Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Odling Primär Rat Inre Medullary uppsamlingskanal Cells

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginin-vasopressin (AVP) styr finjustering av kroppens vatten homeostas genom att underlätta vatten reabsorption av renal huvudsakliga celler. Här presenterar vi ett protokoll för odling av primära råtta inre medullär uppsamlingskanal celler är lämpliga för att klarlägga molekylära mekanismer bakom AVP-medierad vatten reabsorption.

Abstract

Arginin-vasopressin (AVP) underlättar vatten reabsorption av renal uppsamlingskanal huvudsakliga celler och därigenom finjusterar kropp vatten homeostas. AVP binder till vasopressin V2-receptorer (V2R) på ytan av cellerna och därigenom inducerar syntes av cAMP. Detta stimulerar cellulär signalering processer som leder till förändringar i fosforyleringen av vattenrännan aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 och därigenom utlöser translokation av AQP2 från intracellulära vesiklar till plasmamembranet underlätta vatten reabsorption från primär urin. Aberrationer AVP frisättning från hypofysen eller AVP-aktiverad signalering i huvudsakliga celler kan orsaka centrala eller nephrogenic diabetes insipidus, respektive, en förhöjd blodplasma AVP nivå är associerad med kardiovaskulära sjukdomar såsom kronisk hjärtsvikt och syndrom av antidiuretiskt hormon.

Här presenterar vi ett protokoll för cultivatipå primär råtta inre medullär uppsamlingskanal (IMCD) celler, som uttrycker V2R och AQP2 endogent. Cellerna är lämpliga för att belysa molekylära mekanismer bakom kontrollen av AQP2 och således att upptäcka nya målproteiner för behandling av sjukdomar associerade med dysreglering av AVP-medierad vatten reabsorption. IMCD cellerna erhålls från råtta renal inre medullae och används för experiment sex till åtta dagar efter ympning. IMCD celler kan odlas i vanliga rätter cellodling, kolvar och mikro-titerplattor av olika format, kräver förfarandet bara ett par timmar, och är lämplig för vanliga laboratorier cellodling.

Introduction

I renala uppsamlingskanal huvudsakliga celler, kontrollerar arginin-vasopressin (AVP) vatten reabsorption genom att stimulera införandet av vattenkanalen aquaporin-2 (AQP2) i plasmamembranet. AVP binder till G-proteinkopplade vasopressin typ-2-receptorn (V2R) stimulera adenylylcyklas och därigenom cAMP-bildning. Inledande av denna signalering kaskad leder till aktivering av proteinkinas A (PKA). PKA fosforylerar AQP2 på serin 256 (S256), vilket är den viktigaste utlösande faktorn för dess omfördelning från intracellulära vesiklar till plasmamembranet. Membranet insättning underlättar vatten reabsorption längs en osmotisk gradient och finjusterar kropp vatten homeostas.

Dysreglering av AVP-medierad vatten reabsorption, på grund av avvikelser från AVP sekretion eller AVP-aktiverade orsaker signalering eller är associerad med svåra sjukdomar. Minskad vatten reabsorption orsakas av mutationer av V2R eller AQP2 leder till nefrogen diabetes insipidus, medan en elevated blodplasma AVP är förknippad med mycket vatten reabsorption i kardiovaskulära sjukdomar såsom kronisk hjärtsvikt och syndrom av antidiuretiskt hormon (SIADH).

Betydelsen av AVP-medierad vatten reabsorption härstammar inte bara från dess implikation i sjukdomen. Den AVP-inducerad flyttning av AQP2-bärande vesiklar till och fusion med plasmamembranet representerar en strikt cAMP-beroende exocytisk process, som för närvarande inte är väl förstådd. Andra exempel på ett cAMP-beroende exocytos är reninutsöndring i njuren, och H + sekretion i magen. Därför klarlägga molekylära mekanismer som styr AQP2-translokation i renal huvudsakliga cellerna inte bara hjälper till att förstå liknande molekylära processer i andra celltyper, men kan också bana väg för nya terapier för behandling av sjukdomar förknippade med störningar av AVP-medierad vatten reabsorption .

Elucidating mekanismer kontrollerar AQP2 kräver uppsamlingskanal huvudsakliga cell modeller. För detta ett antal olika däggdjursceller linjer njurceller är tillgängliga. Men dessa modeller har flera nackdelar. I många cellsystem proteinnivån av AQP2 är låg (tabell 1, M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, andra ektopiskt överuttrycker humana (MCD4, WT10) 11,12 eller råtta (CD8) 13 AQP2. I MCD4 och COS-7 celler V2-receptorn inte uttrycks. Till vår kännedom finns ingen permanent cellinje som en modell finns, som härrör från den renal inre medullär samlande kanalen, den del av njuren där AQP2 uttryck är mest förekommande, men från kortikala uppsamlingskanalen 1,11,13-16 . Sådana celler modeller är till exempel flitigt förevigade mpkCCD (t.ex. 17) eller de nyligen etablerade mTERT-CCD 14 cellinjer. Båda cellinjerna endogent uttrycka AQP2 och V2R men eftersom de är härledda frånkortikala uppsamlingskanalen troligen innehåller en annan proteomet jämfört med inre medullär uppsamlingskanal (IMCD) celler. De måste till exempel uttrycker annorlunda Na + transportsystem.

Här presenterar vi ett protokoll till kultur primära IMCD celler som uttrycker V2R och AQP2 endogent. Denna modell representerar därför närmast den fysiologiska situationen i den renala uppsamlingskanalen. Som upprättandet av kulturen kräver endast standardlaboratorieutrustning andra laboratorier kan lätt anta detta synsätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Framställning

  1. Förbereda odlingsskålarna
    1. Tina Kollagen Typ IV O / N vid 4 ° C och lös den i 0,1% steril ättiksyra. Volymen som ska användas beror på typ och antal rätter där cellerna ska ympas. Använd 2 | ig / cm 2.
    2. Inkubera rätter åtminstone under 1 h vid RT och tvätta två gånger med destillerat vatten (A. tridest).
    3. Låt disken torka ordentligt.
  2. Komplettering av mediet
    1. Öka glukos nivå upp till 4,5 g / L genom att tillsätta 1,75 g glukos till 500 ml medium. För att justera mediet till 600 mosmol, tillsätt 100 mM NaCl och 100 mM urea, för att öka osmolaritet av 200 mosmol och 100 mOsmol, respektive.
    2. Tillsätt 1% icke-essentiella aminosyror, 1% ultroser, 500 iM DBcAMP, 20 U / ml nystatin och 0,25 pg / ml gentamicin (1:200 spädning av stamlösning med en koncentration av 50 mikrogram / ml) till 600 mOsmol DMEM-medium nyligen på dagen för preparatet.
    Enzymlösning
    1. Tillsätt 1 mg / ml hyaluronidas och 2,2 mg / ml kollagenas till DPBS-innehållande 0,25 ug / ml gentamicin och nystatin. Bered en ml av denna enzymlösning för uppslutning av två njure inre medullae. Lösningen måste steriliseras genom filtrering och lagras i 50 ml Falcon-rör.

2. Odling av Primär Rat Inre Medullary uppsamlingskanal (IMCD) Celler

Alla djurhantering förfaranden som skall utföras i enlighet med lokala och federala lagar.

  1. Söva råttor i CO 2 (i en låda mättad med CO2) eller isofluran (U-400 Anestesi-enhet, Univentor Ltd, Malta, luftflöde 350-400 ml / min med 2-2,5% isofluran). Halshugga de djur för blödning som möjliggör exakt detektering av gränsen mellan den vitaktiga inre och den mörkare yttre märg. Dessutom minimerar blödning antalet isolerade erytrocyter. Ta njurar ochtvätta dem i sterila DPBS kompletterat med gentamicin och nystatin (se ovan) på is. Alla ytterligare steg skall utföras under sterila sterilbänk villkor.
  2. Överför njurar från DPBS lösningen på en steril kompress att avlägsna överflödig vätska. Avlägsna fet njure kapsel med steril pincett och sax.
  3. Efter att ha njuren fast fortfarande i kompress, skär något nästa till den längsgående axeln hos den yttre (kortikal) sidan. Se till att inte skära igenom helt, utan att lämna den i ett stycke, ansluten i njurbäckenet.
  4. Med böjd sax noggrant dissekera vitaktig inre medullae, som är omgivna av den rosé skimrande yttre märg. Samla dem i DPBS, innehållande gentamicin och nystatin i en 60 mm kultur maträtt på is.
  5. När alla medullae isoleras och samlas på is, minska volymen DPBS till en nivå där de bara täckt med buffert. Använd en steril rakblad för att skära medullae till kuber med 5mm 3.
  6. Smält och runt den vassa änden av en steril Pasteur pipett genom att hålla det kort i en låga. Kontrollera att pipetten kyls innan du fortsätter.
  7. Överför vävnaden suspensionen till 50 ml Falcon rör innehållande nygjord steril enzym lösning med hyaluronidas och kollagenas (se 1.3.1) genom att använda den rundade Pasteur pipett. Stäng locket tätt och inkubera vid 37 ° C under kontinuerlig omröring (220 rpm) i en vanlig bordsskiva vattenbad under 1,5 - 2 timmar.
  8. För finfördelning av suspensionen, pipettera blandningen upp och ned flera gånger med rund Pasteur pipett (se ovan) tills suspensionen blir homogent grumlig.
  9. Centrifugera suspensionen i 5 min vid 300 xg och 16 ° C. Kassera supernatanten, suspendera pelleten grundligt i DPBS, innehållande gentamicin och nystatin och centrifugera igen. Upprepa tvättningen steget gång.
  10. Resuspendera cellerna i fullt kompletterat medium och utsäde dem till culture rätter och / eller mikro-titer brunnar. Framställningen av 2 medullae (ett djur) kommer att ge tillräckligt många celler för en 60 mm odlingsskål.
  11. Efter 24 timmar, tvätta cellerna två gånger med 600 mosmol DMEM och tillsätt färskt medium. Under nästa vecka cellerna bör tvättas 2-3 gånger (Figur 1). 6-8 dagar efter ympning, kan IMCD celler användas för experiment. Kom ihåg att inkubera dem i medium utan DBcAMP och nystatin i 24 timmar innan experimentet. Annars AQP2 kommer att ligga enbart i plasmamembranet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den framgångsrika odling av primära celler från råtta IMCD kommer att resultera i en sammanhängande monoskikt 6-8 dagar efter sådd (figur 2). Per 60 mm kultur maträtt finns cirka 6 x 10 6 celler. Cellerna hålla tätt till odlingsskålarna, eftersom dessa belades med kollagen typ IV, en basalmembranet komponent 18. Därför kommer IMCD cellerna lossnar inte ens under flera grundliga tvättprocedurer. Upp till 80% av de odlade cellerna uttrycker endogent V2R och AQP2. Dessa är de huvudsakliga celler, medan de celler som saknar AQP2 anses inskjutna celler, icke-IMCD celler härledda från tunna delen av den Henles slynga, vasa recta eller inre medullära interstitiella celler. Som vi tidigare visat, förhindrar mediet osmolaritet 600 mosmol nedreglering av AQP2 19. Dessutom är AQP2 uttryckning upprätthålls genom att komplettera mediet med membran-permeabla cAMP analog DBcAMP. För att minska AQP2 plasma membRane uttryck och därmed gynna dess intracellulära lokalisering IMCD cellerna bör hållas utan DBcAMP ca 24 h före experimenten. Om större delen av AQP2 är lokaliserad i plasmamembranet under kontrollbetingelser, bör tiden för DBcAMP-fri odling förlängas. Lys av celler odlade i 60 mm odlingsskålar i vanliga buffertar ger 1,5 mg protein 10.

Vid kortvarig stimulering (30 min) med AVP eller forskolin, en direkt aktivator av adenylylcyklas, AQP2 translokeras från intracellulära vesiklar till plasmamembranet (figur 2). Dessutom ökar AQP2 expression i IMCD celler efter en 30 min utmaning med AVP eller forskolin (figur 3) 10. Ökningen AQP2 överflöd är oberoende av ökad transkription och translation. Forskolin eller AVP stimulering leder till inhibering av p38-mitogenaktiverade-protein-kinas (p38-MAPK), som är associerad med en minskning i nivån phosphorylation på serin 261 av AQP2 och en minskning av dess poly-ubiquitination. Således är ökningen av AQP2 överflöd vid stimulering tillskrivas minskad proteasomal nedbrytning 10. Sammantaget IMCD celler möjligt utreda de mekanismer som styr AQP2.

Cellinje Organism ATCC nummer eller referens
Caki Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al., 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et al., 1999 15, Hasler et al. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al., 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12

Tabell 1. Mammaliska njure cellinjer för studier av AQP2 kontrollmekanismer. Caki, mpkCCD och mTERT-CCD-celler uttrycker AQP2 endogent. I COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 och MDCK-cellinjer, är AQP2 knappast detekterbar. CD8, MCD4 och WT10 celler överuttrycker AQP2 ektopiskt.


Figur 1. Schematisk representation av förfarandet för fastställande IMCD cellkulturer. Anges är den ordning av experimentella stegen och de vardagar föredras för experimenten. Primära råtta IMCD celler sås på dag 0 och 1 vecka senare används för experiment. Siffror inom parentes hänvisar till respektive experimentella stegen som beskrivs under "Protocol".

Figur 2
Figur 2. AQP2 sätts in i plasmamembranet vid stimulering med AVP eller forskolin. IMCD Cellerna lämnades under kontrollbetingelser eller antingen stimulerades med 100 nM AVP eller 10 pM forskolin under 30 min vid 37 ° C. Celler analyserades med immunofluorescens-mikroskopi som described innan (LSM 710, Carl Zeiss mikrovisualisering, Jena, Tyskland) 10. Kärnor visualiserades med DAPI, var AQP2 detekterades med en skräddarsydd antikropp (röd, antikropp H27) 20,21. Övre panel, xy skanningar, nedre panelen, XZ genomsökningar. Skala barer, 20 uM.

Figur 3
Figur 3. AQP2 protein överflöd ökar vid stimulering med vasopressin (AVP) och forskolin. IMCD celler lämnades obehandlade (UTR) eller antingen stimulerades med 100 nM AVP (A) eller 10 ^ M forskolin (F) under 30 min vid 37 ° C. Celler lyserades och komplexa glykosylerad (AQP2 cg), hög mannos (AQP2 hm) och icke glykosylerat AQP2 (AQP2 ng) detekterades med immunoblot med användning av specifika antikroppar mot AQP2 (sc-9882, SantaCruz) såsom tidigare beskrivits 10. Som en laddningskontroll α-tubulin (CP06, Calbiochem) detekterades. Visas är ett representativt resultat från> 3 experiments. Molekylvikter anges (kDa).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterar ett detaljerat protokoll för beredning och odling av primära celler från råtta IMCD. Tillvägagångssättet ger upp till 21 cm 2 av celler från en råtta 20. Experimentet kräver standardutrustning cellkultur och kan utföras av en enda person inom cirka 6 timmar. Därför är denna metod lämplig som en standard laboratoriemetod.

Primära råtta IMCD celler kan seedas i kultur rätter av olika storlek, från 96 brunnar till 60 mm skålar. Men för tillväxt i 384 brunnsformat proceduren kräver optimering. Vi undviker att använda disk större än 60 mm som tillväxten avtog. Cellerna är lämpliga för en mängd experiment, såsom Western blotting, immunoutfällning, DNA / RNA-isolering, immunofluorescensmikroskopi, Ca 2 + avbildning och elektrofysiologi 10,22,23.

Cirka 6 till 8 dagar efter sådd, är primära IMCD celler vuxit till en conflödet monolager (Figur 2). Cellen höjd är 3 - 5 pm i genomsnitt 24, och cellerna är tätt fastsatt och upprätthålla en hög nivå av endogen AQP2 uttryck. Immunofluorescens mikroskopisk detektion av AQP2 indikerar att upp till 80% av cellerna representerar AQP2-positiva huvudsakliga celler (fig 3, 10,20). Morfologiskt cellerna kännetecknas av långa, raka cellkantlinjer, en kärna inbäddad i cytoplasman med en till tre nukleoler, och flera framstående cytoplasmiska granuler 20. Identiteten av de återstående 20% AQP2-negativa celler i kulturen har inte entydigt definierat. Maric et al. Genomfört faskontrastmikroskopi och immunofluorescens mikroskopiska analyser av tight junctions att visualisera cellgränser 20. I AQP2-negativa celler som de observerade böjda cellkantlinjer med fördjupningar och invaginations till sina angränsande celler och en utskjutande kärna med en nucleolus. Based på denna morfologi som skiljer sig från den hos AQP2-positiva celler, Maric et al. föreslog att majoriteten av AQP2-negativa celler är inskjutna celler. Dessutom innehåller den kultur som synes några fibroblaster 20. De blir bara uppenbart om kulturerna odlas i mer än 10 dagar när dessa celler börjar igenväxning de huvudsakliga cellerna. Under vår kultur skick fibroblast visa inte en typisk fibroblast utseende. I linje, Gonzalzez et al. Fann interstitiella celler i liknande primära IMCD cellkulturer 5-8 dagar efter sådd 25.

Primära IMCD cellkulturer beredd på lite olika sätt, men som har liknande egenskaper som de som beskrivs ovan används i andra laboratorier. Till exempel, Chou et al. Frö primära IMCD celler på plastytor som inte är belagda med kollagen 26. De primära IMCD celler framställda enligt endera protokollet verkar av samma höga kvalitetsåsom exempelvis båda är lämpliga för intracellulär Ca 2 +-mätningar 22,23,26. Omfattande listor med mRNA och proteiner som uttrycks i primära IMCD celler erhölls från transkriptionell profilering med hjälp Affimetrix teknik 27 och masspektrometrisk proteomanalys 28 (se även http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Begränsningar av primära IMCD celler, som för många primära celler, bland annat låga transfektion ränta (≈ 1% 29). Således överuttryck av proteiner är nästan bara möjligt om de kodande plasmider eller proteinerna själva mikroinjiceras (t.ex. 30). En ytterligare begränsning är bristen på ordentlig cellpolaritet av primära IMCD celler. Som svar på AVP, AQP2 translokerar huvudsakligen inom basolaterala plasmamembranet (figur 2). Våra försök att framkalla rätt polaritet, dvs

Sammantaget primära IMCD celler, fastställda såsom beskrivits ovan, besitter mekanismen för begränsning AQP2 och är därför en lämplig modell för att studera AQP2 reglering. Emellertid kräver användningen djur och bör därför begränsas till försök som inte kan utföras i andra etablerade modellsystem (se ovan) samt för validering av resultat som erhållits i andra modellsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL 1415/3-2 och KL 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Tags

Cellular Biology bioteknik genetik molekylärbiologi biokemi medicinsk teknik medicin farmakologi Intercellular Signalerande peptider och proteiner Exocytos signaltransduktion Second Systems Messenger signalering Kalcium hjärt-kärlsjukdomar Hormoner Ersättare Hormon och hormon antagonister Life Sciences (General) vatten reabsorption njure huvudsakliga celler vasopressin cykliskt AMP akvaporin djurmodell cellodling

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Odling Primär Rat Inre Medullary uppsamlingskanal Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter