原代培养大鼠内髓集合管细胞

Summary

精氨酸加压素（AVP）控制体内水分的动态平衡微调肾主细胞，通过促进水的重吸收。在这里，我们提出了一个协议的初级大鼠内髓集合管细胞AVP-介导的水的重吸收的分子机制的阐明适合种植。

Abstract

精氨酸加压素（AVP）肾集合管主细胞，从而微调体内水分的动态平衡，促进水的重吸收。 AVP的后叶加压素V2受体（V2R）的表面上的细胞结合，从而诱导的cAMP合成。这刺激细胞信号传导过程中的水通道蛋白2（AQP2）的磷酸化的变化。蛋白激酶A phoshorylates AQP2，从而触发细胞内的囊泡AQP2易位到质膜促进水的重吸收原尿。从主细胞垂体AVP激活的信号畸变AVP释放可引起中央或肾性尿崩症，分别升高血浆AVP水平与心血管疾病，如慢性心脏衰竭及抗利尿激素分泌综合征。

在这里，我们提出了一个协议cultivati对原代大鼠内髓集合管（IMCD）细胞，快递V2R和AQP2内源性的。这些细胞是适用于阐明的分子机制，水通道的控制，从而发现新AVP-介导的水的重吸收的失调相关的疾病的治疗的药物靶点。髓集合管细胞是从大鼠肾脏内髓质和六到八天播种后用于实验。髓集合管细胞可以定期细胞培养皿，培养瓶和不同格式的微滴定板中培养，该过程只需要几个小时，适合标准的细胞培养实验室。

Introduction

在肾集合管主细胞，精氨酸加压素（AVP）控制水的重吸收，通过刺激插入水通道蛋白2（AQP2）到质膜。 AVP结合G蛋白偶联后叶加压素2型受体（V2R），刺激腺苷酸环化酶，从而cAMP的形成。启动该信号级联激活蛋白激酶A（PKA）。蛋白激酶A磷酸化水通道在丝氨酸256（S256），这是关键的触发再分配到质膜的细胞内小泡。膜插入沿渗透压梯度和微调体内水分的动态平衡，促进水的重吸收。

失调的AVP-介导的水的重吸收，由于像差的AVP分泌或AVP-激活的的信令原因或伴有严重的疾病。水的重吸收减少V2R或AQP2突变造成的，而导致肾性尿崩症海拔血液ATED血浆AVP水平与心血管疾病，如慢性心脏衰竭及抗利尿激素分泌综合征（SIADH）水的重吸收过多。

AVP-介导的水的重吸收的意义，不仅是因为它蕴涵在疾病。 AVP诱导易位AQP2息囊泡与细胞膜的融合代表了严格cAMP依赖的胞吐过程，这是目前不是很了解。为cAMP依赖的胞吐作用的其他例子是在肾脏和H ⁺在胃中分泌的肾素分泌。因此，阐明AQP2易位肾主细胞的分子机制，不仅有助于理解相似的分子过程，在其他类型的细胞，但也可能与AVP-介导的水的重吸收障碍有关的疾病的治疗新疗法铺平道路。

êlucidating控制机制A​​QP2需要收集管主细胞模型。对于这样一些不同的哺乳动物肾细胞系都可用。然而，这些模型有几个缺点。在许多细胞系统中的水通道蛋白水平低（ 表1，M1，HEK293，COS-7，MDCK细胞^{，LLC-PK1）1-10，}其他异位过度表达人类^{（MCD4，WT10）11,12}或大鼠（CD8） ¹³ AQP2。在MCD4和COS-7细胞中的V2受体不表达。据我们所知，没有永久的细胞株作为一种模式，这是来自肾脏内髓集合管，肾AQP2表达最丰富的那部分，但是从皮质集合管^1,11,13-16 。这种细胞模型，例如广泛使用的永生mpkCCD（ 例如 ^17），或最近建立的mTERT-CCD ^14个细胞系。两种细胞系内源性表达AQP2和V2R但因为它们是来自最有可能含有皮质集合管内髓集合管（IMCD）细胞相比，不同的蛋白质组。例如，他们必须表达不同的Na ⁺的运输系统。

在这里，我们提出了一个协议文化主髓集合管细胞表达V2R和AQP2内源性。这一模式，因此，代表着最密切的生理情况在肾集合管。建立文化，只需要标准的实验室设备其他实验室可以很容易地采用这种方式。

Protocol

1。准备

1. 准备培养皿
   1. 解冻胶原蛋白​​IV型O / N在4°C和0.1％无菌醋酸溶解。使用量取决于接种细胞的类型和数量的菜肴。使用2微克/厘米^2。
   2. 孵育至少1小时，于RT菜肴，并用蒸馏水（A. tridest）洗两次。
   3. 允许菜肴正常干燥。
2. 补充介质
   1. 提高到500毫升培养基中添加1.75克葡萄糖，4.5 g / L的葡​​萄糖水平。为了调节介质600毫渗透摩尔，添加100mM NaCl的100mM的尿素，分别由200毫渗透摩尔，100毫渗透摩尔，增加渗透压。
   2. 到600 mosmol DMEM培养基中添加1％非必需氨基酸，1％ultroser，500μM的二丁酰环腺苷酸（dbcAMP），20 U / ml的制霉菌素和0.25微克/毫升庆大霉素（1:200稀释的原液的浓度为50微克/毫升）新鲜的一天的准备。
   酶溶液
   1. 加入1毫克/毫升透明质酸酶和胶原酶2.2毫克/毫升的DPBS含0.25微克/毫升的庆大霉素和制霉菌素。准备1毫升这种酶溶液消化2内部肾髓质。该解决方案必须通过过滤灭菌，并存储在50ml Falcon管中。

2。培养原代大鼠内髓集合管（IMCD）细胞

所有动物的处理程序进行符合地方和联邦立法。

1. 麻醉大鼠在CO _2（在一个盒子里饱和CO _2）或异氟醚（U-400麻醉机，有限公司，马耳他Univentor;空气流量350-400毫升/分钟2-2.5％异氟醚）。杀头动物出血发白内部较深的外髓之间的边界，允许精确检测。此外，出血孤立的红细胞数量减少到最小。移除肾脏和补充用庆大霉素和制霉菌素（见上文）在冰上的无菌DPBS中把它们洗干净。所有进一步的步骤是无菌洁净工作台条件下进行。
2. DPBS溶液肾脏转移到一个无菌的压缩，以除去过多的液体。取出脂肪肾胶囊用无菌镊子和剪刀。
3. 经肾仍然固定在压缩，稍微切的外侧（皮层）的纵向轴线的旁边。确保不完全划破，但把它留在一块，在肾盂连接。
4. 用弯剪刀仔细解剖发白的内髓质，被包围玫瑰波光粼粼的外髓。收集他们在DPBS，冰60毫米的培养皿中含有庆大霉素和制霉菌素。
5. 一旦所有的髓质分离和收集的冰，减小体积的DPBS的水平，他们只是布满缓冲。使用一个无菌的的剃刀刃切髓质切块5³毫米。
6. 简单火焰熔化和圆一个无菌巴斯德吸管尖底。确保移液器冷却，然后再继续。
7. 组织悬液转移到50毫升猎鹰管含有新鲜配制的无菌酶溶液用透明质酸酶和胶原酶（见1.3.1）用巴斯德吸管圆润。紧紧关上盖子，并在37°C下连续搅拌（220转）一个普通的桌面水浴1.5 - 2小时。
8. 研磨的悬浮液，吸液管的混合物向下几次与轮巴斯德吸管（见上文），直到变得均匀混浊的悬浮液。
9. 离心悬浮在300 XG 5分钟和16°C。弃上清，悬浮颗粒在DPBS彻底，含有庆大霉素和制霉菌素再次离心。重复此洗涤步骤一次。
10. 重悬细胞在完全培养基和种子到c的ulture菜和/或微滴度孔板。 2髓质（1只）的编制将产生足够一个60毫米培养皿中的细胞。
11. 24小时后，洗细胞两次与600 mosmol DMEM，并添加新鲜培养基。在接下来的一周，应清洗细胞的2-3倍（ 图1）。播种后6-8天，髓集合管的细胞，可用于实验。请记住他们在实验开始前24小时，二丁酰环腺苷酸（dbcAMP）和制霉菌素未经孵化。否则AQP2将位于只在质膜。

Representative Results

原代大鼠IMCD细胞培育成功，将导致在一个融合的单层播种后6-8天（ 图2）。每60毫米培养皿中有大约6×10 ⁶细胞。这些细胞紧紧坚持培养皿，这些被涂上IV型胶原，基底膜成分^18。因此，IMCD细胞将无法分离，即使在一些彻底的洗涤程序。高达80％的培养细胞表达出来的内源性和AQP2。这是主要的细胞，，而AQP2细胞缺乏被认为是闰细胞，非髓集合管细胞是来自于薄的四肢，直肠血管亨勒或内髓间质细胞的循环。正如我们先前的研究显示，中等渗透压为600毫渗透摩尔阻止下调AQP2 ^19。此外，AQP2表达维持培养基中添加的膜通透类似cAMP的二丁酰环腺苷酸（dbcAMP）。为了减少AQP2血浆MEMB应保持正视，表达，从而有利于细胞内的定位IMCD细胞没有DBcAMP约24小时前实验。 ，如果大部分的水通道是定位于质膜在控制条件下，应该的无DBcAMP种植的时间被延长。标准缓冲液中的60毫米培养皿中生长的细胞裂解产生1.5毫克蛋白^10。

于刺激短期（30分钟）与AVP或毛喉素，直接激活腺苷酸环化酶，AQP2转位到质膜（ 图2）从细胞内的囊泡。此外，在髓集合管细胞AQP2表达增加与AVP或毛喉素（ 图^3）10后，30分钟的挑战。的在AQP2丰度增加独立的增强的转录和翻译。毛喉素或AVP刺激导致抑制p38的有丝分裂原活化的蛋白激酶（p38的MAPK），p的电平的下降，这是与丝氨酸261的水通道，并减少在其多聚泛素hosphorylation上面。因此，增长的AQP2丰富刺激后冲高蛋白酶体降解减少^10。两者合计，IMCD细胞允许控制AQP2调查机制。

细胞系	有机体	ATCC号或参考
CAKI	智人	HTB-46
CD8	智人	瓦伦蒂等人，1996年13
COS-7	这两起	CRL-1651
HEK293	智人	CRL-1573
LLC-PKI	野猪	CL-101
M1	小家鼠	CRL-2038
MCD4	小家鼠	Iolascon 等人，2007年11
MDCK	家犬	CRL-2935
mpkCCD	小家鼠	本斯等人 ，1999年15，哈斯勒等人，2002年16
mTERT-CCD	小家鼠	Steele 等人，2010年14
WT10	家犬	迪恩等人，1997年12

表1中。哺乳动物肾细胞株的的AQP2控制机制的研究 。 CAKI，mpkCCD的CCD mTERT细胞内源性表达AQP2。在COS-7，HEK293，LLC-PK1，M1和MDCK细胞系，水通道是很难检测的。 CD8，MCD4和WT10细胞过度AQP2异位。

图1。管细胞培养建立的程序的示意性表示。控制的实验步骤和实验优选平日的顺序。原代大鼠IMCD细胞接种在第0天，1周后用于实验。括号中的数字是指根据“议定书”的描述各自的实验步骤。

图2。 AVP或毛喉素刺激后的质膜水通道插入髓集合管细胞留在控制条件下，或在37℃下用100nM的AVP的30分钟或10μM毛喉素刺激细胞免疫荧光显微镜递减分析前ribed（LSM 710，德国耶拿的卡尔·蔡司显微成像^）10。用DAPI细胞核观察，检测AQP2一个定制的抗体（红色;抗体^{H27）20,21。}上面板，XY扫描;较低的面板，XZ扫描。比例尺为20μm。

图3。 AQP2蛋白丰度增加加压素（AVP），毛喉素刺激后 IMCD细胞不及时治疗（UTR），或刺激与100 nM的AVP（A）或10微米毛喉素（F）30分钟，在37°C。细胞裂解和复杂的糖化（AQP2 CG），高甘露糖（AQP2 HM）和非糖化AQP2（AQP2纳克）免疫检测特异性抗体AQP2（SC-9882，圣克鲁斯）如前所述^10。作为加载控制α-微管蛋白（CP06，Calbiochem公司）检测。显示的是具有代表性的结果> 3 Experiments。分子量（kDa）的指示。

Discussion

我们提出了一个详细的协议的准备和培养原代大鼠IMCD细胞。该方法产生高达21平方^厘米的细胞从一个大鼠^20。实验要求标准的细胞培养设备，并可以在大约6小时内由一个人进行。因此，这种做法是适合作为一个标准的实验室方法。

原代大鼠的IMCD细胞可以接种在培养皿不同大小，范围从96孔板到60毫米的菜肴。然而，环比增长384格式的程序需要优化。我们避免使用较大增长超过60毫米的菜肴。这些细胞是适合用于各种实验，如Western印迹法，免疫沉淀，DNA / RNA的分离，免疫荧光显微镜，Ca ^{2 +}的成像和电生理^10,22,23。

播种后约6至8天，主要IMCD细胞生长到confl出水单层（ 图2）。单元格的高度为3 - 5微米，平均为^24，将细胞紧密连接并保持高水平的内源性AQP2表达。 AQP2免疫荧光显微镜检测表明，高达80％的细胞代表AQP2阳性主细胞（ 图^{3，10,20）。}形态的细胞的特点是长而直的单元格边框，嵌入到细胞质中被一至三个核仁的核，和几个突出的胞质颗粒^20。的身份，余下的20％AQP2阴性细胞在培养并没有明确地被定义。 Maric的等人进行的相差显微镜和免疫荧光显微镜分析紧密连接的可视化小区边界^20。他们在AQP2负细胞观察弯曲单元格边框，与他们相邻的细胞和细胞核与一个核仁突出的缩进和内陷。巴斯AQP2阳性细胞，它不同于在此形态中，Maric的等人的建议，大多数AQP2阴性细胞的插层的细胞。此外，培养显然包含几成纤维细胞^20。他们才会显现，如果文化生长过快的主要细胞，当这些细胞开始的10多天。根据我们的培养条件下成纤维细胞不显示一个典型的成纤维细胞的外观。线，Gonzalzez 等人发现间质细胞类似的基层IMCD细胞培养5-8天播种后^25。

主管细胞培养方式略有不同，但准备在其他实验室使用上述的具有相似的属性。例如，Chou 等人种子主髓集合管细胞在塑料表面上，涂有胶原蛋白的^26。根据任何协议的主要IMCD细胞似乎类似的高品质例如，两者都适用于细胞内Ca ^{2 +}测量^22,23,26。初级IMCD细胞的mRNA和蛋白表达的综合列表的使用Affimetrix技术²⁷和质谱的蛋白质组分析^28（见也http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ）得到的转录谱。

限制主髓集合管细胞，对于许多初级细胞，包括低转染率^{（≈1％29）。}因此，过度表达的蛋白质几乎是唯一可能的，如果编码质粒或蛋白质本身的显微注射（ 例如^，30）。进一步的限制是缺乏适当的主髓集合管细胞的细胞极性。在响应AVP，AQP2主要转位到基底侧质膜上（ 图2）。我们的试验，以诱导正确的极性， 即

两者合计，主的IMCD细胞，如上所述的设立，具有用于控制机械AQP2，因此AQP2调节一个合适的模型研究。然而，它们的使用需要的动物，因此，应限制为不能进行其他建立的模型系统（见上文）和其他模型系统中，得到的结果为验证实验。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen Type IV Mouse	BD Biosciences	356233
Hyaluronidase	SIGMA	H6254
Collagenase type CLS-II	Biochrom AG	C2-22
DMEM + GlutMAX	Invitrogen GIBCO	21885108
Nystatin	SIGMA	N4014
Ultroser G	Cytogen	15950-017
Non essential amino acids (NEA)	Biochrom AG	K0293
Gentamicin	Invitrogen GIBCO	15710
DBcAMP	BIOLOG	D009