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Biology

El cultivo primarios de rata medular interna recolección de células del conducto

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

La arginina-vasopresina (AVP) controla la puesta a punto de la homeostasis del agua corporal facilitando la reabsorción de agua por las células principales renales. A continuación, se presenta un protocolo para el cultivo de la rata medular interna primaria recoger células de los conductos adecuados para la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la reabsorción de agua AVP-mediada.

Abstract

La arginina-vasopresina (AVP) facilita la reabsorción de agua por la recolección de células renales principales conductos y por lo tanto un ajuste fino de la homeostasis del agua corporal. AVP se une a los receptores de vasopresina V2 (V2R) sobre la superficie de las células y por lo tanto induce la síntesis de AMPc. Esto estimula los procesos de señalización celular que conducen a cambios en la fosforilación del canal de agua acuaporina 2 (AQP2). Proteína quinasa A phoshorylates AQP2 y de ese modo provoca la translocación de AQP2 de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática facilitar la reabsorción de agua de la orina primaria. Las aberraciones de la liberación de AVP de la señalización de la pituitaria o AVP-activado en las células principales pueden causar diabetes insípida central o nefrogénica, respectivamente; un elevado nivel de sangre AVP plasmática se asocia con enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca crónica y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética.

A continuación, presentamos un protocolo para cultivatiel de la rata medular interna primaria recoger células del conducto (IMCD), que expresan V2R y AQP2 endógenamente. Las células son adecuados para elucidar los mecanismos moleculares que subyacen en el control de AQP2 y por lo tanto para descubrir nuevas dianas farmacológicas para el tratamiento de enfermedades asociadas con la disregulación de la reabsorción de agua AVP mediada. IMCD células se obtienen a partir de rata renal medullae interior y se utilizan para los experimentos de seis a ocho días después de la siembra. IMCD células pueden ser cultivadas en platos de cultivo de células regulares, matraces y placas de microtitulación de diferentes formatos, el procedimiento sólo requiere unas pocas horas, y es apropiado para laboratorios de cultivo celular estándar.

Introduction

En la recogida de las células principales de conductos renales, arginina-vasopresina (AVP) controla la reabsorción de agua mediante la estimulación de la inserción del canal de agua acuaporina 2 (AQP2) en la membrana plasmática. AVP se une a la proteína de acoplamiento de la vasopresina de tipo receptor de G-2 (V2R) estimulación de la adenilato ciclasa y por lo tanto la formación de AMPc. La iniciación de esta cascada de señalización que conduce a la activación de la proteína quinasa A (PKA). PKA fosforila AQP2 en la serina 256 (S256), que es la clave de activación para su redistribución de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática. La inserción en la membrana facilita la reabsorción de agua a lo largo de un gradiente osmótico y un ajuste fino de la homeostasis del agua corporal.

La desregulación de la reabsorción de agua AVP-mediada, debido a las aberraciones de la secreción de AVP AVP o causas de señalización activadas por o se asocia con enfermedades graves. Disminución de la reabsorción de agua causada por mutaciones de V2R o AQP2 conduce a la diabetes insípida nefrogénica, mientras que un elevsangre ATED nivel AVP plasmática se asocia con la reabsorción de agua excesiva en las enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca crónica y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética (SIADH).

La importancia de la reabsorción de agua AVP mediada deriva no sólo de su implicación en la enfermedad. La translocación inducida por AVP de vesículas AQP2-cojinete a y fusión con la membrana plasmática representa un proceso exocítica estrictamente dependiente de cAMP, que actualmente no se entiende bien. Otros ejemplos para una exocitosis dependiente de AMPc son la secreción de renina en el riñón y la secreción de H + en el estómago. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos moleculares que regulan la AQP2-translocación en células renales principales no sólo ayuda a entender los procesos moleculares similares en otros tipos de células, pero también puede allanar el camino para nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la reabsorción de agua AVP mediada .

Elucidating mecanismos AQP2 requiere el control de recogida de modelos celulares principales del conducto. Para esto un número de diferentes líneas celulares de riñón de mamífero están disponibles. Sin embargo, estos modelos tienen varios inconvenientes. En muchos sistemas de células el nivel de proteínas de AQP2 es baja (Tabla 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, otros ectópica sobreexpresan humanos (MCD4, WT10) 11,12 o de rata (CD8) 13 AQP2. En MCD4 y células COS-7 no se expresa el receptor V2. Para nuestro conocimiento no hay una línea celular permanente como un modelo disponible, que se deriva de la renal interior conducto colector medular, que parte del riñón donde AQP2 expresión es más abundante, pero desde el conducto colector cortical 1,11,13-16 . Tales modelos celulares son por ejemplo el utilizado las mTERT-CCD de 14 líneas celulares establecidas recientemente mpkCCD inmortalizado (por ejemplo 17) o. Ambas líneas celulares expresan endógenamente AQP2 y V2R, pero ya que se derivan de lostúbulo colector cortical probablemente contiene un proteoma diferente en comparación con centro medular recoger células del conducto (IMCD). Por ejemplo, se deben expresar diferentes Na + los sistemas de transporte.

A continuación, presentamos un protocolo de cultivo las células primarias que expresan IMCD V2R y AQP2 endógena. Este modelo, por lo tanto, representa más de cerca la situación fisiológica en el conducto colector renal. Como el establecimiento de la cultura requiere sólo equipo estándar de laboratorio otros laboratorios pueden adoptar fácilmente este método.

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Protocol

1. Preparación

  1. Preparación de las placas de cultivo
    1. Thaw colágeno tipo IV O / N a 4 ° C y se disuelven en 0,1% de ácido acético estéril. El volumen a utilizar depende del tipo y el número de platos en los que las células han de ser sembradas. Utilice 2 mg / cm 2.
    2. Incubar los platos por lo menos durante 1 hora a TA y se lava dos veces con agua destilada (A. tridest).
    3. Deje que los platos se sequen correctamente.
  2. La suplementación de medio
    1. Aumentar el nivel de glucosa de hasta 4,5 g / l mediante la adición de 1,75 g de glucosa a 500 ml de medio. Para ajustar el medio a 600 mOsmol, añadir NaCl 100 mM y urea 100 mM, para aumentar la osmolaridad de 200 mOsmol y 100 mOsmol, respectivamente.
    2. Añadir ácidos 1% aminoácidos no esenciales, 1% Ultroser, 500 dbcAMP mM, 20 U / ml de nistatina y 0,25 g / ml de gentamicina (dilución 1:200 de solución madre con una concentración de 50 g / ml) a 600 mOsmol medio DMEM recién en el día de la preparación.
    Solución de la enzima
    1. Añadir 1 mg / ml de hialuronidasa y 2,2 mg / ml de colagenasa a DPBS que contiene 0,25 mg / ml de gentamicina y nistatina. Preparar 1 ml de esta solución de la enzima para la digestión de 2 riñón medullae interior. La solución debe ser esterilizado por filtración y se almacena en tubos Falcon de 50 ml.

2. El cultivo de rata primaria medular interna recolección de células del conducto (IMCD)

Todos los procedimientos de manipulación de los animales se llevarán a cabo de conformidad con la legislación local y federal.

  1. Anestesiar ratas en CO 2 (en una caja saturada con CO 2) o isoflurano (U-400 Unidad de Anestesia, Univentor Ltd., Malta, el flujo de aire 350 a 400 ml / min con 2-2,5% isoflurano). Decapita a los animales para el sangrado, que permite la detección exacta de la frontera entre el interior y el blanquecino médula externa más oscura. Además, el sangrado se reduce al mínimo el número de eritrocitos aislados. Retire los riñones ylavarlos en DPBS estéril suplementado con gentamicina y nistatina (véase más arriba) en hielo. Todos los pasos adicionales se llevarán a cabo en condiciones estériles banco limpio.
  2. Transferir los riñones de la solución de DPBS en una compresa estéril para eliminar el exceso de líquido. Retire la cápsula del riñón graso con pinzas estériles y tijeras.
  3. Habiendo el riñón todavía fijado en la compresa, cortado ligeramente al lado del eje longitudinal de la parte exterior (cortical). Asegúrese de no cortar por completo, pero dejarlo en una sola pieza, conectado en la pelvis renal.
  4. Con tijeras curvas diseccionar cuidadosamente la medullae interior blanquecino, que están rodeados por la médula exterior brillante rosado. Recoger en DPBS que contiene gentamicina y nistatina en una placa de cultivo de 60 mm en el hielo.
  5. Una vez que todos medullae se aíslan y se recogió en hielo, reducir el volumen de DPBS a un nivel en el que están cubiertos sólo con tampón. Use una hoja de afeitar estéril para cortar el medullae en cubos de 5mm 3.
  6. Derretir y alrededor de la punta de una pipeta Pasteur estéril sosteniéndolo brevemente en una llama. Asegúrese de que la pipeta se enfría antes de continuar.
  7. Transferir la suspensión de tejido a los tubos Falcon de 50 ml que contenían solución de enzima estéril recién preparado con hialuronidasa y colagenasa (véase 1.3.1) mediante el uso de la redondeada pipeta Pasteur. Cierre la tapa fuertemente y se incuba a 37 ° C bajo agitación continua (220 rpm) en un baño de agua de mesa regular para 1,5 - 2 horas.
  8. Para la trituración de la suspensión, pipetear la mezcla arriba y abajo varias veces con la ronda pipeta Pasteur (véase más arriba) hasta que la suspensión turbia se vuelve homogénea.
  9. Centrifugar la suspensión durante 5 min a 300 xg y 16 ° C. Descartar el sobrenadante, resuspender el precipitado a fondo en DPBS, que contiene gentamicina y nistatina y centrifugar de nuevo. Repita este paso de lavado una vez.
  10. Resuspender las células en medio de ellos y de las semillas en c completamente suplementadoULTURA platos y / o placas de pocillos de microtitulación. La preparación de 2 medullae (1 animal) dará lugar a células suficientes para una placa de cultivo de 60 mm.
  11. Después de 24 horas, lavar las células dos veces con 600 mosmol DMEM y añadir medio fresco. Durante la siguiente semana las células se deben lavar 2-3 veces (Figura 1). 6-8 días después de la siembra, las células IMCD se pueden utilizar para los experimentos. Recuerde que los incuban en medio sin dbcAMP y nistatina durante 24 horas antes de comenzar el experimento. De lo contrario AQP2 se encuentra exclusivamente en la membrana plasmática.

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Representative Results

El cultivo exitoso de células IMCD primarios de rata se traducirá en una monocapa confluente 6-8 días después de la siembra (Figura 2). Per 60 mm placa de cultivo hay aproximadamente 6 x 10 6 células. Las células se adhieren firmemente a las placas de cultivo, ya que estos fueron recubiertas con colágeno tipo IV, un componente de la membrana basal 18. Por lo tanto, las células IMCD no separar incluso durante varios procedimientos de lavado a fondo. Hasta el 80% de las células cultivadas expresan endógenamente V2R y AQP2. Estas son las células principales, mientras que las células que carecen de AQP2 se consideran células intercaladas, células no-IMCD derivados de las extremidades delgadas de asa de Henle, vasos rectos o células intersticiales medulares interiores. Como hemos visto anteriormente, la osmolaridad medio de 600 mosmol impide la baja regulación de AQP2 19. Además, la expresión AQP2 se mantiene mediante la suplementación del medio con el AMPc membrana permeable al análogo dbcAMP. Para reducir el memb plasma AQP2Rane expresión y por lo tanto para favorecer su localización intracelular de las células IMCD deben mantenerse sin dbcAMP aproximadamente 24 horas antes de los experimentos. Si la mayoría de la AQP2 se localiza en la membrana plasmática en condiciones de control, el tiempo de cultivo dbcAMP-libre debe ser prolongado. La lisis de las células cultivadas en placas de cultivo de 60 mm en tampones estándar produce 1,5 mg de proteína 10.

Tras la estimulación a corto plazo (30 min) con AVP o forskolina, un activador directo de la adenilil ciclasa, AQP2 se transloca desde las vesículas intracelulares a la membrana plasmática (Figura 2). Además, AQP2 expresión en células IMCD aumenta en un 30 min desafío con AVP o forskolina (Figura 3) 10. El aumento de la abundancia AQP2 es independiente de una mayor transcripción y la traducción. La forskolina o AVP estimulación conduce a la inhibición de p38 activada por mitógenos-proteína-quinasa (p38-MAPK), que se asocia con una disminución en el nivel de phosphorylation en la serina 261 de AQP2 y una reducción en su poli-ubiquitinación. Por lo tanto, el aumento de AQP2 abundancia a la estimulación se atribuye a la disminución de la degradación proteasomal 10. En conjunto, las células IMCD permiten investigar los mecanismos que controlan AQP2.

La línea celular Organismo Número ATCC o referencia
CAKI Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al., 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et al., 1999 15, Hasler et al. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al., 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12

Tabla 1. Mamíferos líneas celulares de riñón de estudios de los mecanismos de control AQP2. Células CAKI, mpkCCD y mTERT-CCD AQP2 expresan endógenamente. En células COS-7, HEK293, líneas de células MDCK LLC-PK1, M1 y, AQP2 es difícilmente detectable. Células CD8, MCD4 y WT10 sobreexpresan AQP2 ectópica.


Figura 1. Representación esquemática del procedimiento para el establecimiento de cultivos de células IMCD. Mencionamos el orden de las etapas experimentales y los días de la semana preferidos para los experimentos. Células IMCD primarios de rata se siembran el día 0 y 1 semana más tarde se utilizan para los experimentos. Los números entre paréntesis se refieren a las medidas experimentales respectivos descritos en el "Protocolo".

La figura 2
Figura 2. AQP2 se inserta en la membrana plasmática a la estimulación con AVP o forskolina. IMCD células se dejaron en condiciones de control o bien se estimularon con 100 nM de AVP o forskolina 10 mM durante 30 min a 37 ° C. Las células se analizaron por microscopía de inmunofluorescencia como described antes (LSM 710, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Alemania) 10. Los núcleos se visualizaron con DAPI, AQP2 se detectó con un anticuerpo a medida (rojo, anticuerpo H27) 20,21. Panel superior, exploraciones xy, panel inferior, exploraciones xz. Barras de escala, 20 micras.

Figura 3
Figura 3. AQP2 aumentos de la abundancia de proteínas tras la estimulación con vasopresina (AVP) y la forskolina. IMCD células se dejaron sin tratar (UTR) o bien se estimularon con 100 nM de AVP (A) o 10 mM de forskolina (F) durante 30 min a 37 ° C. Las células se lisaron y complejo glicosilada (AQP2 cg), alta manosa (AQP2 hm) y no glicosilada AQP2 (AQP2 ng) se detectó por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos contra AQP2 (sc-9882, SantaCruz) como se ha descrito previamente 10. Como control de carga se detectó α-tubulina (CP06, Calbiochem). Se muestra un resultado representativo de> 3 experimentos. Se indican los pesos moleculares (kDa).

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Discussion

Se presenta un protocolo detallado para la preparación y el cultivo de células IMCD primarios de rata. El enfoque produce hasta 21 cm 2 de las células de una rata 20. El experimento requiere un equipo de cultivo celular estándar y puede ser llevada a cabo por una sola persona dentro de aproximadamente 6 horas. Por lo tanto, este enfoque es adecuado como un método estándar de laboratorio.

Células IMCD primarios de rata se pueden sembrar en placas de cultivo de diferentes tamaños, que van desde placas de 96 pocillos a placas de 60 mm. Sin embargo, para el crecimiento en 384 formato bien el procedimiento requiere la optimización. Evitamos el uso de platos más grandes de 60 mm ya que el crecimiento se desaceleró. Las células son adecuados para una variedad de experimentos tales como transferencia Western, inmunoprecipitación, ADN / ARN aislamiento, microscopía de inmunofluorescencia, Ca 2 + de imágenes y electrofisiología 10,22,23.

Aproximadamente 6 a 8 días después de la siembra, las células IMCD primarios se cultivan a un confluentes monocapa (Figura 2). La altura de la celda es 3 - 5 micras en promedio 24, y las células están estrechamente unidos y mantener un alto nivel de expresión endógena AQP2. Detección microscópico de inmunofluorescencia de AQP2 indica que hasta el 80% de las células representan células principales AQP2-positivos (Figura 3; 10,20). Morfológicamente, las células se caracterizan por, bordes rectos largos de células, un núcleo incrustado en el citoplasma con uno a tres nucleolos, y varios gránulos citoplásmicos prominentes 20. La identidad de los 20% de células AQP2 negativos que quedan en la cultura de manera inequívoca que no se ha definido. Maric et al. Realizado microscopía de contraste de fase y el análisis microscópico de inmunofluorescencia de las uniones estrechas para visualizar los límites de la celda 20. En las células AQP2 negativos que observaron bordes de las celdas curvas con muescas y invaginaciones a sus células vecinas y un núcleo que sobresale con un nucléolo. Based en esta morfología que es distinta de la de las células AQP2-positivos, Maric et al. sugirió que la mayoría de las células AQP2-negativas se intercalan células. Además, la cultura aparentemente contiene pocos fibroblastos 20. Ellos sólo se hacen evidentes si los cultivos se hicieron crecer durante más de 10 días cuando estas células comienzan crecimiento excesivo de las células principales. En nuestra cultura, condiciones de fibroblastos no mostrar una apariencia típica de fibroblastos. En línea, Gonzalzez et al. Encontraron células intersticiales en cultivos celulares primarios IMCD similares 5-8 días después de la siembra 25.

Cultivos de células primarias IMCD preparan en formas ligeramente diferentes, pero que poseen propiedades similares como los descritos anteriormente se utilizan en otros laboratorios. Por ejemplo, Chou et al. Semillas células IMCD primarios sobre superficies de plástico que no están recubiertas con colágeno 26. Las células IMCD primarios preparados de acuerdo con cualquiera de los protocolos parecen de alta calidad similarcomo por ejemplo que ambos son adecuados para Ca 2 + intracelular medidas 22,23,26. Listas completas de los ARNm y proteínas expresadas en células IMCD primarios se obtuvieron a partir de perfiles de transcripción utilizando tecnología Affymetrix 27 proteoma y el análisis de espectrometría de masas 28 (véase también http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Limitaciones de las células IMCD primarias, como para muchas pilas, como la baja tasa de transfección (≈ 1% 29). Por lo tanto la sobreexpresión de las proteínas es casi sólo es posible si los plásmidos que codifican las proteínas o los mismos se microinyectan (por ejemplo, 30). Una limitación adicional es la falta de polaridad celular adecuada de las células IMCD primarios. En respuesta a AVP, AQP2 transloca predominantemente en la membrana plasmática basolateral (Figura 2). Nuestros ensayos para inducir la polaridad adecuada, es decir,

Tomados en conjunto, IMCD células primarias, establecidas como se describió anteriormente, poseen la maquinaria para el control de AQP2 y son por lo tanto un modelo adecuado para el estudio de la regulación AQP2. Sin embargo, su uso requiere de los animales y por lo tanto debe limitarse a experimentos que no pueden llevarse a cabo en otros sistemas de modelos establecidos (véase más arriba) y para la validación de los resultados que se obtuvieron en otros sistemas modelo.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL y KL 1415/3-2 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

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Enno Klussman

El cultivo primarios de rata medular interna recolección de células del conducto
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Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

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