Summary
유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.
Abstract
환자 유래 iPSC는 미래의 자가 세포 치료 프로토콜을 위한 세포의 귀중한 근원일 수 있었습니다. iPSC 유래 근생 줄기/전구세포는 pericyte 유래 메소포아세포(iPSC 유래 메산지오블라스트와 같은 줄기/선조 세포: IDEM)와 유사한 근간이 영양증의 다른 형태에 의해 영향을 받는 환자로부터 생성된 iPSC에서 확립될 수 있다. 환자 별 IDEM은 다른전략(예: 렌즈피바이러스 벡터, 인간 인공 염색체)으로 유전적으로 교정될 수 있으며 근추행성 조절기 MyoD의 과발현시 근생 분화 가능성을 향상시킬 수 있다. 이 근생 잠재력은 그 때 특정 분화 분석과 시험관 내 평가되고 면역 형광에 의해 분석됩니다. IDEM의 재생 잠재력은 급성 및 만성 근육 재생을 표시하는 두 개의 대표적인 마우스 모델에서 근육 내 및 동맥 이식시 생체 내에서더 평가됩니다. 숙주 골격 근육에 IDEM의 기여는 이식 된 마우스에서 다른 기능 테스트에 의해 확인됩니다. 특히, 동물의 운동 능력의 개량은 러닝머신 테스트와 함께 연구된다. 세포 이식 및 분화는 이식된 근육에 대한 다수의 조직학적 및 면역형분석서에 의해 평가된다. 전반적으로, 본 논문은 현재 IDEM의 분화 능력을 평가하기 위해 활용되고 있는 분석 및 도구를 설명하며, 이식 방법과 세포 이식의 효능을 분석하기 위한 후속 결과 측정에 초점을 맞추고 있다.
Introduction
중안지오블라스트(MABs)는 복막1-3의하위 집합에서 유래된 혈관 관련 근육 전구체이다. 위성 세포 와 같은 표준 근육 전조를 통해 MABs의 주요 장점은4 동맥 내 전달 될 때 혈관 벽을 교차하는 능력에 상주하므로 세포 치료 프로토콜에서 골격 근 재생에 기여합니다. 이 기능은 근육 이영양증1,5,6의뮤린 및 개 모델 모두에서 평가및 확인되었습니다. 이러한 전임상 연구는 듀첸 근 위축증을 가진 아이들에 있는 기증자 HLA 동일 MABs의 동맥 이식에 근거를 둔 첫번째 인맨 단계 I/II 임상 시험을 위한 기초를 건설했습니다 (EudraCT No. 2011-000176-33; 현재 밀라노의 산 라파엘레 병원에서 가고 있습니다). 세포 치료 접근의 주요 장애물 중 하나, 세포의 수십억 전신의 근육을 치료 하는 데 필요한, "약용 제품"의 제한 된 증식 잠재력 (세포). 더욱이 최근에는 사지 거들 근이영양증 2D(LGMD2D)에서 발생하기 때문에 일부 형태의 근이영양증에 의해 영향을 받는 환자로부터 MAB를 얻을 수 없다는 것이 입증되었습니다. 오마이걸 #608099)7.
이러한 한계를 극복하기 위해 인간 및 뮤린 iPSC로부터 MAB와 같은 줄기/전구 세포를 유도하기 위한 프로토콜이 최근에 수립되었다7. 이 절차는 혈관 유전자 서명 및 면역 페노타입을 가진 쉽게 확장 가능한 세포 인구를 생성합니다 성인 근육 유래 MABs와 매우 유사합니다. 근생 조절 요인 MyoD의 발현시, 뮤린과 인간 IDEM(각각 MIDEM 및 HIDEM)은 말단 골격 근 분화를 겪습니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 IDEM은 구성적으로 또는 유도 할 수없는 방식으로 MyoD 식을 구동 할 수있는 벡터로 변환 할 수 있습니다8-10. 에스트로겐 수용체(MyoD-ER)와 융합된 MyoD cDNA를 함유한 렌즈바이러스 벡터가 사용되어 타목시펜(에스트로겐 유사체) 투여 시 핵 전좌를허용한다(11). 이 전략은 고효율7을가진 비대성 다중 핵처리된 심포우의 형성을 초래한다. 특히, IDEM은 비종양성이며 이식 시 숙주 근육을 이식하고 분화할 수 있으며 다른벡터(예: 렌즈바이러스 또는 인간 인공 염색체)를 사용하여 유전적으로 교정할 수 있으며, 미래의 자가 치료 전략을 위한 길을 열어주고 있습니다. IDEM의 파생, 특성화 및 이식은 상기 간행물7에기재되었다. 본 프로토콜 논문은 IDEM의 체외 근생 분화를 평가하기 위해 수행된 분석서와 근육 재생의 마우스 모델에서 이식의 효능을 테스트하기 위한 후속 결과 측정을 상세히 설명합니다.
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Protocol
1. 근생 및 이식 잠재력 평가
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시험관 내: MyoD 유도 분화
- 타목시펜 유도할 수 없는 MyoD-ER 렌티바이러스 벡터로 유도된 IDEMs의 안정적인 세포줄을 생성하여 감염의 복합성을 적시(MOI; 예를 들어, 1, 5 및 50) 1.1.9(MyHC)에 기재된 염색을 절차의 효율의 결과로 사용한다.
- 3.5cm 접시에 1ml의 5ml의 트리겔을 코팅하고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 3.5cm 조직 배양접시에서 중간, 종자 1 x 105 MyoD-ER 변환 된 IDEM으로 접시를 두 번 세척하고 성장 배지에서 37 °C에서 배양하십시오.
- 세포가 1~2일 만에 합류에 도달한 다음 1μM 4OH-타목시펜을 성장 배지(1st dose)에 추가할 것으로 예상합니다.
- 24 시간 후, 1 μM 4OH-타목시펜 (2nd 및 마지막 복용량)으로 보충 된 분화 매체로 성장 배지를 교체하십시오.
- 매체의 절반을 매일 신선한 분화 매체로 교체하십시오.
- 매일 myotube 형성문화를 살펴본다.
- 1 주일 후 (분화 매체에서 5 일), PBS로 부드럽게 접시를 씻어 RT에서 5 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 고정합니다.
- myosin 무거운 사슬에 대하여 항체로 염색하는 면역 형광을 수행 (MyHC) myotubes의 존재를 확인하기 위하여. 핵염료를 가진 카운터스테인(예 : Hoechst).
분화의 효율은 MyHC 양성 세포 내부의 핵 백분율로 평가된다: 효율이 >50%인 경우 다음 단계로 진행한다.
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생체 내: 급성 근육 재생의 모델에 이식
근육 재생에 MyoD-ER IDEM의 생체 내 기여를 평가하기 위해, 세포는 이전에 조직 내부를 추적할 수 있게 해주는 녹색 형광성 단백질(GFP)에 대한 벡터 인코딩으로 표지된다. MyoD-ER GFP IDEM은 심근 절제술(예 : 심장 독소)으로 이전에 부상 성인 뮤린 근육으로 주입됩니다. 제노제닉(HIDEMs 등) 또는 유전자 조작/교정 세포에 대한 면역 거부를 피하기 위해서는 면역결핍또는 면역억제된 마우스를 사용해야 합니다.- 이식 일 전에 하룻밤 동안 1 μM 4OH-tamoxifen (수성 형태)를 추가 이식 및 퇴각 세포 24 시간 전에 10 mg / ml 타목 시펜 (liposoluble 형태)의 3.5 μl / g의 복막 주사로 동물을 후퇴.
- 동물 시설에서 외과 적 절차를 조절하는 특정 지침에 따라 마우스에 마취 및 진통을 투여하십시오.
- 100 μM 심장 독소의 25 μl을 주입 (CTX; 나야 mossambica mossambica에서; 주의: 잠재적으로 유해한 물질) 티비알리스 전방 (TA) 근육에.
- 타목시펜과 CTX로 동물을 치료한 후 24시간, 트립시니화와 카운트에 의해 세포를 분리한다.
- 5 분 동안 232 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
- Ca2+및 Mg2+-free PBS, 원심분리기에서 세포 펠릿을 부드럽게 재연한 다음 Ca2+및 Mg2+-free PBS를 106 세포/30 μl의 최종 농도로 세척하여 각 주사의 최종 부피가 됩니다.
- 29 G 또는 30 G 바늘을 사용하여 이전에 부상을 입은 근육에 세포 현탁액 30 μl을 주입하십시오. 근육에서 바늘을 제거 하는 동안 특정 관심을 지불 합니다. 바늘의 트랙을 통해 세포 현탁액을 흘리는 것을 피하면서 천천히 하십시오. 반대로 TA를 이식하고 대조군으로 사용하지 마십시오, Ca2 +의30 μl을 주입 - Mg 2+무료 PBS이식 하나의 조건을 복제.
- 동물을 6일 추가로 치료하고진통제(예: 카프로펜)를 2일 더 투여한다.
- 이식 후 14일 후에 근육을 제거합니다. 프로토콜 4 및 5에 상세한 대로 샘플을 처리하고 분석합니다.
2. 근 이영양증의 마우스 모형에 있는 이식
이 이식 분석법은 근 이영양증의 마우스 모형에 있는 I뎀의 이식의 정도를 평가할 수 있습니다. 다음과 같이 취급되는 동물은 또한 질병 표현형의 기능적 개량에 대해 평가될 수 있다. 기능성 검사는 이식 후 2주에서 부터 수행될 수 있습니다. 이식을 향상시키기 위해 사전 이식 러닝 머신 운동을 수행하는 것을 고려 (프로토콜에 설명 된 대로 3) 및 / 또는 3 x(즉, 총 3 주사 / 근육)에 대한 3 주마다 연쇄 세포 주사를 수행.
- 근육 이식
- 이식 일 전에 하룻밤 동안 성장 배지에 1 μM 4OH-tamoxifen (수성 제형)를 추가 이식 및 퇴각 세포 24 전에 24 mg / ml 타목 시펜 (liposoluble 제제)의 3.5 μl/g의 복막 내 주입동물을 퇴각.
- 트립시화에 의해 분리, 카운트 및 원심 분리 에 세포를 232 x g에 5 분.
- Ca2+및 Mg2+-free PBS, 원심분리기및 Ca2+의펠릿을 다시 중단한 다음 Mg2+-무료 PBS를 106 세포/30 μl의 농도로 세척합니다.
- 진통제를 투여하고 동물의 피부를 소독 (선택 사항) 포비도 요오드 또는 클로르치신 기반 소독제로. 이것은 또한 티파리스 전방 (TA), 위장혈증 (GC), 및 사두근 페모리스 (QC; 특히 광대 스 부종)근육을 국소화하는 데 도움이됩니다.
- 29 G 또는 30 G 바늘을 가진 주사기를 사용하여 근육에 세포 현탁액 의 30 μl을 주입하십시오. TA의 경우, 경골에 비해 15° 경사로 근접 힘줄(두개골 방향)을 삽입한 바늘 2mm 의 바늘을 삽입하고 바늘을 후퇴시키면서 천천히 세포 현탁액을 주입합니다(근육 내부에 있는 바늘의 2mm를 비우세요). GC 및 QC의 경우, 주요 차이점은 GC에 대한 아킬레스 건의 심오텐스 접합부 위에 바늘 2mm의 코도나디알 삽입과 함께, QC에 대한 단면 힘줄(대퇴골에 대하여 15° 경사)을 반복한다. 바늘의 트랙을 통해 세포 현탁액을 흘리지 않도록 근육에서 바늘을 제거하는 동안주의를 기울이라.
문제 해결: 이식이 낮은 경우 3 x 105 세포/10 μl을 가진 청소년(1-2주 전) 마우스7을 주입하는 것을 고려합니다(이 경우 타목시펜은 피하 투여되어야 한다는 점에 유의하십시오).
- 동맥 내 이식
프로토콜의 이 부분은 미뎀과 HIDEM이 동맥 순환에서 전달되는 능력의 평가를 허용하고, 혈관 벽을 교차하고, 사출 부위로 하류근육의 골격 근 재생에 기여한다.- 상기 와 같이 피트리트는 2.1.1 단계에서 상술한 동물과 세포를 후퇴한다.
- 40 μm 세포 스트레이너로 트립시화 및 필터에 의한 분리 (타목시펜에 하룻밤 노출이 인접한 세포에서 myotube의 융합 및 형성을 구동 할 수있는 가능성 드문 경우에 세포 서스펜션에서 클러스터를 제거하기 위해) 카운트 와 원심 분리 셀 232 x g에서 5 분
- Ca2 +- 및 Mg2 +-무료 PBS, 원심 분리기에서 펠릿을 다시 한 다음 Ca 2 + 및 Mg2+무료 PBS0.2 인터내셔널에서 셀 펠릿을 세척하십시오.
106 세포/50 μl의 최종 세포 농도에 헤파린 나트륨(선택 사항)의 단위. 10% 특허 청색 염료(최종 농도: 일반 식염수 또는 Ca2+에서1.25 mg/ml, Mg2+-free PBS)를 용액에 추가하여 세포 현탁액의 분포를 시각화합니다. - 특정 기관 동물 시설에서 외과 적 절차를 조절하는 지침에 따라 마우스에 마취 및 진통을 투여하십시오.
- 잉구이날 영역(대퇴 또는 스카파의 삼각형이라고도)을 면도하고 포비도네 요오드 또는 클로르헤시딘 기반 소독제로 피부를 소독합니다.
- 정맥, 동맥 및 신경 (신경은 동맥과 정맥내측에 측면으로 놓이면) : 5-7mm 절개를하고 대퇴 골번드를 국소화하십시오.
- 번들을 집게하는 결합 근막을 부드럽게 제거합니다.
- 대퇴 정맥과 신경을 동맥과 분리하여 집게의 끝(또는 30 G 바늘)을 부드럽게 도입하고 구멍을 점진적으로 확대합니다.
문제 해결: 대퇴 정맥은 깨지기 쉽습니다: 대퇴동맥에서 분리하는 동안 집게로 꼬집지 않도록 주의를 기울이세요. 출혈의 경우, 멸균 거즈로 혈액을 배출하고 혈종을 용이하게하기 위해 마이크로 소작을 사용합니다. - 집게의 한 쪽 끝으로 동맥을 들어 올리고 다른 팁으로 동맥을 고정시하십시오.
- 30G 바늘이 장착된 주사기로 동맥에 구멍을 뚫습니다. 약 5 μl/sec의 주입 속도로 클램프 영역의 셀 서스펜션 하류 50 μl을 주입하십시오.
문제 해결: 주사 전에 주사기의 세포를 조심스럽게 재중단: 주사기 내부의 세포 및 기포 형성의 침전을 피하는 것이 중요합니다. 대퇴동맥의 직경은 30G 바늘보다 약간 작습니다: 바늘을 삽입하는 동안 동맥을 트렁크리지 않도록 주의하십시오. 특허 블루 염료는 주입의 효과를 인식 할 수 있습니다 : 올바르게 주입하면 전체 사지가 빠르게 밝은 파란색으로 변합니다. - 천천히 사지의 혈류를 복원하기 위해 동맥에서 바늘과 집게를 제거합니다.
- 필요에 따라 출혈 및/또는 소작을 피하기 위해 멸균 거즈로 압력을 가하십시오.
- 상처를 봉합하고 마취에서 회복 될 때까지 동물을 모니터링합니다.
- 3 일 동안 진통을 관리하고 매일 상처를 검사하십시오 (상처 감염의 경우 동물 시설 요원과 이에 대해 논의하고 필요에 따라 항생제를 투여하십시오).
3. 이식 된 영양실조 동물에 대한 결과 조치 : 러닝 머신 테스트
세포 이식 후 2주부터 는 러닝머신 검사를 통해 처리된 마우스의 운동 용량의 기능적 개량화를 평가할 수 있다. 이 시험은 처리된 마우스의 운동 내성/지구력의 평가를 허용합니다. 마우스는 3 연속 기계 자극 (5 초마다 하나)의 시리즈 후 러닝 머신을 다시 참여하려고하지 않고, 5 초 이상 휴식 영역에 누워 있을 때 피로로 간주됩니다. 기준측정은 치료 약 1개월 전부터 시작되며, 각 실험된 동물의 개선을 평가하는 데 사용됩니다. 이 시험은 섬유 취약성, 힘 개선, 이식, 이식된 세포의 분화 및 이식된 근육의 형태학적 개량을 모니터링하기 위한 추가 적인 검사다음에 선행될 수 있다(토론 참조).
- 첫 번째 측정 전에 동물(일반적으로 3개의 그룹: 치료, 치료되지 않은 및 야생 유형/비 dystrophic 컨트롤)을 운동에 적응하십시오: 러닝머신을 10분 동안 6m/분의 속도로 설정합니다. 1주일 동안 격일로 절차를 반복합니다.
문제 해결: circadian 주기로 인해 편향을 피하기 위해 하루 중 같은 시간에 모든 측정값을 기록합니다. - 이전에 10 °의 경사로 설정 된 러닝 머신에 동물을 배치합니다.
- 러닝머신을 켜면 6m/min의 시작 속도로 (동물이 운동을 시작할 의향이 없는 경우 부드러운 기계적 자극을 제공합니다).
- 타이머를 시작하고 2 분마다 2 m / 분 속도를 늘립니다.
- 동물이 러닝머신을 다시 교전하지 않고 5초 이상 휴식 지역에 놓이자마자 스틱으로 부드럽게 만져 운동의 재시작을 자극합니다(위 참조).
- 각 동물의 성능(시간 및 거리)을 기록합니다.
- 매주 또는 10일마다 측정값을 최소 3배 이상 반복합니다.
- 이식 후 동일한 절차를 반복합니다.
- 각 동물의 측정을 기준 성능과 비교하는 성능 데이터를 분석합니다. 그래프의 값을 기준선에 비해 평균 모터 용량의 백분율로 플롯하고 그룹을 비교하기 위해 적절한 사후 테스트 다음에 1-또는 양방향 ANOVA 테스트로 값을 분석하는 것이 좋습니다.
문제 해결: 최소 5세, 유전자형 및 성냥이 일치하는 동물/그룹을 사용하고 이식 후 최소 3배 이상의 측정값을 반복합니다.
4. 이식된 근육의 세포 이식 및 분화 평가
이식 및 제어 근육은 적절한 시점에서 수확됩니다 (<2 단기 이식 분석을위한 일, 중기 2-3 주 및 장기 분석을위한 >1 개월). 이식된 세포가 GFP로 표지되는 경우에, 새로 고립된 근육에 있는 이식은 UV갖이 갖춰진 입체 현미경의 밑에 직접 형광에 의해 평가될 수 있습니다.
- 트라가찬스 잇몸에서 수직축을 따라 누워 오리엔테이션을 하고, 갓 분리된 근육(6% w/v)
- 미리 냉각 된 isopentane에서 샘플을 탈수 1 분 동안 액체 질소에 2 분 이상 동결하고 저장을 위해 -80 ° C에 즉시 배치하십시오.
- 극저온으로 샘플을 처리하여 편광 슬라이드에 7 μm 두께의 섹션을 얻습니다. 슬라이드의 대부분의 근육을 샘플링하여 30-40 섹션/슬라이드로 약 8-10 슬라이드를 수집합니다. 분자 생물학/생화학 작용을 수행하기 위해 1.5 ml 튜브로 일련의 섹션을 수집하는 것이 좋습니다.
- 실험 용 설정에 따라 다양한 면역 형광 염색으로 세포 이식을 평가하십시오. 예를 들어, Sgca-null/scid/bg 마우스에서 HIDEM 이식의 경우, 얼룩 섹션: a) 라빈 A/C에 대한 항체가 이식된 인간 세포 핵을 검출하는 경우; b) 근육의 전반적인 구조를 시각화하기 위해 라미닌에 대한 항체; 및 c) Sgca에 대한 항체는 영양실체 동물에 결석한 단백질의 기증자 유래 복원을 검출한다.
- 정량화, 형광 현미경을 사용하여, 근육 섬유 내부 및 외부 근육 섹션당 기증자 핵의 수와 단면도당 기증자 유래 골격 근섬유의 수.
5. 근육 조직 병리학
조직 병리학 적 분석은 이식 된 근육의 형태학적 구조의 평가를 허용합니다. 조직 구조의 건축적 개선은 세포 치료 접근법의 결과로 기대된다.
- 4°C에서 1시간 동안 4% 파라포름알데히드로 갓 분리된 근육을 수정합니다.
- 오름차장저분(예: 7.5-15-30% w/v)으로 샘플을 탈수합니다.
- 가장 높은 자당 용액에 하룻밤 근육을 둡니다.
- 티슈 텍 OCT에 샘플을 포함, OCT가 고체 될 때까지 미리 냉각 된 isopentane에 배치 (샘플의 완전한 침지 방지), 적어도 2 분 동안 액체 질소에 동결하고 저장을위한 -80 ° C에 즉시 배치.
- 상기와 같이 7 μm 두께의 단면을 얻기 위해 저온저온으로 샘플을 처리한다.
- 표준 제조업체의 프로토콜에 따라 헤마톡시린과 에오신 또는 마슨의 트리크롬으로 섹션을 얼룩지게 합니다.
헤마톡슬린과 에신 염색은 근육 재생의 특징을 계산할 수 있습니다. b) 단면 영역; c) 중앙 핵을 함유하는 근섬유의 개수. 마슨의 삼색은 이미지의 총 영역에서 골격 근섬유에 의해 점유 된 총 면적을 빼서 섬유색 지수를 계산하는 데 사용됩니다 : 결과 영역은 주로 근육의 결합 및 지방 침투를 반영합니다. 이미지에 대한 모든 분석은 측정 도구 및 셀 카운터 플러그인을 사용하여 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 수행될 수 있습니다.
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Representative Results
보고된 대표적인 결과는 그림 1의워크플로우에 묘사된 시험관 내/생체 내 어비보 어서션의 주요 결과를 따릅니다. 48 시간 후 4OH-타목시펜 투여 후 MyoD 양성 핵은 문화권에서 MyoD-ER 변환 된 IDEM 내에서 식별 할 수 있습니다(도 2A). 그런 다음 세포가 융합되어 다핵된 심포우(그림2B)로분화한다. 급성 근육 손상의 뮤린 모델로 근육내 이식시, I뎀은 조직 재생에기여(도 3). 근육 이영양증의 뮤린 모델에 대한 유전자 및 세포 치료 설정에서 IDEM의 효능은 러닝머신 운동 내성 시험에 의해 평가되었다: 도 4는 야생형 MIDEM을 Sgca-null/scid/베이지 마우스로 이식한 후 얻은 결과를 나타내며, 처리된마우스7에서운동 용량의 개량화를 나타낸다. 이식된 근육의 Ex vivo 분석은 숙주 조직으로 IDEM의 식민지화 정도를 나타내는 GFP 양성 영역을 보여 주며(그림5A-C),따라서 기증자 세포가 영양근육에 이식된다는 것을 입증한다. 중요한 것은, 이식된 세포는 생체내에서분화할 수 있고, 새로운 골격 근섬유를 형성한다. 실제로 도 5는 Sgca-null/scid/베이지 마우스(그림5D 및 5E)로유전자 보정 HIDEMs로부터 Sgca 발현을 나타낸다. 이식된 근육의 아키텍처에서구조적인 개량은 매슨의 삼색 염색을 통해 평가될 수 있다: 도 5F는 치료된 근육에서 섬유조직의 양이 감소하는 것을 나타낸다.
그림 1. 프로토콜 흐름 차트입니다. 이 계획은 시험관 내 분화 작용제(왼쪽)부터 생체 내 및 전 생체 내 의 이식, 근생 전위 및 기능적 개량을 평가하는 데 필요한 다양한 단계에 이르기까지 IDEM 기반 전략에 대한 개요를 제공합니다. 어두운 회색 상자는 프로토콜에 설명된 다양한 단계를 포함; 밝은 회색 상자에는 이 문서에 자세히 설명되지 않은 메서드의 일부가 포함되어 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 시험관 내근생 잠재력의 평가 . (A) 4OH-타목시펜에 48시간 노출 후 미뎀 핵을 변형한 7개의 묘드-ER 중 4개에서 핵 근화발현을 보여주는 면역형. (B) 4OH-타목시펜 유도 HIDEM 유도 근구에 미신 중형 체인(MyHC)에 대한 면역형광 염색은 1주일 후 분화 매체(스케일 바, 200 μm)에서 발생한다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 급성 근육 재생의 모델에서 세포 이식의 생체 내 평가. (A) 106 GFP-HIDEM (왼쪽) 및 GFP-MIDEMs (중앙)의 근육 주입 후 2 주 심은 갓 고립 된 심장 독소 부상 티비알리스 전방 근육의 스테레오 현미경 GFP 형광 이미지. GFP 양성 심모섬유를 표시하는 (A)에 도시된 MIDEM으로 이식된 근육의 저(위) 및 높은(아래)의 배율 표시가 2mm. (B) 낮음(상부) 및 높은(아래쪽) 배율 사진. 스케일 바, 200 μm. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 러닝머신 운동 내성 테스트. 이식에 대 한 대표적인 러닝 머신 테스트 (IM = 근육; IA = 동맥 내). Sgca-null/scid/베이지 마우스(106 세포/주사) 대 비이식 영양실체 및 비영양제 대조군 면역결핍마우스. 이 플롯은 MIDEM으로 이식된 영양실체 마우스의 기능성 개량(이식 후 35일 동안 이식되지 않은 동물보다 12-22% 더 많은)을 보여줍니다. 데이터는 기준 선력 성능에 비해 평균 모터 용량으로표시됩니다(즉, 100%는 각 그룹의 기준 성능을 나타내며, 처리된 마우스만 반복측정시 크게 개선됨). *P < 0.05; **P < 0.005, 편도 ANOVA. 저자7의이전에 출판 된 작품에서 . 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 근육 이영양증의 마우스 모델에서 생생및 근생 전위의 생체 내에서. (A) Sgca-null/scid/베이지 마우스의 갓 분리된 티볼리스 전방 근육의 스테레오현미경 GFP 형광이미지106명의 인간(HIDEM, 왼쪽; 청소년 마우스 이식) 및 뮤린(MIDEM; 오른쪽) GFP-IDEMs의 근육 주입 후 3-4주 간 심어질 수 있습니다. 스케일 바, 2mm. (B) 새로 분리 된 위장 근육의 입체 GFP 형광 이미지 106 GFP-MIDEM의 동맥 내 주입 후 3 주 경질. 스케일 바, 1mm. (C) GFP 양성 심근섬유의 클러스터를 표시하는 (A)에 도시된 MIDEM으로 이식된 근육의 신선한 냉동 횡면. 스케일 바, 200 μm. (D) 면역 형광은 이식 된 IDEM에서 유래 한 유전자 보정 섬유의 클러스터를 보여주는 근육 내 이식 근육 (A에서와같이) 섹션에 염색. 스케일 바, 150 μm. (E) α-사르코글리칸(Sgca)-양성 근섬유의 정량화는 유전자 교정 된 IDEMs를 Sgca-null/scid/베이지 마우스로 근육 이식 한 달 후에 정량화한다. (F) 이식으로부터 티비알리스 전방 근육의 마손 트리크롬 염색 및 제어 Sgca-null/scid/베이지 마우스(빨강: 근육 섬유; 블루: 섬유증) 치료된 근육에 섬유성 침투의 감소를 강조한다. 스케일 바, 200 μm. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
iPSC는 자기 갱신 잠재력을 보존하면서 무기한 으로 확장될 수 있으므로 광범위한 세포계보(12)로분화하도록 지시될 수 있다. 이와 다른 이유로 iPSC 유래 줄기/전구 세포는 자가 유전자 및 세포 치료에 대한 유망한 원천으로간주됩니다(13)접근한다. 저자로부터 이전에 출판 된 작품은 백혈구 유래 MABs (IDEM)의 것과 유사한 표현형을 가진 iPSCs에서 마우스와 인간 근생 성 전조자의 생성과 근육 이영양증7의마우스 모델에서 근육 재생에 대한 효율적인 기여를보고했다.
IDEM 근생 전위를 최대화하기 위한 전제 조건은 세포내 근생인 묘드의 발현이다. 타목시펜유도할 수 없는 MyoD-ER 카세트와의 트랜스포션은 전체 배양에서의 활성화를 동기화하고 그 이후 생체 내에서 활성화할 수 있는 이점으로 표현식에대한 정확한 시간적 제어를 가능하게 했다. 근육당 세포의 단일 투여에 기초한 이식 전략(또는 대퇴동맥당)이 이 문서에서 설명되었습니다. 그러나, 반복된 세포 주사는 상이한 세포 치료프로토콜8에서MAB 이식을 증가시켜 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, IDEM과 최적 결과의 경우, 세포 복용량을 증가 시키기 위해 반복 이식을 수행 가치가 있다 따라서, 호스트 근육에 기여.
결과 측정은 처리된 동물의 표현형의 기능적 개량에 있는 기증자 세포의 기여의 평가를 허용합니다. 러닝머신으로 수행된 운동 내성/내구 테스트 외에도, 자발적인 운동용량(예: 프리휠 테스트), 섬유취약성(예: 에반스 블루 염료 섭취 분석) 및 특정힘(예: 단일 섬유 또는 전체 근육 역학)을 분석하기 위한 추가 테스트가8을고려할 수 있다. 기능적 표현형 개량을 테스트하는 추가 방법은 Treat-NMD웹사이트(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/)에서표준 운영 절차로 사용할 수 있습니다.
이식된 동물로부터 중요한 정보를 수집하려면, 기능성 개량은 세포 이식 및 조직 아키텍처/리모델링을 평가하기 위해 면역 조직화학 및 조직학 분석에 의해 수행되고 검증되어야 한다. 특히, 중앙 핵을 가진 섬유의 개수, 근섬유단 영역 및 섬유증 지수를 가진 섬유의 수를 평가하는 등 재생 및 섬유증의 특징을 위해 접목된 근육의 형태학적 구조를 평가하는 것이 중요하다. 후자의 분석은 기능 적 결과와 함께 전략의 효과에 대한 철저한 개요를 제공합니다. 더욱이, 이식된 세포에 의해 채택된 혈통을조직(즉, 근섬유)에 대한 기여성 으로 모니터링하고 줄기세포 구획의 유지관리는 모든 세포 치료 전략의 장기적인 효능에 중요하다. 이 경우, 이미 메소안지오블라스트가 파생되는 pericyte 구획에 대한 생체 내 의 기증자 유래 기여도가7; 또한, 예비 결과는 또한 위성 세포 풀에 IDEM에서 기능 기여를 나타냅니다 (Gerli와 테데스코, 게시되지 않은 결과). 교정된유전자(즉, 정량PCR 및 서부 블롯)의 이식 및 발현을 입증하는 분자 분석도 중요하지만, 이 논문의 범위를 벗어나 전용 품이 필요합니다.
이 프로토콜은 주로 Sgca-null/scid/베이지 마우스7(최근 발표된 LGMD2D의 면역결핍 모델)을 활용하여 개발되었지만, 다른 근육 질환 모델에 쉽게 적용할 수 있을 것으로 기대된다. Sgca-null/scid/beige의 경우, 이러한 동물의 근육이 심하게 손상되고 만성적으로 변성 및 재생 주기의 대상이 되기 때문에 우리는 심장 독소를 사용하지 않았습니다(따라서 심장 독소로 인한 추가 손상은 필요하지 않습니다). 그러나, 우리는 심장 독소로 전처리가 근 위축증의 온화한 모형에 있는 이식을 촉진할 수 있었다는 것을 배제할 수 없었습니다(예를 들면 mdx 마우스). 우리의 전략의 암필은 마우스 숙주의 면역 결핍을 향상시키는 방법 (현재 모델에서 여전히 최적이 아님) 및 기증자 세포 이식의 효능, 특히 제노 제네세포의 동맥 내 전달에 대한 효능을 포함할 수 있다. 다중 세포 이식 및 청소년 마우스의 사용이 세포이식7,8의증가에 기여하지만, 사치화 및/또는 이주 중에 인간 세포에 의해 발생하는 마우스 접착 분자는 현재 모델의 제한된 면역 결핍에 추가적인 장애물을 제기할 수 있다. 임상 환경에서 이러한 유전자 및 세포 치료 접근법의 번역을 위한 향후 방향에는 세포 사치및 비통합 벡터의 사용을 향상시키기 위한 약리학적 전략이 포함될 수있으며(예: 플라스미드, mRNA, 인간 인공 염색체, 또는 비통합 바이러스 벡터)를 사용하여 세포를 재프로그래밍하고 유전적으로 교정하여 돌연변이 삽입의 위험을 피할 수 있다.
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Disclosures
F.S.T.는 국제 특허 출원을 출원했습니다(아니요. PCT/GB2013/050112) 이 문서에 설명 된 전략의 일부를 포함. 그는 자신의 연구를 위해 Promimetic 및 DWC 주식 회사에 의해 자금을 받았다.
Acknowledgments
저자는 줄리오 코스수, 마르티나 라가지와 도움이 되는 토론과 지원을 위한 전체 실험실, 그리고 제프 체임벌린에게 MyoD-ER 벡터를 친절하게 제공한 것에 대해 감사드립니다. 살아있는 동물과 관련된 모든 실험은 모든 관련 규제 및 기관 기관, 규정 및 지침에 따라 완료되었습니다. 저자 실험실에서 작업은 영국 의학 연구 위원회에 의해 지원됩니다, 유럽 지역 사회 7 프레임 워크 프로젝트 Optistem 및 바이오 디자인과 이탈리아 Duchenne 부모 프로젝트.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
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References
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