Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

ארגינין-וזופרסין (AVP) שולט בכוונון עדין של איזון מים בגוף דרך להקל על ספיגת מים על ידי תאי הכליה עיקריות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגידול מדולרי פנימי עכברוש העיקרי איסוף תאי צינור המתאימים להבהרת מנגנונים מולקולריים שבבסיס ספיג חוזר של מים AVP בתיווך.

Abstract

ארגינין-וזופרסין (AVP) מאפשר ספיג חוזר של מים על ידי כליות איסוף תאים עיקריים צינור ובכך עדינות מנגינות הומאוסטזיס מים בגוף. AVP נקשר לקולטנים V2 זופרסין (V2R) על פני השטח של התאים ובכך גורם לסינתזה של cAMP. זה מגרה תהליכי איתות תאיים מובילים לשינויים בזירחון של תעלת המים aquaporin-2 (AQP2). חלבון קינאז phoshorylates AQP2 ובכך מעורר את טרנסלוקציה של AQP2 משלפוחית ​​תאיות לתוך קרום הפלזמה להקל ספיגת מים משתן ראשוני. סטיות של שחרור מAVP איתות יותרת המוח או AVP המופעל בתאים עיקריים יכולות לגרום לסוכרת תפלה מרכזית או nephrogenic, בהתאמה; רמה גבוהה בדם פלזמה AVP קשורה למחלות לב וכלי דם, כגון אי ספיקת לב כרונית ותסמונת של הפרשת הורמון antidiuretic לא הולמת.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לcultivatiמלשד פנימי עכברוש העיקרי איסוף צינור (IMCD) תאים, שמבטא V2R וAQP2 endogenously. התאים מתאימים להבהרת מנגנונים מולקולריים שבבסיס הבקרה של AQP2 ובכך לגלות מטרות תרופה חדשות לטיפול במחלות הקשורות לחוסר ויסות של ספיגת מים AVP בתיווך. תאי IMCD מתקבלים מmedullae פנימי כליות חולדה ומשמשים לניסויים שישה עד שמונה ימים לאחר זריעה. יכולים להיות מתורבתים תאי IMCD במנות רגילות תרבית תאים, צלוחיות וצלחות מייקר כייל של פורמטים שונים, ההליך דורש רק כמה שעות, והוא מתאים למעבדות תרבית תאים סטנדרטיות.

Introduction

בתאים עיקריים צינור איסוף כליות, ארגינין-וזופרסין (AVP) שולט במים על ידי גירוי ספיג חוזר של החדרת המים ערוץ aquaporin-2 (AQP2) לתוך קרום הפלזמה. AVP נקשר לרצפטור וזופרסין סוג 2 G-חלבון בשילוב (V2R) גירוי cyclase adenylyl ובכך היווצרות cAMP. תחילתו של מפל איתות זה מובילה להפעלה של החלבון קינאז (PKA). PKA phosphorylates AQP2 בסרין 256 (S256), המהווה את הגורם העיקרי לחלוקה מחדש שלה משלפוחית ​​תאיות לתוך קרום הפלזמה. הכניסה הקרום מאפשרת ספיגה חוזרת של מים לאורך שיפוע האוסמוטי ועדינות מנגינות הומאוסטזיס מים בגוף.

Dysregulation של ספיגת מים AVP בתיווך, בשל סטיות של הפרשת AVP או גורמי איתות AVP-מופעלים או קשור למחלות קשות. ירידה נגרמה על ידי מוטציות של V2R או AQP2 ספיגת מים מובילה לסוכרת תפלה nephrogenic, בעוד שגובה מעל פני יםרמת AVP פלזמה דם ated קשורה לספיגת מים מוגזמת במחלות לב וכלי דם, כגון אי ספיקת לב כרונית ותסמונת של הפרשת הורמון antidiuretic הולמת (SIADH).

המשמעות של ספיגת מים AVP בתיווך נובעת לא רק מההשלכות שלה במחלה. טרנסלוקציה-Induced AVP של שלפוחית ​​AQP2 נושאים ולאיחוי עם קרום הפלזמה מייצגת תהליך exocytic קפדנות מחנה תלוי, אשר כיום אינה מובנת היטב. דוגמאות אחרות לexocytosis מחנה תלוי הן הפרשת רנין בכליה וH + הפרשה בבטן. לכן, הבהרת מנגנונים מולקולריים השולטים AQP2-טרנסלוקציה בתאי הכליה עיקריות לא רק עוזרת להבנת תהליכים מולקולריים דומים בסוגי תאים אחרים, אלא גם עשויה לסלול את הדרך לטיפולים חדשים לטיפול במחלות הקשורות להפרעות בספיגת מים AVP בתיווך .

Elucidating AQP2 שליטה מנגנונים דורש איסוף מודלים תא עיקריים דביק. לשם כך מספר שורות תאי כליות יונקים שונים זמין. עם זאת, המודלים האלה יש כמה חסרונות. במערכות סלולריים רבות את רמת החלבון של AQP2 היא נמוכה (טבלת 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, אחרים ectopically overexpress אדם (MCD4, WT10) 11,12 או עכברוש (CD8) 13 AQP2. בMCD4 וCOS-7 תאים רצפטור V2 לא בא לידי ביטוי. למיטב ידיעתנו אין קו תא קבוע כמודל זמין, הנגזר מאיסוף הצינור הלשדי הפנימי כליות, את אותו חלק של הכליה בי AQP2 הביטוי הוא נפוץ ביותר, אבל מצינור 1,11,13-16 קליפת המוח האיסוף . מודלים תא כאלה הם למשל mpkCCD הונצח בשימוש נרחב (לדוגמה 17) או את 14 קווים שהוקמו לאחרונה mTERT-CCD הסלולרי. שתי שורות תאי endogenously המפורש AQP2 וV2R אבל מאז הם הנגזריםצינור איסוף קליפת המוח הקרוב לוודאי מכיל proteome שונה לעומת לשדי פנימי איסוף צינור (IMCD) תאים. הם חייבים להביע למשל Na שונה + מערכות תחבורה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתאי IMCD עיקריים תרבות המבטאים V2R וAQP2 endogenously. מודל זה, אם כן, מייצג באופן קרוב ביותר את המצב הפיזיולוגי בצינור איסוף הכליות. כביסוס התרבות דורש רק תקן מעבדות אחרות ציוד מעבדה יכולות בקלות לאמץ את הגישה הזו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. מכין את מנות התרבות
    1. הפשירו קולגן סוג IV O / N ב 4 ° C ולפזר אותו בחומצה אצטית 0.1% סטרילית. הנפח להשתמש תלוי בסוג ובמספר המנות שבתאים שנזרעו. השתמש 2 מיקרוגרם / 2 ס"מ.
    2. דגירה מנות לפחות במשך שעה 1 ב RT ולשטוף פעמיים עם מים מזוקקים (א tridest).
    3. לאפשר את הכלים לייבוש כמו שצריך.
  2. תוספת של מדיום
    1. הגדל את רמת הגלוקוז עד 4.5 גר '/ ל' על ידי הוספה גרם גלוקוז 1.75 עד בינונית 500 מ"ל. כדי להתאים את המדיום ל600 mosmol, להוסיף 100 מ"מ NaCl ואוריאת 100 מ"מ, כדי להגדיל את osmolarity ב -200 mosmol ו100 mosmol, בהתאמה.
    2. הוסף חומצות 1% שאינם חיוני אמינו, 1% ultroser, DBcAMP 500 מיקרומטר, 20 nystatin U / מ"ל ​​ו0.25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין (1:200 דילול של פתרון מניות עם ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל) עד ​​600 מדיום DMEM mosmol טרי ביום ההכנה.
    פתרון אנזים
    1. הוסף מ"ג / מיליליטר hyaluronidase 1 ו -2.2 collagenase מ"ג / מ"ל ​​לDPBS המכיל 0.25 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין וnystatin. להכין 1 מ"ל של תמיסת אנזים זה לעיכול של medullae 2 הכליות פנימית. הפתרון חייב להיות מעוקר על ידי סינון ומאוחסן ב50 צינורות מ"ל פלקון.

2. טיפוח של Medullary פנימי עכברוש הראשוני איסוף צינור (IMCD) תאים

כל נהלי הטיפול בבעלי החיים הם להתבצע בהתאם לחקיקה פדרלית והמקומית.

  1. לטשטש בחולדות CO 2 (בתיבה רוויה עם CO 2) או isoflurane (U-400 אלחוש יחידה, Univentor בע"מ, מלטה; זרימת אוויר 350-400 מ"ל / דקה עם 2-2.5% isoflurane). לערוף את החיות לדימום המאפשר זיהוי של גבול שבין הפנימי לבנבן והלשד החיצוני הכהה יותר מדויק. בנוסף, הדימום ממזער את מספר אריתרוציטים בודדים. הסר כליות ולשטוף אותם בDPBS סטרילית השלים עם גנטמיצין וnystatin (ראה לעיל) על קרח. כל צעדים נוספים הם להתבצע בתנאים סטריליים ספסל נקי.
  2. העבר את הכליות מפתרון DPBS על לדחוס סטרילי כדי להסיר נוזל מוגזם. הסר את הקפסולה כליות שומן עם מלקחיים ומספריים סטריליים.
  3. לאחר שהכליות עדיין קבועות ברטייה, לחתוך מעט ליד ציר האורך של הצד החיצוני (קליפת המוח). הקפד לא לחתוך לגמרי, אבל כדי להשאיר אותו בחתיכה אחת, מחובר באגן הכליה.
  4. עם מספריים מעוגלים לנתח medullae הפנימי לבנבן, שמוקפים בלשד החיצוני נצנץ רוזה בזהירות. לאסוף אותם בDPBS, המכיל גנטמיצין וnystatin בצלחת תרבות 60 מ"מ על קרח.
  5. לאחר שכל medullae מבודד ונאסף על קרח, להפחית את עוצמת הקול של DPBS לרמה שבה הם פשוט מכוסים במאגר. השתמש בסכין גילוח סטרילית לחתוך לקוביות של medullae 5מ"מ 3.
  6. ממסים ולעגל את הקצה החד של פסטר פיפטה סטרילית על ידי מחזיק אותו לזמן קצר לתוך להבה. ודא פיפטה היא מקוררת לפני שתמשיך.
  7. מעבירים את ההשעיה הרקמות ל50 צינורות מ"ל פלקון המכילים פתרון אנזים סטרילי מוכן טרי עם hyaluronidase וcollagenase (ראה 1.3.1) על ידי השימוש בפיפטה פסטר המעוגלת. סגור את המכסה בחוזקה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס תחת תסיסה מתמשכת (220 סל"ד) באמבטיה רגילה שולחן מים עבור 1.5 - 2 שעות.
  8. לטחינה דקה של ההשעיה, פיפטה את התערובת מעלה ומטה מספר פעמים עם סיבוב פיפטה פסטר (ראה לעיל) ועד להשעיה הופכת עכור הומוגנית.
  9. צנטריפוגה ההשעיה למשך 5 דקות ב 300 XG ו16 ° C. בטל supernatant, resuspend את הכדור באופן יסודי בDPBS, המכיל גנטמיצין וnystatin ו צנטריפוגות שוב. חזור על שלב שטיפה זה פעם אחת.
  10. Resuspend התאים במדיום וזרעם לג בתוספת באופן מלאמנות ulture ו / או צלחות גם מיקרו כייל. הכנת 2 medullae (בעלי החיים 1) תניב תאים יספיקו לצלחת תרבות 60 מ"מ.
  11. לאחר 24 שעות, לשטוף תאים פעמיים עם 600 mosmol DMEM ולהוסיף מדיום חדש. במהלך השבוע הבא יש לשטוף את התאים 2-3 פעמים (איור 1). 6-8 ימים לאחר זריעה, תאי IMCD יכולים לשמש לניסויים. זכור לדגירה אותם במדיום בלי DBcAMP וnystatin למשך 24 שעות לפני תחילת הניסוי. אחרת AQP2 יהיה ממוקם באופן בלעדי בקרום הפלזמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הגידול המוצלח של תאי IMCD עכברוש עיקריים יביא בשכבת מחוברות 6-8 ימים לאחר הזריעה (איור 2). למנת תרבות 60 מ"מ יש כ 6 x 10 6 תאים. התאים בחוזקה לדבוק במנות התרבות, שכן אלה היו מצופים בקולגן הסוג IV, מרכיב קרום במרתף 18. לכן, תאי IMCD לא לנתק גם במספר הליכי שטיפה יסודי. עד 80% מהתאים בתרבית ולהביע V2R AQP2 endogenously. אלה הם תאים העיקריים, ואילו התאים חסרי AQP2 נחשבים תאי intercalated, תאים שאינם IMCD נגזרים מגפיים דקיקים של הלולאה של Henle, ושה Recta או תאי ביניים מדולרי פנימיים. כפי שהראינו בעבר, osmolarity הבינוני של 600 mosmol מונע למטה רגולציה של AQP2 19. בנוסף, ביטוי AQP2 מתוחזק על ידי השלמה בינונית עם DBcAMP האנלוגי cAMP קרום החדיר. כדי להקטין את AQP2 הפלזמה membביטוי RANE ובכך להעדיף הלוקליזציה תאית שלה תאי IMCD צריך להישמר ללא DBcAMP כ 24 שעות לפני ניסויים. אם רוב AQP2 הוא מקומי בקרום הפלזמה בתנאי בקרה, הזמן של טיפוח ללא DBcAMP צריך להיות ממושך. תמוגה של תאים שגודלו 60 מ"מ מנות התרבות במאגרים רגילים מניבה 1.5 מ"ג חלבון 10.

על הגירוי לטווח קצר (30 דקות) עם AVP או forskolin, מפעיל ישיר של adenylyl cyclase, AQP2 translocates משלפוחית ​​תאיות לקרום הפלזמה (איור 2). בנוסף, AQP2 ביטוי בתאי IMCD מגדיל על אתגר 30 דקות עם AVP או forskolin (איור 3) 10. העלייה בAQP2 שפע היא עצמאית של שעתוק ותרגום משופרים. Forskolin או גירוי AVP מוביל לעיכוב של p38-mitogen--חלבון קינאז (p38-MAPK), אשר מזוהה עם ירידה ברמה של phosphorylation בסרין 261 של AQP2 וירידה בפולי-ubiquitination שלה. לפיכך, הגידול בשיעור של AQP2 שפע על גירוי מיוחס לירידה בשפלת proteasomal 10. יחדיו, תאי IMCD לאפשר חוקרים את מנגנוני השליטה AQP2.

שורת תאים מנגנון מספר ATCC או הפניה
CAKI הומו סאפיינס HTB-46
CD8 הומו סאפיינס לנטי et al., 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 הומו סאפיינס CRL-1573
LLC-PKI scrofa Sus CL-101
M1 מאסכאלאס Mus CRL -2038
MCD4 מאסכאלאס Mus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD מאסכאלאס Mus Bens et al., 1999 15, האסלר et al. 2002 16
mTERT-CCD מאסכאלאס Mus סטיל et al., 2010 14
WT10 Canis familiaris דין ואח'., 1997 12

טבלת מס '1. שורות תאי יונקים כליות למחקרים של AQP2 מנגנוני בקרה. תאי CAKI, mpkCCD וmTERT-CCD להביע AQP2 endogenously. בCOS-7, HEK293, שורות תאי MDCK LLC-PK1, M1 ו, AQP2 היא כמעט לא מורגש. CD8, MCD4 וWT10 תאי overexpress AQP2 ectopically.

o: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. ייצוג סכמטי של ההליך להקמת תרביות תאי IMCD. צוין הם צו צעדי ניסוי וימי החול המועדף לניסויים. תאי IMCD עכברוש עיקריים הם זורעים ביום 0 ובשבוע שלאחר מכן 1 המשמשים לניסויים. מספרים בסוגריים מתייחסים לצעדי ניסוי בהתאמה תוארו תחת "פרוטוקול".

איור 2
איור 2. AQP2 מחדיר לתוך קרום הפלזמה על גירוי עם AVP או forskolin. תאי IMCD נותרו בתנאי בקרה או או מגורה עם AVP 100 ננומטר או 10 מיקרומטר forskolin למשך 30 דקות ב 37 ° C. תאים נותחו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence כיורדribed לפני (LSM 710; Carl Zeiss MicroImaging, Jena, גרמניה) 10. גרעינים היו דמיינו עם DAPI, AQP2 זוהה עם נוגדני מחוייט (אדום; נוגדן H27) 20,21. פנל עליון, סריקות xy; פנל תחתון, סריקות XZ. ברים סולם, 20 מיקרומטר.

איור 3
איור 3. AQP2 עליות חלבון שפע על גירוי עם וזופרסין (AVP) וforskolin. תאי IMCD נותרו ללא טיפול (UTR) או או מגורה עם 100 ננומטר AVP (א) או 10 מיקרומטר forskolin (F) למשך 30 דקות ב 37 ° C. תאים היו lysed ו( AQP2 CG), AQP2 glycosylated המורכב glycosylated גבוה מנוז (AQP2 HM) ולא (AQP2 ng) זוהה על ידי immunoblot באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד AQP2 (SC-9882, Santacruz) כפי שתואר לעיל 10. כביקורת טעינת α-טובולין (CP06, Calbiochem) זוהה. מוצגת לתוצאת נציג מ> 3 דוארxperiments. משקלים מולקולריים מצוינים (KDA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנה וculturing של תאי IMCD עכברוש ראשוניים. גישת תשואות של עד 21 ס"מ 2 של תאים מחולדה אחת 20. הניסוי דורש ציוד תרבית תאים סטנדרטי ויכול להתבצע על ידי אדם אחד בתוך כ 6 שעות. לכן, גישה זו היא מתאימה כמו שיטת מעבדה סטנדרטית.

ניתן זורעים תאי IMCD עכברוש עיקריים במנות התרבות של גודל שונה, הנעים בין 96 ל -60 צלחות גם מנות מ"מ. עם זאת, לצמיחה ב384 פורמט גם ההליך דורש אופטימיזציה. שלנו להימנע משימוש במנות גדולות יותר מ -60 מ"מ כצמיחת ואט. התאים מתאימים למגוון רחב של ניסויים כגון מערבי סופג, immunoprecipitation, בידוד דנ"א / רנ"א, מיקרוסקופיה immunofluorescence, Ca 2 + הדמיה וelectrophysiology 10,22,23.

כ 6 עד 8 ימים לאחר זריעה, תאי IMCD עיקריים גדלים לconfluent monolayer (איור 2). גובה התא הוא 3 - 5 מיקרומטר על 24 בממוצע, ואת התאים המחוברים בחוזקה ולשמור על רמה גבוהה של AQP2 ביטוי אנדוגני. זיהוי מיקרוסקופי של immunofluorescence AQP2 מציין כי עד 80% מהתאים מייצגים תאים עיקריים AQP2-חיוביים (איור 3; 10,20). מורפולוגית התאים מאופיינים בגבולות ארוכים וישרים סלולריים, גרעין מוטבע לתוך הציטופלסמה עם אחד עד שלוש nucleoli, וכמה גרגירים 20 cytoplasmic בולטים. זהותם של תאי AQP2 השליליים הנותרים של 20% בתרבות לא הוגדרה באופן חד משמעי. מאריץ' et al. בוצע מיקרוסקופיה שלב ניגודיות וניתוחים מיקרוסקופים immunofluorescence של צמתים הדוקים לדמיין גבולות תא 20. בתאים AQP2 שליליים הם הבחינו גבולות תאים מעוגלים עם חריצים ונקיקים לתאים השכנים שלהם וגרעין בולט עם אחד הגרעינון. Basאד במורפולוגיה זה שהוא שונה מזה של תאי AQP2 חיוביים, מאריץ' ואח'. הציע כי הרוב המכריע של תאי AQP2-שלילי intercalated תאים. בנוסף לכך, ככל הנראה, התרבות מכילה כמה fibroblasts 20. הם הופכים לכאורה רק אם התרבויות גדלים במשך יותר מ -10 ימים שבם תאים אלה להתחיל overgrowing התאים העיקריים. תחת פיברובלסטים מצב התרבות שלנו אינו מציג מראה פיברובלסטים טיפוסי. בקו, Gonzalzez et al. מצא תאי ביניים בתרביות תאים דומים עיקריות IMCD 5-8 ימים לאחר זריעת 25.

תרביות תאי IMCD עיקריות מוכנות בדרכים שונות במקצת אך בעלי תכונות דומות לאלה שתוארו לעיל נמצאים בשימוש במעבדות אחרות. לדוגמה, צ'ו et al. זרעי תאי IMCD עיקריים על משטחי פלסטיק שאינם מצופים קולגן 26. תאי IMCD הראשוניים שהוכנו על פי פרוטוקול או נראים באיכות גבוהה דומהכמו למשל ששניהם מתאימים לתאיים Ca 2 + מדידות 22,23,26. מפרופיל תעתיק רשימות מקיפות של mRNAs וחלבונים המתבטאים בתאי IMCD ראשוניים התקבלו באמצעות טכנולוגית Affimetrix 27 וניתוח 28 (ראה גם proteome ספקטרומטריה http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd).

מגבלות של תאי IMCD ראשוניים, כמו לתאים ראשוניים רבים, כוללות שיעור הנמוך transfection (≈ 1% 29). לכן ביטוי יתר של חלבונים הוא כמעט אפשרי רק אם פלסמידים הקידוד או את החלבונים עצמם microinjected (למשל 30). מגבלה נוספת היא חוסר הקוטביות סלולרית תקינה של תאי IMCD ראשוניים. בתגובה לAVP, ובראש ובראשונה AQP2 translocates לתוך קרום הפלזמה basolateral (איור 2). הניסויים שלנו כדי לגרום לקוטביות נכונה, כלומר

יחדיו, תאי IMCD ראשוניים, שנקבעו כאמור לעיל, יש מכונה לשליטה AQP2 ולכן מודל מתאים ללימוד AQP2 רגולציה. עם זאת, השימוש בם דורש בעלי חיים ולכן צריך להיות מוגבל לניסויים שלא ניתן לבצע במערכות מודל מבוססות אחרות (ראה לעיל) ולאימות של תוצאות שהתקבלו במערכות מודל אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG; KL 1415/3-2 וKL 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 76 Bioengineering גנטיקה ביולוגיה מולקולרית ביוכימיה הנדסה ביו רפואית רפואה פרמקולוגיה פפטידים וחלבוני איתות אינטר exocytosis העברת אותות מערכות שליח שנייה איתות סידן מחלות לב וכלי דם הורמונים תחליפי הורמונים והורמונים יריבים תרבית תאי מדעי חיים (כללי) מים ספיגה חוזרים כליות תאים עיקריים וזופרסין מחזורי AMP aquaporin מודל חיה,

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Medullary העכברוש הראשוני culturing הפנימי איסוף תאי Duct
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter