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Biology

Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginin-Vasopressin (AVP) steuert Feinabstimmung der Körper Wasser Homöostase durch die Erleichterung Wasserreabsorption durch renale Hauptzellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kultivierung von primären Ratten inneren medullären Sammelkanal Zellen geeignet für die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen AVP-vermittelten Wasserreabsorption.

Abstract

Arginin-Vasopressin (AVP) erleichtert Wasserreabsorption durch renale Sammelkanal Hauptzellen und damit eine Feinabstimmung Körper Wasser-Homöostase. AVP bindet Vasopressin V2-Rezeptoren (V2R) auf der Oberfläche der Zellen und induziert dadurch Synthese von cAMP. Dies stimuliert die zelluläre Signalgebung Prozesse, die zu Veränderungen in der Phosphorylierung des Wassers Aquaporin-2 (AQP2). Protein Kinase A phoshorylates AQP2 und löst dadurch die Translokation von intrazellulären Vesikeln AQP2 in die Plasmamembran zu erleichtern Reabsorption von Wasser aus primären Urin. Aberrationen der AVP-Freisetzung aus der Hypophyse oder AVP-aktivierten Signalisierung in Hauptzellen kann zentral oder Diabetes insipidus sind; eine erhöhte Blutplasma AVP Ebene ist mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie chronischer Herzinsuffizienz und das Syndrom der inadäquaten ADH-Sekretion verbunden.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für cultivatiauf der primären Ratten inneren medullären Sammelkanal (IMCD-Zellen), die ausdrückliche V2R und AQP2 endogen. Die Zellen eignen sich zur Erläuterung molekularen Mechanismen, die der Steuerung der AQP2 und damit Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen mit der Fehlregulation der AVP-vermittelten Wasserreabsorption verbunden zu entdecken. IMCD Zellen aus Ratte renale inneren medullae erhalten und werden für Experimente sechs bis acht Tage nach der Aussaat verwendet. IMCD Zellen in regelmäßigen Zellkulturschalen, Flaschen und Mikrotiterplatten unterschiedlicher Formate können kultiviert werden, das Verfahren erfordert nur ein paar Stunden, und ist geeignet für Standard Zellkulturlaboren.

Introduction

In renalen Sammelkanal Hauptzellen steuert Arginin-Vasopressin (AVP) Reabsorption von Wasser durch die Stimulierung der Insertion des Wassers Aquaporin-2 (AQP2) in die Plasmamembran. AVP bindet an das G-Protein-gekoppelten Vasopressin-Typ-2-Rezeptor (V2R) stimuliert Adenylatcyclase und somit cAMP-Bildung. Initiation dieser Signalkaskade führt zur Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). PKA phosphoryliert AQP2 an Serin 256 (S256), das ist der Schlüssel Auslöser für seine Umverteilung von intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran. Die Membran Einsetzen erleichtert Wasserreabsorption entlang eines osmotischen Gradienten und Feinabstimmung Körper Wasser-Homöostase.

Dysregulation der AVP-vermittelten Wasserreabsorption aufgrund Aberrationen AVP-Sekretion oder AVP-aktivierten Signalisierung Ursachen oder ist mit schweren Erkrankungen. Verminderte Wasserreabsorption durch Mutationen des V2R oder AQP2 verursacht führt zu Diabetes insipidus, während eine elevATED Blutplasma AVP Ebene wird mit überschüssigem Wasser Reabsorption in Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie chronischer Herzinsuffizienz und das Syndrom der inadäquaten ADH-Sekretion (SIADH) verbunden.

Die Bedeutung der AVP-vermittelten Wasserreabsorption rührt nicht nur von seiner Verwicklung in Krankheit. Die AVP-induzierte Translokation von AQP2-tragenden Vesikeln und Fusion mit der Zellmembran eine streng cAMP-abhängige Exozytose-Verfahren, die gegenwärtig nicht gut verstanden. Weitere Beispiele für eine cAMP-abhängige Exozytose Reninsekretion in der Niere und der H +-Sekretion in den Magen. Daher Aufklärung der molekularen Mechanismen für die AQP2-Translokation in renalen Hauptzellen hilft nicht nur ähnliche molekulare Prozesse in anderen Zelltypen zu verstehen, sondern kann auch den Weg zu neuen Therapien für die Behandlung von Erkrankungen, die mit Störungen der AVP-vermittelten Wasserreabsorption verbunden .

Elucidating Kontrollmechanismen AQP2 erfordert Sammelkanal Hauptzellen Modelle. Hierzu wird eine Anzahl von verschiedenen Säugetierniere Zelllinien sind. Jedoch haben diese Modelle mehrere Nachteile. In vielen Zellsysteme der Protein-Ebene von AQP2 niedrig ist (Tabelle 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, andere ektopisch überexprimieren human (MCD4, WT10) 11,12 oder Ratte (CD8) 13 AQP2. In MCD4 und COS-7-Zellen, die V2-Rezeptor nicht exprimiert. Nach unserer Kenntnis gibt es keine permanente Zelllinie als Modell zur Verfügung, die von der Nierenfunktion inneren medullären Sammelkanal, dass ein Teil der Niere, wo AQP2 Expression häufigste abgeleitet ist, sondern von der kortikalen Sammelkanal 1,11,13-16 . Solche Zelle Modelle sind zum Beispiel das weit verbreitete verewigt mpkCCD (zB 17) oder die neu gegründete mTERT-CCD 14 Zelllinien. Beide Zelllinien endogen express AQP2 und V2R aber da sie aus der abgeleitetenkortikalen Sammelkanal wahrscheinlich eine unterschiedliche Proteom gegenüber inneren medullären Sammelkanal (IMCD-Zellen). Sie müssen zum Beispiel auszudrücken verschiedenen Na +-Transport-Systeme.

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kultur primären IMCD Zellen V2R und AQP2 endogen. Dieses Modell stellt daher am ehesten die physiologische Situation in der Nieren-Sammelkanal. Da die Gründung der Kultur erfordert nur Standard Laborgeräte anderen Laboratorien können leicht annehmen diesen Ansatz.

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Protocol

1. Vorbereitung

  1. Vorbereitung der Kulturschalen
    1. Thaw Kollagen Typ IV O / N bei 4 ° C und löst ihn in 0,1% sterile Essigsäure. Das Volumen zu verwenden, hängt von der Art und Anzahl der Gerichte, in denen die Zellen ausgesät zu werden. Verwenden 2 pg / cm 2.
    2. Inkubieren Gerichte mindestens 1 h bei RT und waschen zweimal mit destilliertem Wasser (A. tridest).
    3. Lassen Sie die Gerichte, um richtig zu trocknen.
  2. Supplementation des Mediums
    1. Erhöhen der Blutzuckerspiegel bis zu 4,5 g / L, indem 1,75 g Glucose in 500 ml Medium. Um das Medium auf 600 mosmol einzustellen, mit 100 mM NaCl und 100 mM Harnstoff, um die Osmolarität von 200 mosmol und 100 mosmol erhöhen, beziehungsweise.
    2. 1% nicht-essentielle Aminosäuren, 1% Ultroser, 500 pM DBcAMP, 20 U / ml Nystatin und 0,25 g / ml Gentamicin (1:200-Verdünnung der Stammlösung mit einer Konzentration von 50 ug / ml) auf 600 mosmol DMEM-Medium frisch am Tag der Vorbereitung.
    Enzymlösung
    1. 1 mg / ml Hyaluronidase und 2,2 mg / ml Collagenase-DPBS, enthaltend 0,25 g / ml Gentamicin und Nystatin. Bereiten 1 ml dieser Enzymlösung für die Verdauung von 2 Niere inneren medullae. Die Lösung muss durch Filtration sterilisiert werden und wird in 50 ml-Falcon-Röhrchen gelagert.

2. Kultivierung von primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal (IMCD) Cells

Alle tierischen Handhabung Verfahren sind in Übereinstimmung durchgeführt werden mit der lokalen und föderalen Gesetzgebung.

  1. Betäuben Ratten in CO 2 (in einer Box mit CO 2 gesättigt) oder Isofluran (U-400 Anästhesie-Einheit, Univentor Ltd, Malta; Luftstrom 350-400 ml / min mit 2-2,5% Isofluran). Enthaupten die Tiere für Blutungen, die genaue Erkennung der Grenze zwischen dem inneren und dem weißlich dunkleren äußeren Medulla erlaubt. Darüber hinaus minimiert die Blutung die Anzahl der isolierten Erythrozyten. Nieren und entfernenwaschen Sie sie in sterilen DPBS mit Gentamicin und Nystatin (siehe oben) auf Eis ergänzt. Alle weiteren Schritte sind unter sterilen Bedingungen saubere Bank durchgeführt werden.
  2. Übertragen Nieren aus dem DPBS Lösung auf eine sterile Kompresse auf überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Entfernen Sie das Fett Niere Kapsel mit einer sterilen Pinzette und Schere.
  3. Nachdem die Niere noch in der Kompresse befestigt ist, geschnitten etwas neben der Längsachse des äußeren (kortikalen) Seite. Achten Sie darauf, nicht durch völlig abgeschnitten, sondern um es in einem Stück zu verlassen, verbunden im Nierenbecken.
  4. Mit gebogenen Schere sorgfältig sezieren die weißlich inneren medullae, die durch die rosé schimmernde äußeren Medulla umgeben sind. Sammeln Sie in DPBS, mit Gentamicin und Nystatin in einer 60 mm Kulturschale auf Eis.
  5. Sobald alle medullae isoliert und gesammelt auf Eis, reduzieren Sie die Lautstärke von DPBS auf ein Niveau, wo sie gerade mit Puffer bedeckt sind. Verwenden Sie eine sterile Rasierklinge die medullae in Würfel schneiden von 5mm 3.
  6. Schmelzen und die scharfe Ende einer sterilen Pasteurpipette indem es kurz in eine Flamme. Achten Sie darauf, die Pipette, bevor Sie fortfahren gekühlt wird.
  7. Übertragen des Gewebes Suspension auf die 50 ml-Falcon-Röhrchen, die frisch hergestellten sterilen Enzymlösung mit Hyaluronidase und Kollagenase (siehe 1.3.1) unter Verwendung der gerundeten Pasteurpipette. Schließen Sie den Deckel fest und Inkubation bei 37 ° C unter ständigem Rühren (220 rpm) in einem regulären tabletop Wasserbad für 1,5 - 2 Stunden.
  8. Zum Zerreiben der Suspension, Pipette das Gemisch nach oben und unten mehrmals mit dem runden Pasteurpipette (siehe oben), bis die Suspension homogen wird trüb.
  9. Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 300 xg und 16 ° C. Überstand verwerfen, das Pellet gründlich in DPBS, mit Gentamicin und Nystatin und Zentrifuge wieder. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal waschen.
  10. Die Zellen in voll ergänzt mittel-und Saatgut sie in culture Gerichte und / oder Mikro-Titer-Well-Platten. Die Herstellung von 2 medullae (1 Tier) wird genügend Zellen für eine 60 mm Kulturschale ergeben.
  11. Nach 24 Stunden, waschen Sie die Zellen zweimal mit 600 mosmol DMEM und fügen Sie frisches Medium. Während der nächsten Woche sollten die Zellen 2-3 mal (Abbildung 1) gewaschen werden. 6-8 Tage nach der Aussaat können die IMCD Zellen für Experimente verwendet werden. Denken Sie daran, sie in Medium inkubieren ohne DBcAMP und Nystatin für 24 Stunden vor Beginn des Experiments. Ansonsten AQP2 wird ausschließlich in der Plasmamembran lokalisiert werden.

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Representative Results

Die erfolgreiche Kultivierung von primären Ratten IMCD-Zellen werden in einem Monolayer 6-8 Tage nach der Aussaat (Abbildung 2) führen. Per 60 mm Kulturschale gibt es etwa 6 x 10 6 Zellen. Die Zellen eng an den Kulturschalen haften, da diese mit Kollagen Typ IV, eine Basalmembran Komponente 18 beschichtet wurden. Daher wird IMCD Zellen nicht einmal lösen während mehrerer gründliches Waschen Verfahren. Bis zu 80% der kultivierten Zellen exprimieren endogen V2R und AQP2. Dies sind die wichtigsten Zellen, während die Zellen ohne AQP2 gelten eingelagerten Zellen, nicht IMCD Zellen aus dünnen Gliedmaßen von der Henle-Schleife, Vasa recta oder inneren medullären interstitiellen Zellen abgeleitet. Wie wir bereits gezeigt haben, verhindert das Medium Osmolarität von 600 mosmol Down-Regulation von AQP2 19. Zusätzlich wird AQP2 Expression durch Ergänzen des Mediums mit der Membran-permeable cAMP-Analogon DBcAMP gehalten. Um die AQP2 Plasma memb reduzierenrane Ausdruck und somit ihre intrazelluläre Lokalisation der IMCD-Zellen begünstigen sollte ohne DBcAMP ca. 24 Std. vor Experimenten gehalten werden. Wenn die meisten der AQP2 in der Plasmamembran lokalisiert Bedingungen unter Kontrolle ist, sollte die Zeit der DBcAMP-freie Anbau verlängert werden. Die Lyse der Zellen in 60 mm Kulturschalen in Standard-Puffer gewachsen ergibt 1,5 mg Protein 10.

Bei kurzfristigen Stimulation (30 min) mit AVP oder Forskolin, einem direkten Aktivator der Adenylatzyklase, AQP2 Translokation von intrazellulären Vesikeln zur Plasmamembran (Abbildung 2). Darüber hinaus erhöht AQP2 Expression in IMCD-Zellen nach einer 30 min Herausforderung mit AVP oder Forskolin (Abbildung 3) 10. Der Anstieg der AQP2 Fülle ist unabhängig von verstärkten Transkription und Translation. Forskolin Stimulation oder AVP führt zu einer Hemmung der p38-mitogen-aktivierten Proteinkinase (p38-MAPK), die mit einer Abnahme der Konzentration von p zugeordnet isthosphorylation an Serin 261 von AQP2 und einer Reduzierung seiner Poly-Ubiquitinierung. Somit wird die Erhöhung der AQP2 Fülle auf Stimulation verringert proteasomalen Abbau 10 zugeschrieben. Zusammengenommen erlauben IMCD Zellen erforschen die Mechanismen steuern AQP2.

Zelllinie Organismus ATCC-Nummer oder Referenz
CAKI Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al., 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et al., 1999 15, Hasler et al. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al., 2010, 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12

Tabelle 1. Säugetierniere Zelllinien für Untersuchungen von AQP2 Kontrollmechanismen. CAKI, mpkCCD und mTERT-CCD-Zellen exprimieren endogen AQP2. In COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 und MDCK-Zelllinien ist AQP2 kaum nachweisbar. CD8, MCD4 und WT10-Zellen überexprimieren AQP2 ektopisch.


Abbildung 1. Schematische Darstellung des Verfahrens zur Erstellung IMCD Zellkulturen. Angegeben ist jeweils die Reihenfolge der experimentellen Schritte und die Wochentage für die Experimente bevorzugt. Primäre Ratte IMCD Zellen werden am Tag 0 ausgesät und 1 Woche später für Experimente verwendet. Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf die jeweiligen experimentellen Schritte unter "Protocol" beschrieben.

Abbildung 2
Abbildung 2. AQP2 Einsätze in die Plasmamembran bei Stimulierung mit AVP oder Forskolin. IMCD Zellen unter Kontrollbedingungen links oder entweder mit 100 nM AVP oder 10 uM Forskolin 30 min bei 37 ° C stimuliert Die Zellen wurden durch Immunfluoreszenzmikroskopie als desc analysiertribed vor (LSM 710, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Deutschland) 10. 20,21; Zellkerne wurden mit DAPI wurde AQP2 mit einem maßgeschneiderten Antikörper (Antikörper H27 rot) erkannt. Oberes Feld, xy-Scans, untere Platte, xz Scans. Maßstab Bars, 20 um.

Abbildung 3
Abbildung 3. AQP2 Proteinmenge erhöht bei Stimulierung mit Vasopressin (AVP) und Forskolin. IMCD Zellen wurden unbehandelt gelassen (UTR), oder entweder mit 100 nM AVP (A) oder 10 uM Forskolin (F) für 30 min bei 37 ° C stimuliert Die Zellen wurden lysiert und komplex glykosylierte (AQP2 cg), Hochmannose (AQP2 hm) und nicht glykosylierten AQP2 (AQP2 ng) wurde durch Immunoblot unter Verwendung von spezifischen Antikörpern gegen AQP2 (sc-9882, SantaCruz) wie zuvor 10 beschrieben. Als Ladekontrolle α-Tubulin (CP06, Calbiochem) erkannt wurde. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von> 3 eXperimente. Molekulargewichte sind angegeben (kDa).

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Discussion

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Kultivierung von primären Ratten IMCD Zellen. Der Ansatz liefert bis zu 21 cm 2 von Zellen aus einer Ratte 20. Der Versuch erfordert Standard Zellkulturausrüstung und kann von einer einzigen Person innerhalb von etwa 6 Stunden durchgeführt werden. Daher ist dieser Ansatz eignet sich als Standard-Labormethode.

Primäre Ratte IMCD Zellen in Kulturschalen unterschiedlicher Größe ausgesät werden, von 96-Well-Platten bis 60 mm Gerichte. Doch für Wachstum in 384-Well-Format das Verfahren erfordert Optimierung. Wir vermeiden, mit Gerichten größer als 60 mm, da das Wachstum gebremst. Die Zellen werden für eine Vielzahl von Versuchen, wie Western-Blot, Immunpräzipitation, DNA / RNA-Isolierung, Immunfluoreszenz, Ca 2 + Bildgebung und Elektrophysiologie 10,22,23.

Etwa 6 bis 8 Tage nach der Aussaat werden die primären IMCD Zellen einem confl gewachsenuent Monoschicht (Abbildung 2). Die Zelle beträgt 3 - 5 im Durchschnitt um 24, und die Zellen sind eng verbunden und ein hohes Niveau der endogenen AQP2 Ausdruck. Immunfluoreszenz mikroskopischen Nachweis von AQP2 zeigt, dass bis zu 80% der Zellen darstellen AQP2-positive Hauptzellen (3; 10,20). Morphologisch werden die Zellen durch lange, gerade Zellrahmen einem Kern in Zytoplasma mit einem bis drei Nukleolen eingebettet und mehrere prominente zytoplasmatischen Granula 20 gekennzeichnet. Die Identität der restlichen 20% AQP2-negative Zellen in der Kultur nicht eindeutig definiert. Maric et al. Durchgeführten Phasen-Kontrast-Mikroskopie und Immunfluoreszenz mikroskopische Analysen von Tight Junctions zu visualisieren Zellbegrenzungen 20. In AQP2-negativen Zellen, die sie beobachtet gekrümmten Zelle Grenzen mit Vertiefungen und Einstülpungen ihrer Nachbarzellen und einem vorspringenden Kern mit einem Nukleolus. Based auf dieser Morphologie, die sich von dem des AQP2-positive Zellen, Maric et al. vorgeschlagen, dass die Mehrheit der AQP2-negative Zellen sind Zellen eingelagert. Darüber hinaus ist die Kultur enthält offensichtlich einige Fibroblasten 20. Sie werden erst sichtbar, wenn die Kulturen für mehr als 10 Tage gewachsen sind, wenn diese Zellen überwuchern die wichtigsten Zellen beginnen. Unter unserer Kultur Zustand Fibroblasten zeigen keinen typischen Fibroblasten Aussehen. In Zeile Gonzalzez et al. Gefunden interstitiellen Zellen in ähnlicher primären Zellkulturen IMCD 5-8 Tage nach der Aussaat 25.

Primäre IMCD Zellkulturen in leicht unterschiedlicher Weise bearbeitet, aber die ähnliche Eigenschaften besitzen wie die oben beschriebenen in anderen Laboratorien verwendet werden. Beispielsweise Chou et al. Saatgut primären IMCD Zellen auf Kunststoff-Oberflächen, die nicht mit Kollagen 26 beschichtet sind. Die primären IMCD-Zellen hergestellt nach entweder Protokoll scheinen von ähnlicher Qualitätwie zum Beispiel beide für die intrazelluläre Ca 2 +-Messungen 22,23,26 geeignet. Umfangreiche Listen von mRNAs und Proteinen in primären IMCD-Zellen exprimiert wurden von Transkriptions-Profiling-Technologie unter Verwendung Affimetrix 27 und massenspektrometrische Proteomanalyse 28 (siehe auch http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Einschränkungen der primären IMCD-Zellen, wie für viele Primärzellen, sind die niedrigen Transfektionsrate (≈ 1% 29). So Überexpression von Proteinen ist fast nur möglich, wenn die Codierung Plasmide oder die Proteine ​​selbst mikroinjiziert werden (zB 30). Eine weitere Einschränkung ist die fehlende korrekte zelluläre Polarität der primären IMCD Zellen. In Reaktion auf AVP AQP2 transloziert überwiegend in der basolateralen Plasmamembran (Abbildung 2). Unsere Versuche zur Induktion richtige Polarität, dh

Zusammengenommen primären IMCD Zellen, wie oben beschrieben, hergestellt, besitzen die Maschinen zur Steuerung AQP2 und sind daher ein geeignetes Modell für die Untersuchung AQP2 Regulierung. Jedoch erfordert die Verwendung Tieren und sollte daher auf Experimente, die nicht in anderen Modellsystemen hergestellt (siehe oben) und für die Validierung der Ergebnisse, die in anderen Modellsystemen erhaltenen durchgeführt werden kann, begrenzt werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (; KL 1415/3-2 und KL 1415/4-2 DFG) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

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Enno Klussman

Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells
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Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

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