Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrkning Primær Rat Inner Medullær samlekanal Cells

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginin-vasopressin (AVP) styrer finjustering af kropsvæske homeostase ved at lette vand reabsorption ved renal vigtigste celler. Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af primære rotte indre medullær opsamlingskanal celler egnede til udredning af molekylære mekanismer bag AVP-medieret vand reabsorption.

Abstract

Arginin-vasopressin (AVP) letter vand reabsorption ved renal opsamlingskanal vigtigste celler og dermed finjusterer kropsvæske homeostase. AVP binder sig til vasopressin V2-receptorer (V2R) på overfladen af ​​cellerne og derved inducerer syntese af cAMP. Dette stimulerer cellulære signalprocesser der fører til ændringer i phosphorylering af vandkanal Aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 og derved udløser translokation af AQP2 fra intracellulære vesikler i plasmamembranen letter vand reabsorption fra primær urin. Afvigelser i AVP frigivelse fra hypofysen eller AVP-aktiveret signalering i væsentligste celler kan forårsage centrale eller nefrogen diabetes insipidus, henholdsvis en forhøjet blodplasma AVP niveau er forbundet med cardiovaskulære sygdomme, såsom kronisk hjertesvigt og syndrom med uhensigtsmæssig sekretion af antidiuretisk hormon.

Her præsenterer vi en protokol for cultivatipå primær rotte indre medullær samlekanal (IMCD) celler, som udtrykker V2R og AQP2 endogent. Cellerne er egnede til at belyse molekylære mekanismer, der ligger kontrol AQP2 og dermed at opdage nye lægemiddelkandidater til behandling af sygdomme forbundet med dysregulering af AVP-medieret vand reabsorption. IMCD celler opnås fra rotte nyre indre medullae og anvendes til eksperimenter seks til otte dage efter podning. IMCD celler kan dyrkes i ordinær celle dyrkningsskåle, kolber og mikro-titer plader af forskellige formater, den procedure, der kun kræver nogle få timer, og er egnet til standard cellekultur laboratorier.

Introduction

I renale opsamlingskanal vigtigste celler, styrer arginin-vasopressin (AVP) vand reabsorption ved at stimulere indsættelse af vandkanal Aquaporin-2 (AQP2) i plasmamembranen. AVP binder til G-protein-koblede vasopressin type 2-receptoren (V2R) stimulere adenylylcyclase og derved cAMP-dannelse. Indledningen af ​​denne signaleringskaskade fører til aktivering af protein kinase A (PKA). PKA phosphorylerer AQP2 på serin 256 (S256), hvilket er nøglen udløser dens omfordeling fra intracellulære vesikler i plasmamembranen. Membranen indsættelse letter vand reabsorption langs en osmotisk gradient og finjusterer kropsvæske homeostase.

Dysregulering af AVP-medieret vand reabsorption, på grund af afvigelser i AVP sekretion eller AVP-aktiverede signal årsager eller forbundet med alvorlige sygdomme. Nedsat vand reabsorption forårsaget af mutationer i V2R eller AQP2 fører til nefrogen diabetes insipidus, mens en Elevated blodplasma AVP niveau er forbundet med overdreven vand reabsorption i cardiovaskulære sygdomme, såsom kronisk hjertesvigt og syndrom med uhensigtsmæssig antidiuretisk hormon (SIADH).

Betydningen af ​​AVP-medieret vand reabsorption stammer ikke blot fra dens konsekvenser i sygdom. AVP-induceret translokation af AQP2-bærende vesikler til og fusion med plasmamembranen repræsenterer en strengt cAMP-afhængig eksocytisk proces, som i øjeblikket ikke er godt forstået. Andre eksempler på en cAMP-afhængig exocytose er reninsekretionen i nyrerne og H + sekretion i maven. Derfor udredning af molekylære mekanismer, der styrer AQP2-translokation hos nyre vigtigste celler ikke kun hjælper til at forstå lignende molekylære processer i andre celletyper, men kan også bane vejen for nye behandlingsformer til behandling af sygdomme forbundet med forstyrrelser af AVP-medieret vand reabsorption .

Elucidating mekanismer kontrollerer AQP2 kræver opsamlingskanal vigtigste celle modeller. Til dette en række forskellige pattedyr nyrecellelinier er tilgængelige. Men disse modeller har flere ulemper. I mange cellesystemer proteinniveauet af AQP2 er lav (tabel 1, M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, andre ektopisk overudtrykker humane (MCD4, WT10) 11,12 eller rotte (CD8) 13 AQP2. I MCD4 og COS-7-celler V2-receptoren ikke udtrykkes. Til vores viden er der ingen permanent cellelinie som en model til rådighed, som er afledt af den renale indre medullære opsamlingskanal, at en del af nyren hvor AQP2 ekspression er mest rigelige, men fra den kortikale opsamlingskanal 1,11,13-16 . Sådanne cellemodeller er for eksempel den meget brugte udødeliggjort mpkCCD (fx 17), eller de nyoprettede mTERT-CCD 14 cellelinjer. Begge cellelinjer endogent express AQP2 og V2R men da de er afledt afkortikal opsamlingskanal sandsynligvis indeholde en anden proteom forhold til indre medullær samlekanal (IMCD) celler. De skal for eksempel udtrykker forskellige Na + transportsystemer.

Her præsenterer vi en protokol til kultur primære IMCD celler, der udtrykker V2R og AQP2 endogent. Denne model repræsenterer derfor mest nøje den fysiologiske situation i renal opsamlingskanal. Som om kulturen kræver kun Standardlaboratorieudstyr andre laboratorier kan nemt vedtage denne fremgangsmåde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Forberedelse

  1. Forberedelse dyrkningsskålene
    1. Thaw collagen type IV O / N ved 4 ° C og opløse det i 0,1% steril eddikesyre. Mængden til at bruge, afhænger af typen og antallet af retter, hvor cellerne der skal seedet. Brug 2 ug / cm 2.
    2. Inkuber retter i mindst 1 time ved stuetemperatur og vaskes to gange med destilleret vand (A. tridest).
    3. Lad det tørre ordentligt.
  2. Tilskud af medium
    1. Øg glukose niveau op til 4,5 g / L ved tilsætning 1,75 g glucose til 500 ml medium. For at justere medium til 600 mosmol, tilsættes 100 mM NaCl og 100 mM urea, for at øge osmolaritet med 200 mosmol og 100 mosmol hhv.
    2. Tilsæt 1% ikke-essentielle aminosyrer, 1% ultroser, 500 pM dbcAMP, 20 U / ml nystatin og 0,25 ug / ml gentamicin (1:200 fortynding af stamopløsning med en koncentration på 50 ug / ml) til 600 mosmol DMEM-medium frisk på dagen for forberedelse.
    Enzymopløsning
    1. Tilsæt 1 mg / ml hyaluronidase og 2,2 mg / ml collagenase til DPBS indeholdende 0,25 ug / ml gentamicin og nystatin. Forbered 1 ml af denne enzymopløsning til fordøjelsen af ​​2 nyre indre medullae. Opløsningen skal steriliseres ved filtrering og lagres i 50 ml Falcon rør.

2.. Dyrkning af Primary Rat Inner Medullær samlekanal (IMCD) Celler

Alle animalske håndtering procedurer der skal udføres i overensstemmelse med de lokale og føderale lovgivning.

  1. Bedøve rotter i CO 2 (i en kasse mættet med CO 2) eller isofluran (U-400 Anæstesi enheden Univentor Ltd, Malta, luftstrøm 350-400 ml / min med 2-2,5% isofluran). Halshugge de dyr, blødninger, som muliggør nøjagtig detektering af grænsen mellem hvidlige indre og den mørkere ydre medulla. Desuden minimerer blødning antallet af isolerede erytrocytter. Fjern nyrer ogvaske dem i sterile DPBS suppleret med gentamicin og nystatin (se ovenfor) på is. Alle yderligere skridt der skal udføres under sterile rene bænk forhold.
  2. Overfør nyrer fra DPBS opløsning på en steril komprimere at fjerne overskydende væske. Fjern den fede nyre kapsel med steril pincet og saks.
  3. Efter nyrerne stadig fast i komprimere, skåret lidt siden den langsgående akse af den ydre (kortikal) side. Sørg for ikke at skære igennem fuldstændigt, men at lade det i ét stykke, forbundet i nyrebækkenet.
  4. Med krum saks omhyggeligt dissekere hvidlig indre medullae, som er omgivet af rosé flimrende ydre medulla. Saml dem i DPBS indeholdende gentamicin og nystatin i en 60 mm dyrkningsskål på is.
  5. Når alle medullae isoleres og opsamles på is, reducere mængden af ​​DPBS til et niveau, hvor de er bare dækket med buffer. Brug en steril barberblad til at skære medullae i tern af 5mm 3.
  6. Smelte og rundt den skarpe ende af en steril Pasteur-pipette ved at holde det kort i en flamme. Sørg for, at pipetten afkøles, før du fortsætter.
  7. Overfør vævssuspension til 50 ml Falcon rør indeholdende frisklavet steril enzymopløsning med hyaluronidase og collagenase (se 1.3.1) ved hjælp af afrundede Pasteur-pipette. Luk låget stramt og der inkuberes ved 37 ° C under kontinuerlig omrøring (220 rpm) i en regelmæssig bordplade vandbad i 1,5-2 timer.
  8. Til triturering af suspensionen, pipetteres blandingen op og ned adskillige gange med rund Pasteur-pipette (se ovenfor), indtil suspensionen bliver homogent uklar.
  9. Centrifuger suspensionen i 5 minutter ved 300 xg og 16 ° C. Supernatanten, pellet resuspenderes grundigt i DPBS indeholdende gentamicin og nystatin og centrifugeres igen. Gentag dette vasketrin gang.
  10. Cellerne i fuldt tilskud mellemstore og frø dem ind cvaring retter og / eller mikro-titer godt plader. Fremstillingen af ​​2 medullae (1 dyr) vil give tilstrækkelige celler til en 60 mm dyrkningsskål.
  11. Efter 24 timer vaskes cellerne to gange med 600 mosmol DMEM og tilsæt frisk medium. I den næste uge cellerne skal vaskes 2-3 gange (figur 1). 6-8 dage efter podning, kan IMCD celler anvendes til eksperimenter. Husk at udruge dem i et medium uden DBcAMP og nystatin i 24 timer, før du starter eksperimentet. Ellers AQP2 vil blive placeret udelukkende i plasmamembranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede dyrkning af primære rotte IMCD celler vil resultere i en sammenflydende monolag 6-8 dage efter podning (figur 2). Per 60 mm dyrkningsskål der er ca 6 x 10 6 celler. Cellerne stramt overholde dyrkningsskålene, da disse blev belagt med collagen type IV, en kælder membran komponent 18. Derfor vil IMCD celler ikke frigøre selv i adskillige grundig vask procedurer. Op til 80% af de dyrkede celler udtrykker endogent V2R og AQP2. Disse er de væsentligste celler, mens celler, der mangler AQP2 betragtes interkalerede celler, ikke-IMCD celler, der stammer fra tynde lemmer Henles slynge, vasa recta eller indre medullære interstitielle celler. Som vi tidligere har vist, mellemlang osmolaritet på 600 mosmol forhindrer nedregulering af AQP2 19.. Desuden er AQP2 ekspression opretholdes ved at supplere mediet med membranen gennemtrængelige cAMP analog DBcAMP. For at reducere AQP2 plasma membRane udtryk og dermed favorisere sine intracellulære lokalisering af IMCD celler bør holdes uden DBcAMP cirka 24 hr før eksperimenter. Hvis de fleste af AQP2 er lokaliseret i plasmamembranen under kontrol forhold, bør tidspunktet for DBcAMP-fri dyrkning forlænges. Lyse af celler dyrket i 60 mm dyrkningsskåle i standard buffere giver 1,5 mg protein 10.

Ved kortvarig stimulering (30 min) med AVP eller forskolin, en direkte aktivator af adenylylcyclase, AQP2 translokerer fra intracellulære vesikler til plasmamembranen (figur 2). Endvidere øger AQP2 ekspression i IMCD celler på en 30 min udfordring med AVP eller forskolin (Figur 3) 10. Stigningen i AQP2 overflod er uafhængig af et forstærket transskription og translation. Forskolin eller AVP stimulation fører til hæmning af p38-mitogenaktiverede-protein kinase (p38-MAPK), som er forbundet med et fald i niveauet af phosphorylation ved serin 261 af AQP2 og en reduktion i sin poly-ubiquitination. Således er stigningen i AQP2 overflod ved stimulering tilskrives faldet proteasomalaktivitet nedbrydning 10.. Tilsammen IMCD celler muligt at efterforske de mekanismer styrer AQP2.

Cellelinie Organisme ATCC nummer eller reference
Caki Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al., 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL 1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et al., 1999 15, Hasler et al. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al. 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12

Tabel 1. Mammale nyrecellelinier til undersøgelser af AQP2 kontrolmekanismer. Caki, mpkCCD og mTERT-CCD celler udtrykker AQP2 endogent. I COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 og MDCK cellelinjer AQP2 er næppe detekterbar. CD8, MCD4 og WT10 celler overekspression AQP2 ektopisk.


Figur 1. Skematisk fremstilling af proceduren for oprettelse IMCD cellekulturer. Indikeres er rækkefølgen af eksperimentelle trin og ugedagene foretrækkes til forsøgene. Primære rotte IMCD podes på dag 0 og 1 uge senere bruges til eksperimenter. Tal i parentes henviser til de respektive eksperimentelle beskrevne trin under "Protocol".

Figur 2
Figur 2. AQP2 indsætter i plasmamembranen ved stimulering med AVP eller forskolin. IMCD celler blev efterladt under kontrolbetingelser eller enten stimuleret med 100 nM AVP eller 10 uM forskolin i 30 min ved 37 ° C. Celler blev analyseret ved immunfluorescens mikroskopi som described før (LSM 710, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland) 10.. Kerner blev visualiseret med DAPI blev AQP2 detekteres med en custom-made antistof (rød, antistof H27) 20,21. Overpanel, xy-scanninger, nederste panel, XZ scanninger. Skalapanelerne, 20 um.

Figur 3
Figur 3. AQP2 protein overflod stiger efter stimulering med vasopressin (AVP) og forskolin. IMCD celler blev efterladt ubehandlet (UTR) eller enten stimuleret med 100 nM AVP (A) eller 10 pM forskolin (F) i 30 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev lyseret og komplekse glykosyleret (AQP2 cg), høj mannose (AQP2 hm) og ikke glykosyleret AQP2 (AQP2 ng) blev opdaget af immunoblot anvendelse af specifikke antistoffer mod AQP2 (sc-9882, SantaCruz) som tidligere beskrevet 10.. Som en belastning kontrol α-tubulin (KP06, Calbiochem) blev opdaget. Vist er et repræsentativt resultat af> 3 experiments. Molekylvægte er angivet (kDa).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer en detaljeret protokol for forberedelse og dyrkning af primære rotte IMCD celler. Den tilgang giver op til 21 cm 2 af celler fra en rotte 20. Forsøget kræver standard cellekultur udstyr og kan udføres af en enkelt person inden for ca 6 timer. Derfor er denne fremgangsmåde er egnet som en standard laboratoriemetode.

Primære rotte IMCD celler kan podes i dyrkningsskåle af forskellig størrelse fra plader med 96 brønde til 60 mm skåle. Men for vækst i 384 brønds format proceduren kræver optimering. Vi undgår at bruge retter større end 60 mm, da væksten aftog. Cellerne er egnede til en bred vifte af eksperimenter, såsom Western blotting, immunpræcipitation, DNA / RNA-isolering, immunfluorescensmikroskopi, Ca 2 + billeddannelse og elektrofysiologi 10,22,23.

Ca. 6 til 8. dage efter podning, er primære IMCD celler dyrket til en CONFLuent monolag (figur 2). Cellehøjden er 3-5 um i gennemsnit 24, og cellerne er tæt knyttet og opretholde et højt niveau af endogen AQP2 ekspression. Immunofluorescens mikroskopisk påvisning af AQP2 indikerer, at op til 80% af de celler repræsenterer AQP2-positive primære celler (figur 3; 10,20). Morfologisk cellerne er kendetegnet ved lange, lige cellekanter, en nucleus indlejret i cytoplasma med en til tre nukleoler, og flere fremtrædende cytoplasmatiske granula 20. Identiteten af ​​de resterende 20% AQP2-negative celler i kulturen har ikke entydigt defineret. Maric et al. Udført fasekontrastmikroskopi og immunofluorescens mikroskopiske analyser af tight junctions at visualisere cellegrænserne 20. I AQP2-negative celler de observerede buede cellekanter med fordybninger og invaginationer til deres omkringliggende celler og en fremspringende nucleus med én nucleolus. Based på denne morfologi, der er forskellig fra AQP2-positive celler, Maric et al. foreslog, at størstedelen af AQP2-negative celler er indskudt celler. Derudover tilsyneladende kulturen indeholder få fibroblaster 20. De bliver kun synlige, hvis de dyrkes i mere end 10 dage, hvor disse celler begynder at tilgroning de vigtigste celler. Under vores kultur betingelse fibroblast ikke vise en typisk fibroblast udseende. På linje, Gonzalzez et al. Fundet interstitielle celler i lignende ubearbejdet IMCD cellekulturer 5-8 dage efter såning 25..

Primære IMCD cellekulturer fremstilles på lidt forskellige måder, men som besidder lignende egenskaber som de ovenfor beskrevne, anvendes i andre laboratorier. For eksempel, Chou et al. Frø primære IMCD celler på plastoverflader, der ikke er belagt med kollagen 26.. De primære IMCD celler fremstillet i henhold til enten protokol synes af samme høje kvalitetsom for eksempel både er egnet til intracellulær Ca2 +-målinger 22,23,26. Omfattende lister over mRNAer og proteiner udtrykt i primære IMCD celler blev opnået fra transcriptional profilering ved hjælp Affimetrix teknologi 27 og massespektrometrisk proteomanalyse 28 (se også http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Begrænsninger af primære IMCD celler, som i mange primærelementer, omfatter den lave transfektion sats (≈ 1% 29). Således overekspression af proteiner er næsten kun muligt, hvis kodende plasmider eller proteinerne selv er mikroinjiceres (fx 30). En yderligere begrænsning er manglen på korrekt cellulær polaritet primære IMCD celler. Som svar på AVP, AQP2 translokerer overvejende i den basolaterale plasmamembran (figur 2). Vore forsøg at fremkalde ordentlig polaritet, dvs

Tilsammen primære IMCD celler, der er etableret som beskrevet ovenfor, har maskineriet til styring AQP2 og er derfor en egnet model til at studere AQP2 regulering. Men deres anvendelse kræver dyr og bør derfor begrænses til forsøg, der ikke kan udføres i andre etablerede modelsystemer (se ovenfor) og for validering af resultater, der blev opnået i andre modelsystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL 1415/3-2 og KL 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Tags

Cellular Biology Bioengineering Genetik molekylærbiologi biokemi Biomedical Engineering Medicine Farmakologi signalering mellem peptider og proteiner exocytose signaltransduktion Second Messenger Systems Calcium Signaling hjertekarsygdomme Hormoner Hormone Suppleanter og hormon antagonister Life Sciences (General) vand reabsorption nyre vigtigste celler vasopressin cyklisk AMP Aquaporin dyremodel cellekultur

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Dyrkning Primær Rat Inner Medullær samlekanal Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter