Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrking Primær Rat Indre Medullary Samle Duct Cells

Published: June 21, 2013 doi: 10.3791/50366
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1,3, 1
1Anchored Signalling, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 2Leibniz Institute for Molecular Pharmacology (FMP), 3Charité University Medicine Berlin

ERRATUM NOTICE

Summary

Arginin-vasopressin (AVP) styrer finjustering av kroppen vann homeostase gjennom tilrettelegging vann reabsorpsjon av nyre rektor celler. Her presenterer vi en protokoll for dyrking av primære rotte indre medullært samle duct celler egnet for klarlegging av molekylære mekanismene bak AVP-mediert vann reabsorpsjon.

Abstract

Arginin-vasopressin (AVP) letter vann reabsorpsjon av nedsatt samle duct rektor celler og dermed finjusterer kroppen vann homeostase. AVP bindes til vasopressin V2-reseptorer (V2R) på overflaten av cellene og derved induserer syntese av cAMP. Dette stimulerer cellulære signalveier prosesser som fører til forandringer i fosforylering av vannkanalen aquaporin-2 (AQP2). Protein kinase A phoshorylates AQP2 og dermed utløser translokasjon av AQP2 fra intracellulære vesikler til plasmamembranen tilrettelegge vann reabsorpsjon fra grunnskole urin. Avvik av AVP utgivelse fra hypofysen eller AVP-aktivert signalering i viktigste celler kan forårsake sentrale eller nefrogen diabetes insipidus, henholdsvis; en forhøyet blodplasma AVP nivå er assosiert med kardiovaskulære sykdommer som kronisk hjertesvikt og syndromet med uhensiktsmessig antidiuretisk hormon.

Her presenterer vi en protokoll for cultivatipå av primære rotte indre medullært samle duct (IMCD) celler, som uttrykkelig V2R og AQP2 endogent. Cellene er egnet til å belyse molekylære mekanismer som ligger til grunn for styring av AQP2 og således for å oppdage nye stoffet mål for behandling av sykdommer assosiert med feilregulering av AVP-mediert vann-reabsorpsjon. IMCD celler blir oppnådd fra rotte nyre indre medullae og brukes til eksperimenter seks til åtte dager etter såing. IMCD celler kan dyrkes i vanlige cellekultur retter, kanner og mikro-titer plater av ulike formater, krever prosedyren bare noen få timer, og passer for standard cellekultur laboratorier.

Introduction

I renale oppsamlende kanalsystem primære celler, styrer arginin-vasopressin (AVP) vann-reabsorpsjon ved å stimulere innsetting av vannkanalen aquaporin-2 (AQP2) inn i plasmamembranen. AVP binder til G-protein-koblet vasopressin type-2 reseptor (V2R) stimulerer adenylyl cyclase og derved cAMP-dannelse. Initiering av denne signaleringskaskade fører til aktivering av proteinkinase A (PKA). PKA fosforylerer AQP2 ved serin 256 (S256), som er den sentrale trigger for dens omfordeling fra intracellulære vesikler inn i plasmamembranen. Membranen innsetting forenkler vann reabsorpsjon langs en osmotisk gradient og finjusterer kroppen vann homeostase.

Feilregulering av AVP-mediert reabsorpsjon vann, på grunn av avvik av AVP sekresjon eller AVP-aktiverte signalering forårsaker eller er forbundet med alvorlige sykdommer. Redusert vann reabsorpsjon forårsaket av mutasjoner av V2R eller AQP2 fører til nefrogen diabetes insipidus, mens en elevrerte blodplasma AVP nivå er assosiert med overdreven vann reabsorpsjon i kardiovaskulære sykdommer som kronisk hjertesvikt og syndromet med uhensiktsmessig antidiuretisk hormon (SIADH).

Betydningen av AVP-mediert vann-reabsorpsjon stammer ikke bare fra dens implikasjon i sykdommen. AVP-indusert translokasjon av AQP2-bærende vesikler til og fusjonsproteiner med plasmamembranen representerer et strengt cAMP-avhengig exocytic prosess, som for tiden ikke fullt ut forstått. Andre eksempler for en cAMP-avhengig exocytosis er renin sekresjon i nyrene og H + sekresjon i magen. Derfor belysning av molekylære mekanismer som styrer AQP2-translokasjon fra nyre prinsipielle celler ikke bare hjelper til å forstå tilsvarende molekylære prosesser i andre celletyper, men kan også legge til rette beskrives nye metoder for behandling av sykdommer forbundet med forstyrrelser av AVP-mediert vann reabsorpsjon .

Elucidating mekanismer styrer AQP2 krever samle duct viktigste cellemodeller. Til dette benyttes en rekke forskjellige pattedyrceller nyre cellelinjer er tilgjengelige. Men disse har flere ulemper. I mange celle systemer protein nivået av AQP2 er lav (tabell 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, andre ectopically overexpress menneskelige (MCD4, WT10) 11,12 eller rotte (CD8) 13 AQP2. I MCD4 og COS-7 celler V2 reseptoren ikke er uttrykt. Så vidt vi vet er det ikke permanent cellelinje som modell er tilgjengelig, som er avledet fra den renale indre medullær samle kanalsystem, at en del av nyre hvor AQP2 uttrykk er mest rikelig, men fra den kortikale samle kanalsystem 1,11,13-16 . Slike cellemodeller er for eksempel mye brukt udødeliggjort mpkCCD (f.eks 17) eller den nylig etablerte mTERT-CCD 14 cellelinjer. Begge cellelinjer endogent express AQP2 og V2R men siden de er utledet frakortikale samle duct mest sannsynlig inneholde en annen Proteomet forhold til indre medullært samle duct (IMCD) celler. De må for eksempel uttrykke forskjellige Na + transportsystemer.

Her presenterer vi en protokoll til kultur primære IMCD celler uttrykker V2R og AQP2 endogent. Denne modellen utgjør derfor mest nært den fysiologiske situasjon i den renale oppsamlende kanalsystem. Som etablere kulturen krever bare standard laboratorieutstyr andre laboratorier kan lett vedta denne tilnærmingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Forberedelse

  1. Forberedelse av kultur retter
    1. Tine Collagen Type IV O / N ved 4 ° C og oppløse den i 0,1% steril eddiksyre. Volumet å bruke, avhenger av type og antall retter der cellene er å bli seedet. Bruk 2 mikrogram / ​​cm 2.
    2. Inkuber retter i det minste i 1 time ved RT og vask to ganger med destillert vann (A. tridest).
    3. La det tørke skikkelig.
  2. Tilskudd av medium
    1. Øk glukosenivået opp til 4,5 g / L ved tilsetning av 1,75 g glukose til 500 ml medium. Å justere medium til 600 mosmol, tilsett 100 mM NaCl og 100 mm urea, for å øke osmolaritet av 200 mosmol og 100 mosmol, henholdsvis.
    2. Tilsett 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% ultroser, 500 uM DBcAMP, 20 U / ml nystatin og 0,25 pg / ml gentamicin (1:200 fortynning av stamløsningen med en konsentrasjon på 50 ug / ml) til 600 mosmol DMEM medium nystekte på dagen for forberedelse.
    Enzymoppløsning
    1. Tilsett 1 mg / ml hyaluronidase og 2,2 mg / ml kollagenase til-DPBS inneholdende 0,25 ug / ml gentamicin og nystatin. Forbered 1 ml av denne enzymoppløsning for fordøyelsen av to nyre indre medullae. Løsningen må steriliseres ved filtrering og lagres i 50 ml Falcon-rør.

2. Dyrking av Primary Rat Indre Medullary Samle Duct (IMCD) Cells

Alle dyr håndtering prosedyrer skal utføres i samsvar med lokale og føderale lover.

  1. Anaesthetize rotter i CO 2 (i en boks mettet med CO 2) eller isofluran (U-400 Anestesi enhet, Univentor Ltd, Malta; luftstrøm 350-400 ml / min med 2-2,5% isofluran). Halshogge dyrene for blødninger som tillater presis påvisning av grensen mellom hvitaktig indre og mørkere ytre marg. I tillegg minimaliserer blødning antall isolerte erytrocytter. Fjern nyrer ogvaske dem i sterile DPBS supplert med gentamicin og nystatin (se over) på is. Alle ytterligere skritt skal utføres under sterile rene benk forhold.
  2. Overfør nyrer fra DPBS løsning på en steril kompress for å fjerne overdreven væske. Fjern fatty nyre kapsel med steril pinsett og saks.
  3. Etter å ha nyrene fremdeles festet i komprimere, kappet ved siden av den langsgående aksen til det ytre (kortikale) siden. Pass på ikke å skjære gjennom helt, men å la den i ett stykke, koblet i nyrebekken.
  4. Med buet saks nøye dissekere hvitaktig indre medullae, som er omgitt av rosé glitrende ytre marg. Samle dem i DPBS, inneholder gentamicin og nystatin i en 60 mm kultur tallerken på is.
  5. Når alle medullae er isolert og samlet på isen, redusere volumet av DPBS til et nivå hvor de er bare dekket med buffer. Bruk en steril barberblad å kutte medullae i terninger av 5mm 3.
  6. Smelt og rundt den skarpe enden av en steril Pasteur pipette ved å holde det kort inn i en flamme. Kontroller at pipetten er avkjølt før du fortsetter.
  7. Overfør den vev-suspensjon til 50 ml Falcon-rør inneholdende nylagede steril enzym-oppløsning med hyaluronidase og kollagenase (se 1.3.1) ved hjelp av den avrundede Pasteur pipette. Lukk lokket tett og inkuberes ved 37 ° C under kontinuerlig omrøring (220 rpm) i en vanlig bordplate vannbad i 1,5 til 2 timer.
  8. For finfordeling av suspensjonen, pipetter blandingen opp og ned flere ganger med den runde Pasteur pipette (se ovenfor) til suspensjonen blir homogent uklart.
  9. Sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 300 x g og 16 ° C. Kast supernatanten, resuspender pelleten grundig i DPBS, inneholder gentamicin og nystatin og sentrifuger igjen. Gjenta dette vasketrinnet gang.
  10. Resuspender cellene i fullt supplert medium og frø dem inn culture retter og / eller mikro-titer brønnplater. Utarbeidelse av to medullae (1 dyr) vil gi tilstrekkelig celler for en 60 mm kultur parabolen.
  11. Etter 24 timer, vaske cellene to ganger med 600 mosmol DMEM og legge friske medium. I løpet av den neste uke cellene skal vaskes 2-3 ganger (figur 1). 6-8 dager etter såing, kan i IMCD cellene brukes til eksperimenter. Husk å inkubere dem i medium uten DBcAMP og nystatin i 24 timer før start av eksperimentet. Ellers AQP2 vil være lokalisert kun i plasmamembranen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede dyrking av primære rotte IMCD celler vil resultere i et konfluent monolag 6-8 dager etter såing (figur 2). Per 60 mm kultur fatet er det ca 6 x 10 6 celler. Cellene tett forholde seg til kultur retter, da disse ble belagt med kollagen type IV, en kjeller membran komponent 18. Derfor vil IMCD cellene ikke koble selv under flere grundige vaskeprosedyrer. Opptil 80% av de dyrkede celler uttrykker endogent V2R og AQP2. Disse er de viktigste cellene, mens cellene mangler AQP2 anses mellomlag celler, ikke-IMCD celler avledet fra tynne lemmer av loopen av Henle, vasa recta eller indre medullære interstitiell celler. Som vi tidligere har vist, hindrer medium osmolaritet på 600 mosmol nedregulering av AQP2 19. I tillegg er AQP2 ekspresjon opprettholdes ved supplering av mediet med den membran-gjennomtrengelige cAMP analog DBcAMP. For å redusere AQP2 plasma medl.rane uttrykk og dermed favorisere sin intracellulær lokalisering i IMCD cellene skal holdes uten DBcAMP ca 24 timer før forsøkene. Dersom det vesentligste av AQP2 er lokalisert i plasma membran under kontroll forhold, bør tidspunktet for DBcAMP gratis dyrking bli forlenget. Lyse av celler dyrket i 60 mm kultur retter i standard buffere gir 1,5 mg protein 10.

Ved kortvarig stimulering (30 min) med AVP eller forskolin, en direkte aktivator av adenylyl syklase, AQP2 translocates fra intracellulære vesikler til plasmamembranen (figur 2). I tillegg øker AQP2 uttrykk i IMCD celler på en 30 min utfordring med AVP eller forskolin (figur 3) 10. Økningen i AQP2 overflod er uavhengig av økt transkripsjon og oversettelse. Forskolin eller AVP stimulering fører til hemming av p38-mitogen-aktivert protein-kinase (p38-MAPK), som er assosiert med en reduksjon i nivået av phosphorylation på serin 261 av AQP2 og en reduksjon i sin poly-ubiquitinering. Dermed er økningen av AQP2 overflod ved stimulering tilskrives redusert proteasomal degradering 10. Til sammen IMCD celler tillate undersøke mekanismene som styrer AQP2.

Cellelinje Organisme ATCC Nummer eller Reference
Caki Homo sapiens HTB-46
CD8 Homo sapiens Valenti et al. 1996 13
COS-7 Cercopithecus aethiops CRL-1651
HEK293 Homo sapiens CRL-1573
LLC-PKI Sus scrofa CL-101
M1 Mus musculus CRL-2038
MCD4 Mus musculus Iolascon et al., 2007 11
MDCK Canis familiaris CRL-2935
mpkCCD Mus musculus Bens et al. 1999 15, Hasler et al. 2002 16
mTERT-CCD Mus musculus Steele et al., 2010 14
WT10 Canis familiaris Deen et al., 1997 12

Tabell 1. Pattedyr nyre cellelinjer for studier av AQP2 kontrollmekanismer. Caki, mpkCCD og mTERT-CCD celler uttrykker AQP2 endogent. I COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 og MDCK cellelinjer, er AQP2 knapt synlig. CD8, MCD4 og WT10 celler overexpress AQP2 ectopically.


Figur 1. Skjematisk fremstilling av prosedyren for etablering IMCD cellekulturer. Angitt er rekkefølgen av eksperimentelle trinnene og ukedager foretrukket for forsøkene. Primære rotte IMCD celler utsådd på dag 0, og en uke senere er brukt til eksperimenter. Tallene i parentes viser til de respektive eksperimentelle fremgangsmåten som er beskrevet under "Protocol".

Figur 2
Figur 2. AQP2 settes inn i plasmamembranen ved stimulering med AVP eller forskolin. IMCD celler ble igjen under kontroll forhold eller enten stimulert med 100 nM AVP eller 10 mikrometer forskolin i 30 min ved 37 ° C. Celler ble analysert ved immunofluorescens-mikroskopi som described før (LSM 710, Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Tyskland) 10. Atomkjerner ble visualisert med DAPI ble AQP2 oppdages med en skreddersydd antistoff (rød; antistoff H27) 20,21. Øvre panel, xy skanner, nedre panel, XZ skanninger. Scale barer, 20 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. AQP2 protein overflod øker ved stimulering med vasopressin (AVP) og forskolin. IMCD batteriene var ubehandlet (UTR) eller stimulert med enten 100 nM AVP (A) eller 10 uM forskolin (F) i 30 min ved 37 ° C. Cellene ble lysert og komplekse glycosylated (AQP2 CG), høy mannose (AQP2 hm) og ikke glycosylated AQP2 (AQP2 ng) ble oppdaget av immunoblot hjelp av spesifikke antistoffer mot AQP2 (sc-9882, SantaCruz) som tidligere beskrevet 10. Som en lasting kontroll α-tubulin (CP06, Calbiochem) ble oppdaget. Vist er et representativt resultat fra> 3 experiments. Molekylvekt er indikert (KDA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en detaljert protokoll for utarbeidelse og dyrkning av primære rotte IMCD celler. Fremgangsmåten gir opp til 21 cm 2 av celler fra en rotte 20.. Forsøket krever standard cellekultur utstyr og kan utføres av en enkelt person innen omtrent 6 timer. Derfor er denne metode godt egnet som en standard laboratoriemetode.

Primære rotte IMCD celler kan bli seedet i kultur retter av ulik størrelse, fra 96 ​​brønners plater til 60 mm retter. Men for vekst i 384 brønns prosedyren krever optimalisering. Vi unngår å bruke retter større enn 60 mm som veksten avtatt. Cellene er egnet for en rekke eksperimenter for eksempel Western blotting, immunoprecipitation, DNA / RNA isolering, immunfluorescens mikroskopi, Ca 2 + bildebehandling og elektrofysiologi 10,22,23.

Ca 6-8 dager etter såing, er primære IMCD celler vokst til en confluent monolag (figur 2). Cellen høyde er 3-5 mikrometer i gjennomsnitt 24, og cellene blir godt festet og opprettholde et høyt nivå av endogen AQP2 ekspresjon. Immunfluorescens mikroskopisk påvisning av AQP2 indikerer at opptil 80% av cellene representerer AQP2-positive primære celler (figur 3; 10,20). Morfologisk cellene er preget av lange, rette kantlinjer, en kjerne innebygd i cytoplasma med 02:59 nucleoli, og flere prominente cytoplasma granulater 20. Identiteten av de resterende 20% AQP2-negative celler i kultur har ikke blitt utvetydig definert. Maric et al. Gjennomført fase-kontrast mikroskopi og immunfluorescens mikroskopiske analyser av trange veikryss å visualisere cellegrensene 20. I AQP2-negative celler observert de buede cellerammer med fordypninger og invaginations til sine naboland celler og en utstående nucleus med en kjerne. Based på denne morfologi som er forskjellig fra det av AQP2-positive celler, Maric et al. antydet at flertallet av AQP2-negative celler er Intercalated celler. I tillegg inneholder kulturen tilsynelatende noen fibroblaster 20.. De bare bli tydelig hvis de kulturene er dyrket i mer enn 10 dager da disse cellene begynner gjengroing de viktigste cellene. Under vår kultur tilstand fibroblast viser ikke et typisk fibroblast utseende. I tråd, Gonzalzez et al. Fant interstitiell celler i lignende primære IMCD cellekulturer 5-8 dager etter såing 25.

Primære IMCD cellekulturer fremstilt på litt forskjellige måter, men som har lignende egenskaper som de som er beskrevet ovenfor brukes i andre laboratorier. For eksempel, Chou et al. Frø primære IMCD celler på plast overflater som ikke er belagt med kollagen 26. De primære IMCD cellene fremstilt ifølge protokoll enten virke av lignende høy kvalitetsom for eksempel begge er egnet for intracellulær Ca2 + målinger 22,23,26. Omfattende lister over mRNA og proteiner uttrykt i grunnskolen IMCD cellene ble hentet fra transcriptional profilering hjelp Affimetrix teknologi 27 og massespektrometrisk proteom analyse 28 (se også http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Begrensninger av primære IMCD celler, som for mange primære celler, blant annet lav transfeksjon rate (≈ 1% 29). Således overekspresjon av proteinene er nesten bare mulig hvis de kodende plasmider eller proteiner selv er microinjected (for eksempel 30). En ytterligere begrensning er mangelen på skikkelig mobilnettet polaritet av primære IMCD celler. I respons til AVP, AQP2 translocates hovedsakelig innen basolateral plasmamembranen (figur 2). Våre forsøk å indusere riktig polaritet, dvs.

Til sammen primære IMCD celler, etablert som beskrevet ovenfor, har maskineriet for å kontrollere AQP2 og er derfor en egnet modell for å studere AQP2 regulering. Imidlertid krever bruken av dyr, og bør derfor være begrenset til eksperimenter som ikke kan utføres i andre etablerte modellsystemer (se ovenfor) og for validering av resultatene som ble oppnådd i andre modellsystemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL 1415/3-2 og KL 1415/4-2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagen Type IV Mouse BD Biosciences 356233
Hyaluronidase SIGMA H6254
Collagenase type CLS-II Biochrom AG C2-22
DMEM + GlutMAX Invitrogen GIBCO 21885108
Nystatin SIGMA N4014
Ultroser G Cytogen 15950-017
Non essential amino acids (NEA) Biochrom AG K0293
Gentamicin Invitrogen GIBCO 15710
DBcAMP BIOLOG D009

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
  2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
  3. Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
  4. Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
  5. Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
  6. Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
  7. Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
  8. Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
  9. Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
  10. Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
  11. Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
  12. Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
  13. Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
  14. Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
  15. Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
  16. Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
  17. Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
  18. Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
  19. Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
  20. Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
  21. Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
  22. Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
  23. Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
  24. Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
  25. Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
  26. Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
  27. Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
  28. Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
  29. Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
  30. Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).

Tags

Cellular Biology bioteknologi genetikk molekylærbiologi biokjemi Biomedical Engineering medisin farmakologi intercellulært signalveier Peptider og proteiner exocytosis Signal Transduksjon andre messenger Systems kalsium signalisering hjerte-og karsykdommer hormoner hormon erstattere og hormon antagonister miljø-og biovitenskap (General) vann reabsorpsjon nyre rektor celler vasopressin syklisk AMP aquaporin dyremodell cellekultur

Erratum

Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 08/28/2013. Citeable Link.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman

Dyrking Primær Rat Indre Medullary Samle Duct Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann,… More

Faust, D., Geelhaar, A., Eisermann, B., Eichhorst, J., Wiesner, B., Rosenthal, W., Klussmann, E. Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. J. Vis. Exp. (76), e50366, doi:10.3791/50366 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter