتم عزل جميع للنخاع والتي تم جمعها على الجليد، والحد من حجم DPBS إلى مستوى حيث يتم تغطيتها فقط مع العازلة. استخدام razorblade معقمة لقطع للنخاع إلى مكعبات من 5مم 3.
  6. تذوب وجولة على نهاية حادة من العقيمة باستور ماصة عن طريق إمساكه لفترة وجيزة في لهب. تأكد يتم تبريد ماصة قبل المتابعة.
  7. نقل تعليق الأنسجة إلى 50 مل أنابيب فالكون يحتوي الطازجة حل انزيم العقيمة مع هيالورونيداز وكولاجيناز (انظر 1.3.1) باستخدام مدورة ماصة باستير. إغلاق الغطاء بإحكام واحتضان عند 37 درجة مئوية في إطار التحريض المستمر (220 دورة في الدقيقة) في حمام المياه العادية الطاولة ل1،5-2 ساعة.
  8. لسحن لتعليق، ماصة الخليط صعودا وهبوطا عدة مرات مع الجولة ماصة باستير (انظر أعلاه) حتى يصبح عكر متجانس تعليق.
  9. الطرد المركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 300 XG و 16 درجة مئوية. تجاهل طاف، resuspend الكرية جيدا في DPBS، التي تحتوي على جنتاميسين والنيستاتين وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. كرر هذه الخطوة غسل مرة واحدة.
  10. resuspend الخلايا في المتوسط ​​تستكمل بالكامل والبذور لهم في جأطباق ulture و / أو لوحات جيدا عيار الصغرى. وإعداد 2 للنخاع (1 الحيوان) تسفر عن خلايا كافية لواحد صحن الثقافة 60 ملم.
  11. بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مرتين مع 600 mosmol DMEM وإضافة المتوسطة الطازجة. خلال الأسبوع المقبل وينبغي غسل الخلايا 2-3 مرات (الشكل 1). بعد 6-8 أيام البذر، وخلايا IMCD يمكن استخدامها لإجراء التجارب. تذكر لاحتضان لهم في وسيط وبدون DBcAMP ونيستاتين لمدة 24 ساعة قبل بدء التجربة. وإلا AQP2 سوف يكون موجودا حصرا في غشاء البلازما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فإن زراعة ناجحة لخلايا الفئران IMCD الأولية يؤدي إلى أحادي الطبقة متموجة بعد 6-8 أيام البذر (الشكل 2). لكل 60 مم طبق الثقافة هناك ما يقرب من 6 × 10 6 خلايا. الخلايا التمسك بإحكام إلى أطباق ثقافة، كما كانت مغلفة هذه مع الكولاجين النوع الرابع، وهو أحد مكونات الغشاء القاعدي 18. ولذلك، فإن الخلايا IMCD لا فصل حتى خلال عدة إجراءات الغسل الكامل. ما يصل إلى 80٪ من الخلايا المستزرعة التعبير عن V2R التطور الطبيعي وAQP2. هذه هي الخلايا الرئيسية، في حين تعتبر الخلايا التي تفتقر AQP2 الخلايا مقحم، وخلايا غير IMCD المستمدة من أطرافه رقيقة من حلقة من هنلي، الأوعية المستقيمة أو الداخلية الخلايا الخلالي النخاع. كما بينا سابقا، فإن الأسمولية المتوسطة من 600 mosmol يمنع أسفل تنظيم AQP2 19. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الاحتفاظ AQP2 التعبير من خلال استكمال المتوسطة مع المخيم غشاء نفاذية التماثلية DBcAMP. للحد من AQP2 البلازما MEMBيجب أن تبقى التعبير RANE وبالتالي لصالح توطين الخلايا في الخلايا IMCD دون DBcAMP ما يقرب من 24 ساعة قبل التجارب. إذا تم ترجمة معظم AQP2 في غشاء البلازما في ظل ظروف السيطرة، ينبغي تمديد الوقت من زراعة خالية من DBcAMP. تحلل الخلايا التي تزرع في 60 ملم الأطباق الثقافة في مخازن القياسية ينتج 1.5 ملغ من البروتين 10.

على التحفيز على المدى القصير (30 دقيقة) مع AVP أو forskolin، منشط مباشرة من أدينيليل محلقة، AQP2 translocates من حويصلات داخل الخلايا لغشاء البلازما (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، AQP2 التعبير في الخلايا IMCD يزيد على تحديا 30 دقيقة مع AVP أو forskolin (الشكل 3) 10. الزيادة في وفرة AQP2 مستقلة عن تعزيز النسخ والترجمة. Forskolin أو AVP التحفيز يؤدي إلى تثبيط P38-mitogen تنشيط بروتين كيناز (P38-MAPK)، الذي يرتبط مع انخفاض في مستوى فhosphorylation في سيرين 261 من AQP2 وانخفاض لها بولي ubiquitination. وهكذا، ويرجع زيادة AQP2 فرة على التحفيز إلى انخفاض تدهور proteasomal 10. أخذت معا، وخلايا IMCD تسمح بالتحقيق في آليات السيطرة على AQP2.

خط الخلية كائن حي عدد آي تي سي سي أو مرجع
كاكي الإنسان العاقل HTB-46
CD8 الإنسان العاقل فالنتي وآخرون، 1996 13
COS-7 القردوح aethiops CRL-1651
HEK293 الإنسان العاقل CRL-1573
LLC-PKI SUS scrofa CL-101
M1 المصحف العضلة CRL -2038
MCD4 المصحف العضلة Iolascon وآخرون، 2007 11
MDCK كلب familiaris CRL-2935
mpkCCD المصحف العضلة بنس وآخرون، 1999 15، هاسلر وآخرون 2002 16
mTERT-CCD المصحف العضلة ستيل وآخرون.، 2010 14
WT10 كلب familiaris الدين وآخرون، 1997 12

الجدول 1. الثدييات خطوط الخلايا الكلى للدراسات آليات الرقابة AQP2. الخلايا كاكي، mpkCCD وmTERT-CCD التعبير عن AQP2 التطور الطبيعي. في COS-7، HEK293، LLC-PK1، M1 وخطوط الخلايا MDCK، AQP2 هو بالكاد يمكن كشفها. CD8، MCD4 وWT10 الخلايا overexpress AQP2 ectopically.

س: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. التمثيل التخطيطي لإجراء لإنشاء مزارع الخلايا IMCD. المبينة هي ترتيب الخطوات التجريبية وأيام الأسبوع فضل لهذه التجارب. هي المصنفة الخلايا IMCD الفئران الابتدائي يوم 0 و 1 أسبوع في وقت لاحق وتستخدم لإجراء التجارب. أرقام بين قوسين تشير إلى الخطوات التجريبية منها صفها تحت عنوان "البروتوكول".

الشكل 2
الشكل 2. تركت AQP2 يدرج في غشاء البلازما على التحفيز مع AVP أو forskolin. الخلايا IMCD في ظل ظروف السيطرة أو إما حفز مع 100 نانومتر AVP أو 10 ميكرومتر forskolin لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وقد تم تحليل الخلايا بواسطة المجهر المناعي كما تنازليribed قبل (LSM 710؛ كارل زايس MicroImaging، جينا، ألمانيا) 10. نوى كانت تصور مع دابي، تم الكشف عن AQP2 مع الأجسام المضادة حسب الطلب (أحمر؛ الضد H27) 20،21. لوحة العلوي والمسح الضوئي XY؛ اللوحة السفلى، XZ بالاشعة. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر.

الشكل (3)
الشكل (3). تركت AQP2 الزيادات وفرة البروتين على التحفيز مع فاسوبريسين (AVP) وforskolin. الخلايا غير المعالجة IMCD (UTR) أو إما حفز مع 100 نانومتر AVP (A) أو 10 ميكرومتر forskolin (F) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. و lysed الخلايا وتم الكشف عن مجمع الغليكوزيلاتي (AQP2 CG)، وارتفاع المانوز (AQP2 HM) وغير AQP2 الغليكوزيلاتي (AQP2 نانوغرام) بواسطة طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة المحددة ضد AQP2 (SC-9882، سانتا كروز) كما هو موضح سابقا 10. كعنصر تحكم التحميل تم الكشف α-تويولين (CP06، Calbiochem). يظهر هو نتيجة ممثل من> 3 هxperiments. يشار إلى الأوزان الجزيئية (كيلو دالتون).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم بروتوكول مفصلة لإعداد وزراعة الخلايا IMCD الفئران الأولية. النهج غلة تصل إلى 21 سم 2 من الخلايا من الفئران واحدة 20. التجربة يتطلب معيار معدات زراعة الخلايا ويمكن أن يقوم بها شخص واحد في غضون ما يقرب من 6 ساعة. ولذلك، فإن هذا النهج هو مناسبة كوسيلة المختبر القياسية.

يمكن المصنف الخلايا الأولية IMCD الفئران في أطباق ثقافة حجم مختلفة، تتراوح ما بين 96 إلى 60 لوحات جيدة ملم الأطباق. ومع ذلك، للنمو في 384 شكل جيد الإجراء يتطلب التحسين. نحن تجنب استخدام أطباق أكبر من 60 ملم كما تباطأ النمو. الخلايا هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التجارب مثل ويسترن النشاف، مناعي، DNA / RNA العزلة، المجهري المناعي، كا 2 + التصوير والكهربية 10،22،23.

حوالي 6-8 أيام بعد البذر، وتزرع الخلايا IMCD الأولية إلى confluent أحادي الطبقة (الشكل 2). ارتفاع الخلية هو 3 - يتم إرفاق بإحكام 5 ميكرومتر في المتوسط ​​24 عاما، والخلايا والحفاظ على مستوى عال من الذاتية AQP2 التعبير. الكشف المجهري المناعي من AQP2 يشير إلى أن ما يصل إلى 80٪ من الخلايا تمثل خلايا الرئيسي إيجابية AQP2 (الشكل 3؛ 10،20). شكليا وتتميز الخلايا عن طريق طويلة، والحدود مستقيم خلية، نواة جزءا لا يتجزأ في السيتوبلازم مع 1-3 الأنوية، والعديد من حبيبات هيولية بارز 20. لم لا لبس فيه تم تحديد هوية 20٪ الخلايا AQP2 السلبية المتبقية في الثقافة. ماريتش وآخرون. نفذت على النقيض من المرحلة المجهري والتحليل المجهري المناعي من منعطفات ضيقة لتصور حدود الخلية 20. في الخلايا AQP2 سلبية لاحظوا حدود الخلية المنحني مع المسافات البادئة وinvaginations إلى زنازينهم المجاورة ونواة جاحظ مع أحد نوية. BASإد على هذا التشكل والتي تختلف عن تلك التي إيجابية الخلايا AQP2، ماريتش وآخرون. اقترح أن غالبية الخلايا AQP2 سلبية ومقحم الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الثقافة على ما يبدو يحتوي على عدد قليل من الخلايا الليفية 20. فإنها تصبح واضحة فقط إذا تزرع الثقافات لأكثر من 10 أيام عندما تبدأ هذه الخلايا زيادة في النمو الخلايا الرئيسية. تحت ثقافتنا حالة الخلايا الليفية لا تعرض مظهر الخلايا الليفية النموذجية. في خط، Gonzalzez وآخرون. العثور على خلايا الخلالية في مزارع الخلايا الأولية IMCD مماثلة بعد 5-8 أيام البذر 25.

الابتدائي الثقافات الخلية IMCD أعدت بطرق مختلفة قليلا ولكن التي تمتلك خصائص مشابهة كما تستخدم تلك المذكورة أعلاه في مختبرات أخرى. على سبيل المثال، تشو وآخرون. بذور الخلايا IMCD أساسي على السطوح البلاستيكية التي لم يتم المغلفة مع الكولاجين 26. الخلايا الأولية IMCD أعدت وفقا لبروتوكول يبدو إما من جودة عالية مماثلةكما على سبيل المثال على حد سواء هي مناسبة لداخل الخلايا كا 2 + القياسات 22،23،26. تم الحصول على قوائم شاملة من mRNAs والبروتينات وأعرب في الخلايا IMCD الأولية من النسخي باستخدام تكنولوجيا Affimetrix 27 والكتلة الطيفي التحليل بروتيوم 28 (انظر أيضا http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

وتشمل القيود المفروضة على الخلايا IMCD الأولية، كما لكثير من الخلايا الأولية، فإن معدل ترنسفكأيشن منخفضة (1٪ ≈ 29). وهكذا overexpression من البروتينات هو تقريبا ممكن فقط إذا كان البلازميدات ترميز أو البروتينات يتم microinjected أنفسهم (على سبيل المثال 30). وثمة قيد آخر هو عدم وجود قطبية الخلوية السليم للخلايا IMCD الأولية. وردا على AVP، AQP2 translocates الغالب في غشاء البلازما basolateral (الشكل 2). لدينا تجارب للحث على قطبية الصحيح، اي

أخذت معا، وخلايا IMCD الأولية، التي أنشئت كما هو موضح أعلاه، تمتلك آلية للسيطرة على AQP2 وبالتالي فهي نموذج مناسب لدراسة AQP2 التنظيم. غير أن استخدامها يتطلب الحيوانات، وينبغي بالتالي أن يقتصر على التجارب التي لا يمكن القيام بها في الأنظمة الأخرى المعمول بها نموذج (انظر أعلاه) وللتأكد من صحة النتائج التي تم الحصول عليها في النظم نموذج آخر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG؛ KL 1415/3-2 وKL 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Tags

البيولوجيا الخلوية، العدد 76، الهندسة الحيوية، علم الوراثة، علم الأحياء الجزيئية، الكيمياء الحيوية، الهندسة الطبية الحيوية، الطب، الصيدلة، والببتيدات والبروتينات اشارة بين الخلايا، الإيماس، نقل الإشارة، ونظم رسول الثانية، مما يشير إلى الكالسيوم، أمراض القلب والأوعية الدموية والهرمونات وهرمون البدلاء، وهرمون الخصوم، العلوم الحياتية (العامة)، إعادة امتصاص الماء، الكلى، وخلايا رئيسية، فاسوبريسين، دوري امبير، aquaporin، نموذج حيواني، ثقافة الخلية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

زراعة النخاع الابتدائية الجرذ الداخلية جمع خلايا القناة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter