Summary
الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من السلف العضلية واعدة المرشحين لاستراتيجيات العلاج بالخلايا لعلاج خلل العضلات. يصف هذا البروتوكول الزرع والقياسات الوظيفية المطلوبة لتقييم النغر والتمايز بين الخلايا الميوانجيوائية المشتقة من iPSC (نوع من السلف العضلي) في نماذج الماوس لتجديد العضلات الحاد والمزمن.
Abstract
يمكن أن تكون iPSCs المشتقة من المريض مصدرا لا يقدر بثمن للخلايا لبروتوكولات العلاج الذاتي في المستقبل. يمكن إنشاء الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC والمشبهة بالخلايا المتوسطة المشتقة من البيريسيت (الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC) من iPSC المستمدة من الخلايا الجذعية/السلف المشتقة من iPSC من الخلايا الجذعية/السلفية: IDEMs) من iPSCs الناتجة عن المرضى المتضررين من أشكال مختلفة من ضمور العضلات. يمكن تصحيح IDEMs الخاصة بالمرضى وراثيا باستراتيجيات مختلفة(مثل ناقلات العدسية ، الكروموسومات الاصطناعية البشرية) وتعزيزها في إمكانات التمايز الميوجينية عند الإفراط في التعبير عن منظم تكوين الميو دي. ثم يتم تقييم هذه الإمكانية الميوجينية في المختبر مع مقايسات تمايز محددة وتحليلها عن طريق الفلورة المناعية. يتم تقييم الإمكانات التجديدية ل IDEMs بشكل أكبر في الجسم الحي، عند زرع العضل وداخل الشرايين في نموذجين تمثيليين للفأرة يعرضان تجديد العضلات الحاد والمزمن. ثم يتم تأكيد مساهمة IDEMs في العضلات الهيكلية المضيفة من خلال اختبارات وظيفية مختلفة في الفئران المزروعة. على وجه الخصوص ، تتم دراسة تحسين القدرة الحركية للحيوانات مع اختبارات جهاز المشي. ثم يتم تقييم زراعة الخلايا والتمايز من خلال عدد من التقييمات النسيجية والمناعة على العضلات المزروعة. وعموما، تصف هذه الورقة المقايسات والأدوات المستخدمة حاليا لتقييم قدرة التمايز ل IDEMs، مع التركيز على أساليب الزرع ومقاييس النتائج اللاحقة لتحليل فعالية زرع الخلايا.
Introduction
Mesoangioblasts (MABs) هي سلف العضلات المرتبطة بالسفينة المستمدة من مجموعة فرعية من pericytes1-3. الميزة الرئيسية للMABs على السلف العضلات الكنسي مثل خلايا الأقمار الصناعية4 يكمن في قدرتها على عبور جدار السفينة عند تسليمها داخل الشرايين، وبالتالي المساهمة في تجديد العضلات الهيكل العظمي في بروتوكولات العلاج الخلوي. وقد تم تقييم هذه الميزة وأكد في كل من نماذج مورين والأنياب من ضمور العضلات1,5,6. وقد بنت هذه الدراسات قبل السريرية الأسس لأول مرة في الرجل المرحلة الأولى / الثانية التجارب السريرية على أساس زرع داخل الشرايين من MABs المانحة HLA متطابقة في الأطفال الذين يعانون من ضمور العضلات دوشين (EudraCT رقم 2011-000176-33; يجري حاليا في مستشفى سان رافائيل في ميلانو, إيطاليا). واحدة من العقبات الرئيسية لنهج العلاج بالخلايا، حيث هناك حاجة إلى مليارات الخلايا لعلاج عضلة الجسم بأكمله، هو إمكانات الانتشار محدودة من "المنتج الطبي" (الخلايا). وعلاوة على ذلك فقد ثبت مؤخرا أنه ليس من الممكن الحصول على MABs من المرضى المتضررين من بعض أشكال العسر العضلي، كما يحدث في ضمور العضلات حزام الأطراف 2D (LGMD2D؛ أوميم #608099)7.
للتغلب على هذه القيود، تم مؤخرا إنشاء بروتوكول اشتقاق الخلايا الجذعية/ السلف الشبيهة ب MAB من الإنسان و الموراين iPSCs7. يولد هذا الإجراء مجموعات خلايا قابلة للتوسيع بسهولة مع توقيع جين الأوعية الدموية والنمط الظاهري المناعي مشابهة إلى حد كبير لMABs المشتقة من العضلات الكبار. عند التعبير عن العامل التنظيمي العضلي MyoD ، يخضع كل من murine و IDEMs البشري (على التوالي MIDEMs و HIDEMs) لتمايز عضلات الهيكل العظمي النهائي. لتحقيق هذا الهدف يمكن أن يتم نقل IDEMs مع ناقلات قادرة على دفع التعبير عن الميو دي، إما التأسيسية أو بطريقة لا يمكن التوصل إليها8-10. يتم استخدام ناقل العدسية التي تحتوي على الميو دي cDNA تنصهر مع مستقبلات هرمون الاستروجين (MyoD-ER) ، مما يسمح نقلها النووية على tamoxifen (التماثلية الاستروجين) الإدارة11. هذه الاستراتيجية تؤدي إلى تشكيل الميوتوب متعدد النوى الإفراط في النوى، مع كفاءة عالية7. وتجدر الإشارة إلى أن IDEMs غير أصلية ، ويمكن أن تجرف وتفرق داخل عضلات المضيف عند زرعها ويمكن تصحيحها وراثيا باستخدام ناقلات مختلفة(مثل الفيروسات العدسية أو الكروموسومات الاصطناعية البشرية) ، مما يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية تلقائية في المستقبل. وقد وصف اشتقاق وتوصيف وزرع IDEMs في المنشور أعلاه7. تفصل ورقة البروتوكول هذه المقايسات التي أجريت لتقييم التمايز العضلي المختبري ل IDEMs وقياسات النتائج اللاحقة لاختبار فعالية زرعها في نماذج الماوس لتجديد العضلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تقييم إمكانات الميوجينيك والتطوير
-
في المختبر: التمايز الناجم عن الميود
- توليد خط خلايا مستقر من IDEMs التي يتم نقلها مع ناقل الميو دي-ER العدسي القابل للانستقراء، مما يبطل تعدد العدوى (وزارة الداخلية؛ على سبيل المثال 1 و 5 و 50) باستخدام تلطيخ وصفها في 1.1.9 (MyHC) نتيجة لكفاءة الإجراء.
- معطف طبق 3.5 سم مع 1 مل من 1٪ Matrigel واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- غسل لوحة مرتين مع المتوسطة، البذور 1 ×10 5 ميو دي-ER نقل IDEMs في طبق زراعة الأنسجة 3.5 سم واحتضان في 37 درجة مئوية في المتوسط النمو.
- نتوقع أن الخلايا تصل إلى التقاء في يوم أو يومين ومن ثم إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين في المتوسط النمو (1جرعة سانت).
- بعد 24 ساعة، استبدال متوسط النمو مع وسيطة التمايز تستكمل مع 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين(2 الجرعة الثانية والأخيرة).
- استبدال نصف المتوسطة مع وسط التمايز الطازجة كل يومين.
- دراسة الثقافات لتشكيل myotube يوميا.
- بعد أسبوع واحد (5 أيام في المتوسط التمايز)، وغسل لوحات بلطف مع برنامج تلفزيوني وإصلاح مع 4 ٪ paraformaldehyde لمدة 5 دقائق في RT.
- إجراء تلطيخ immunofluorescence مع الأجسام المضادة ضد سلسلة الميوزين الثقيلة (MyHC) لتأكيد وجود myotubes. مضادة مع صبغة نووية(مثل Hoechst).
يتم تقييم كفاءة التمايز كنسبة مئوية من النوى داخل الخلايا الإيجابية MyHC: انتقل إلى الخطوة التالية إذا كانت الكفاءة >50٪.
-
في الجسم الحي: engraftment في نموذج لتجديد العضلات الحادة
لتقييم مساهمة MyoD-ER IDEMs في الجسم الحي لتجديد العضلات ، تم تصنيف الخلايا سابقا بشفرة متجهة للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي سيمكن من تتبعها داخل الأنسجة. ثم يتم حقن IDEMs MyoD-ER GFP في عضلات مورين الكبار، الذين أصيبوا سابقا مع سم الميوتوكين(مثل سم القلب). لتجنب الرفض المناعي ضد الزينوجينيك (مثل HIDEMs) أو الخلايا المتلاعب بها وراثيا / المصححة ، يلزم استخدام الفئران المثبطة للمناعة أو المناعة.- Pretreat الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من 3.5 ميكرولتر / غرام من 10 ملغ / مل تاموكسيفين (شكل liposoluble) 24 ساعة قبل زرع وخلايا pretreat إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين (شكل مائي) في وسط النمو بين عشية وضحاها قبل يوم زرع.
- إعطاء التخدير والتسكين إلى الماوس باتباع المبادئ التوجيهية المحددة التي تنظم العمليات الجراحية في منشأة الحيوان.
- حقن 25 ميكرولتر من 100 ميكرومتر من سم القلب (CTX؛ من ناجا موسمبيكا موسامبيكا؛ تنبيه: مادة ضارة محتملة) في عضلات الساق الأمامية (TA).
- 24 ساعة بعد علاج الحيوانات مع تاموكسيفين وCTX، فصل الخلايا عن طريق الجربس والعد.
- الطرد المركزي الخلايا في 232 × ز لمدة 5 دقائق.
- غسل بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +- برنامج تلفزيوني مجاني، والطرد المركزي ومن ثم إعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +مجانا برنامج تلفزيوني إلى تركيز نهائي من 106 خلايا /30 ميكرولتر، والتي ستكون الحجم النهائي لكل حقنة.
- حقن 30 ميكرولتر من تعليق الخلية في العضلات المصابة سابقا باستخدام حقنة مع إبرة 29 أو 30 غرام. إيلاء اهتمام خاص أثناء إزالة الإبرة من العضلات. القيام بذلك ببطء، وتجنب تسرب تعليق الخلية من خلال مسار الإبرة. لا زرع TA contralateral واستخدامه كسيطرة، وحقن 30 ميكروغرام من Ca2 +- و Mg2 +خالية من برنامج تلفزيوني لتكرار ظروف واحدة زرعها.
- علاج الحيوانات مع تاموكسيفين لمدة ستة أيام إضافية وإعطاء مسكن(مثل Carprofen) لمدة يومين إضافيين.
- Explant العضلات من 14 يوما بعد زرع فصاعدا. معالجة وتحليل العينات كما هو مفصل في البروتوكولين 4 و 5.
2. زرع في نماذج الماوس من ضمور العضلات
يسمح هذا الفحص زرع تقييم مدى engraftment من IDEMs في نماذج الماوس من ضمور العضلات. ويمكن أيضا تقييم الحيوانات، التي عولجت على النحو التالي، من أجل التحسين الوظيفي للنمط الظاهري للمرض. يمكن إجراء الاختبارات الوظيفية بدءا من أسبوعين بعد الزرع. من أجل تعزيز engraftment النظر في أداء ممارسة المشي قبل النقل (كما هو موضح في البروتوكول 3) و / أو حقن الخلايا التسلسلية كل ثلاثة أسابيع ل3x (أي ما مجموعه 3 حقن / العضلات).
- زرع العضلي
- Pretreat الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من 3.5 ميكرولتر / غرام من 10 ملغ / مل تاموكسيفين (تركيبة قابلة للذوبان في الدهون) 24 ساعة قبل زرع وخلايا pretreat إضافة 1 ميكرومتر 4OH-تاموكسيفين (تركيبة مائي) في وسط النمو بين عشية وضحاها قبل يوم زرع.
- فصل عن طريق المحاولة، عد والطرد المركزي الخلايا في 232 × ز لمدة 5 دقائق.
- غسل بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +خالية من برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي ومن ثم إعادة إنفاق بيليه في Ca2 +- وMg2 +-FREE PBS إلى تركيز 106 خلايا/30 ميكرولتر.
- إعطاء مسكن وتطهير جلد الحيوان (اختياري) مع povidone اليود أو الكلوريكسيدين القائم على مطهر. وهذا سوف يساعد أيضا على توطين الأمامية الساق (TA), gastrocnemius (GC), وfeoris quadriceps (QC; على وجه التحديد بينميديوس vastus) العضلات.
- حقن 30 ميكرولتر من تعليق الخلية في العضلات باستخدام حقنة مع إبرة 29 أو 30 غرام. لTA، إدراج 5 مم من الإبرة 2 مم تحت إدراج وتر قريب (اتجاه craniocaudal) مع ميل 15 درجة بالنسبة إلى الساق وحقن ببطء تعليق الخلية أثناء سحب الإبرة (تفريغ الحقنة مع 2 مم من الإبرة لا تزال داخل العضلات). بالنسبة للشهادة العامة ومراقبة الجودة ، كرر نفس الإجراء المفصل عن TA ، مع الفرق الرئيسي هو إدخال caudocranial للإبرة 2 مم فوق التقاطع العضلي لوتر أخيل ل GC و 2 مم فوق وتر القاصي لمراقبة الجودة (ميل 15 درجة فيما يتعلق بعظم الفخذ). انتبه أثناء إزالة الإبرة من العضلات لتجنب انسكاب تعليق الخلية عبر مسار الإبرة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: في حالة انخفاض engraftment النظر في حقن الأحداث (1-2 أسابيع من العمر) الفئران7 مع 3 × 105 خلايا/10 ميكرولتر (لاحظ أنه في هذه الحالة تاموكسيفين يحتاج إلى أن تدار تحت الجلد).
- زرع داخل الشرايين
يسمح هذا الجزء من البروتوكول بتقييم قدرة الأجهزة المتوسطة والهايدامات على أن يتم تسليمها في الدورة الدموية الشريانية ، وعبور جدار السفينة والمساهمة في تجديد العضلات الهيكلية في العضلات المصب إلى موقع الحقن.- الحيوانات والخلايا المعالجة مسبقا كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.1.1.
- فصل عن طريق المحاولة والتصفية مع مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (لإزالة مجموعات من تعليق الخلية في حالة من غير المرجح أن التعرض بين عشية وضحاها لtamoxifen يمكن أن تدفع الانصهار وتشكيل الأنابيب من الخلايا المجاورة) العد والطرد المركزي الخلايا في 232 × ز لمدة 5 دقائق
- غسل بيليه الخلية في Ca2 +- وMg2 +- برنامج تلفزيوني مجاني ، أجهزة الطرد المركزي ومن ثم إعادة إنفاق بيليه في Ca2 +- وMg2 +- برنامج تلفزيوني مجاني مع 0.2 الدولية
وحدات الهيبارين الصوديوم (اختياري) لتركيز الخلية النهائية من 106 خلايا/50 ميكرولتر. إضافة 10٪ براءة اختراع صبغة زرقاء (التركيز النهائي: 1.25 ملغ / مل في المالحة العادية أو Ca2 +- و Mg2 +-free PBS) إلى الحل من أجل تصور توزيع تعليق الخلية. - إعطاء التخدير والتسكين إلى الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية التي تنظم العمليات الجراحية في منشأة حيوانية مؤسسية محددة.
- حلق المنطقة الأربية (تعرف أيضا باسم مثلث الفخذ أو سكاربا) وتطهير الجلد باستخدام مطهر باليود أو الكلورهيكسيدين القائم على povidone.
- إجراء شق 5-7 ملم وترجمة حزمة الفخذ: الوريد والشريان والعصب (العصب يضع أفقيا إلى الشريان والوريد medially).
- إزالة اللفافة الضامة بلطف التي تغطي حزمة مع ملقط.
- فصل الوريد الفخذي والعصب من الشريان عن طريق إدخال بلطف غيض من ملقط (أو إبرة 30 غرام) في بينهما، وتكبير تدريجيا في حفرة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: الوريد الفخذي هش: انتبه إلى عدم قرصه مع ملقط أثناء انفصاله عن الشريان الفخذي. في حالة النزيف، واستنزاف الدم مع الشاش العقيم واستخدام الكي الدقيق لتسهيل hemostasis. - ارفع الشريان بطرف واحد من ملقط واشبك الشريان بالطرف الآخر.
- ثقب الشريان مع حقنة مجهزة إبرة 30G. حقن 50 ميكرولتر من تعليق الخلية المصب من المنطقة فرضت، بسرعة ضخ ما يقرب من 5 ميكرولتر / ثانية.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: إعادة إنفاق الخلايا في الحقنة بعناية قبل الحقن: من الضروري تجنب هطول الأمطار على الخلايا وتشكيل فقاعة الهواء داخل الحقنة. قطر الشريان الفخذي أصغر قليلا من إبرة 30 غرام: يجب الحرص على عدم اقتطاع الشريان أثناء إدخال الإبرة. تسمح الصبغة الزرقاء براءة اختراع الاعتراف بفعالية الحقن: إذا حقن بشكل صحيح، فإن الطرف كله يتحول بسرعة الأزرق الفاتح. - إزالة الإبرة والملقط ببطء من الشريان لاستعادة مجرى الدم في الطرف.
- تطبيق الضغط مع الشاش العقيم لتجنب النزيف و / أو الكي على النحو المطلوب.
- خياطة الجرح ورصد الحيوانات حتى الشفاء من التخدير.
- إعطاء مسكن لمدة 3 أيام وفحص الجرح يوميا (في حالة العدوى الجرح مناقشة هذا الأمر مع موظفي مرفق الحيوان وإعطاء المضادات الحيوية على النحو المطلوب).
3. تدابير النتائج على الحيوانات العسر الزرع: اختبار حلقة مفرغة
بدءا من أسبوعين بعد زرع الخلايا ، من الممكن تقييم التحسين الوظيفي للقدرة الحركية للفئران المعالجة باختبارات جهاز المشي. يسمح هذا الاختبار بتقييم تحمل التمارين الرياضية / تحمل الفئران المعالجة. يعتبر الفأر مرهقا عندما يضع في منطقة الراحة لأكثر من 5 ثوان ، دون محاولة إعادة ربط جهاز المشي بعد سلسلة من 3 محفزات ميكانيكية متتالية (واحدة كل 5 ثوان). تبدأ قياسات خط الأساس قبل شهر تقريبا من العلاج وتستخدم لتقييم تحسن كل تم اختباره. يمكن أن يتبع هذا الاختبار اختبارات إضافية لمراقبة هشاشة الألياف ، وتحسين القوة ، والغراية ، وتمايز الخلايا المزروعة ، والتحسين المورفولوجي للعضلات المزروعة (انظر المناقشة).
- تأقلم الحيوانات (عادة ثلاث مجموعات: المعالجة، غير المعالجة، والتحكم البري من النوع/غير العسر) في التمرين قبل القياس الأول: تعيين جهاز المشي بسرعة 6 م/دقيقة لمدة 10 دقائق. كرر الإجراء كل يومين لمدة أسبوع واحد.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: سجل جميع القياسات في نفس الساعة من اليوم لتجنب التحيزات بسبب الدورات الإيقاعية. - ضع الحيوانات في جهاز المشي ، الذي تم إعداده سابقا بميل 10 درجة.
- بدوره على حلقة مفرغة، مع سرعة البدء من 6 م / دقيقة (توفير حافز ميكانيكي لطيف في حالة الحيوانات ليست على استعداد لبدء ممارسة).
- بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت وزيادة سرعة 2 م / دقيقة كل 2 دقيقة.
- بمجرد أن يرقد في منطقة الراحة لأكثر من 5 ثوان دون محاولة إعادة ربط جهاز المشي ، المسه برفق بعصا لتحفيز إعادة تشغيل التمرين (انظر أعلاه).
- تسجيل أداء (الوقت والمسافة) لكل.
- كرر القياسات أسبوعيا أو كل 10 أيام لمدة 3x على الأقل.
- كرر نفس الإجراء بعد الزرع.
- تحليل بيانات الأداء مقارنة قياس كل لأدائه الأساسي. نقترح رسم القيم في الرسم البياني كنسبة مئوية من متوسط القدرة الحركية بالنسبة لخط الأساس وتحليلها من خلال اختبار ANOVA أحادي أو ثنائي الاتجاه يليه اختبار ما بعد الاختبار المناسب لمقارنة المجموعات.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها: استخدم ما لا يقل عن 5 حيوانات/مجموعات مطابقة للعمر والنمط الجيني والجنس وكرر القياسات لمدة 3x على الأقل بعد الزرع.
4. تقييم الحرمان من الخلايا والتمايز في العضلات المزروعة
يتم حصاد عضلات الزراعة والتحكم في الوقت المناسب (<2 يوما لتحليل الزرع على المدى القصير ، و 2-3 أسابيع لمنتصف المدة وشهر >1 للتحليل على المدى الطويل). إذا تم تسمية الخلايا المزروعة مع GFP ، يمكن تقييم الحرمان في العضلات المعزولة حديثا عن طريق الفلورسينس المباشر تحت منظار مجسم مجهز بالأشعة فوق البنفسجية.
- وضع وتوجيه على طول المحور العمودي العضلات المعزولة حديثا في العلكة tragachanth (6٪ ث / الخامس)
- يجفف العينات في ايتفتحان prechilled لمدة دقيقة واحدة، وتجميدها في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل ووضعها على الفور في -80 درجة مئوية للتخزين.
- معالجة العينات مع cryostat للحصول على أقسام سميكة 7 ميكرومتر على الشرائح المستقطبة. عينة غالبية العضلات على الشرائح، وجمع ما يقرب من 8-10 الشرائح مع 30-40 أقسام / الشريحة. من المستحسن جمع سلسلة من المقاطع في أنبوب 1.5 مل لإجراء عمليات الفحص الجزيئي للبيولوجيا /الكيمياء الحيوية.
- تقييم رعي الخلايا مع تلطيخ immunofluorescent مختلفة، اعتمادا على الإعداد التجريبي. على سبيل المثال، في حالة زرع HIDEM في فئران Sgca-null/scid/bg، فإن أقسام البقع مع: أ) الأجسام المضادة ضد Lamin A/C للكشف عن نواة الخلايا البشرية المطعمة؛ (ب) الأجسام المضادة ضد Lamin A/C للكشف عن نواة الخلايا البشرية المطعمة؛ (ب) الأجسام المضادة ضد الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية المطعومة؛ (ج) الخلايا البشرية ب) الأجسام المضادة ضد لامينين لتصور الهيكل العام للعضلات؛ و ج) الأجسام المضادة ضد Sgca للكشف عن استعادة المستمدة من المانحين من البروتين غائبة في الحيوان العسر.
- قياس كميا، وذلك باستخدام المجهر الفلوري، وعدد من نواة المانحة لكل قسم العضلات داخل وخارج ألياف العضلات وعدد من الألياف العضلية الهيكلية المشتقة من المانحة لكل قسم.
5. العضلات الأنسجة
تسمح التحليلات النسيجية بتقييم البنية المورفولوجية للعضلات المزروعة. ومن المتوقع تحسن معماري في هيكل الأنسجة نتيجة لنهج العلاج بالخلايا.
- إصلاح العضلات المعزولة حديثا مع 4٪ بارافورمالديهايد لمدة ساعة واحدة في 4 درجة مئوية.
- تجفيف العينات مع تدرج السكروز الصاعد(على سبيل المثال 7.5-15-30٪ ث / v).
- اترك العضلات بين عشية وضحاها في محلول السكروز الأعلى.
- تضمين العينات في الأنسجة تيك أكتوبر، ووضعها في isopentane prechilled حتى يصبح OCT الصلبة (تجنب الغمر الكامل للعينات)، وتجميدها في النيتروجين السائل لمدة 2 دقيقة على الأقل ووضعها على الفور في -80 درجة مئوية للتخزين.
- معالجة العينات مع cryostat للحصول على أقسام سميكة 7 ميكرومتر كما هو موضح أعلاه.
- وصمة عار المقاطع مع الهيماتوكسيلين واليوسين أو ثلاثي الألوان ماسون وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة القياسية.
Hematoxylin و تلطيخ اليوزين تمكن حساب السمات المميزة لتجديد العضلات، مثل: أ) عدد من الألياف العضلية. ب) منطقة مقطعية؛ ج) عدد الألياف العضلية التي تحتوي على نواة مركزية. يستخدم ثلاثي الألوان في Masson لحساب المؤشر الليفي ، ويتم ذلك عن طريق طرح المساحة الإجمالية التي تشغلها ألياف الميوبر الهيكلية من المساحة الإجمالية للصورة: تعكس المنطقة الناتجة بشكل رئيسي تسلل الضام والدهون في العضلات. يمكن إجراء جميع التحليلات على الصور باستخدام برنامج ImageJ (NIH) مع أداة القياس والمكون الإضافي لمكونات الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تتبع النتائج التمثيلية المبلغ عنها المقايسات الرئيسية في المختبر/في الجسم الحي الموضحة في سير العمل في الشكل 1. 48 ساعة بعد 4OH-tamoxifen إدارة النوى ميود إيجابية يمكن التعرف عليها داخل IDEMs IDEMs ميود-ER المنقولة في الثقافة (الشكل 2A). ثم تندمج الخلايا وتفرق إلى ميوتوبات متعددة النوى(الشكل 2B). عندما زرع عضليا في نموذج مورين من إصابة العضلات الحادة, IDEMs تسهم في تجديد الأنسجة (الشكل 3). تم تقييم فعالية IDEMs في إعداد العلاج الجيني والخلايا لنماذج مورين من ضمور العضلات من خلال اختبار التسامح ممارسة حلقة مفرغة: الشكل 4 يظهر النتائج التي تم الحصول عليها بعد زرع MIDEMs البرية من نوع في الفئران Sgca-null/scid/beige، مما يدل على تحسين القدرة الحركية في الفئران المعالجة7. تظهر التحليلات الحية السابقة للعضلات المزروعة مناطق إيجابية ل GFP تمثل مدى استعمار IDEMs في الأنسجةالمضيفة (الأشكال 5A-C)، مما يدل على أن الخلايا المانحة تنجر إلى عضلة عسر التشجر. الأهم من ذلك، الخلايا المزروعة قادرة على التفريق في الجسم الحي،وتشكيل ألياف عظمية جديدة. في الواقع الشكل 5 يظهر التعبير Sgca من HIDEMs تصحيحها وراثيا في الفئران Sgca-null/scid/beige (الشكلين 5D و 5E). يمكن تقييم التحسين الهيكلي في بنية العضلات المزروعة من خلال تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان: يظهر الشكل 5F انخفاضا في كمية الأنسجة الليفية في العضلات المعالجة.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 مخطط تدفق البروتوكول. ويقدم المخطط لمحة عامة عن الاستراتيجية القائمة على نظام المعلومات الدولية، من المقايسات الأولية للتمايز في المختبر (إلى اليسار) إلى مختلف الخطوات اللازمة لتقييم الحرمان والإمكانات الميوجينية والاضميل الوظيفي في الجسم الحي والحي (إلى اليمين). تحتوي المربعات الرمادية الداكنة على الخطوات المختلفة الموضحة في البروتوكول؛ تحتوي مربعات رمادية فاتحة أجزاء من الأسلوب غير مفصلة في هذه المقالة. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تقييم الإمكانات الميوجينية في المختبر. (أ) immunofluorescence تظهر التعبير عن الميو دي النووية في 4 من أصل 7 الميو دي-ER نقل نواة MIDEM بعد 48 ساعة من التعرض ل4OH-تاموكسيفين. (ب) immunofluorescence تلطيخ لسلسلة الميوزين الثقيلة (MyHC) على 4OH-تاموكسيفين الناجمة عن هيديم المشتقة من الميوتوب بعد أسبوع واحد في المتوسط التمايز (شريط مقياس، 200 ميكرومتر). انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن في تقييم الجسم الحي من الحرمان من الخلايا في نموذج لتجديد العضلات الحادة. (أ) صور مجسمة مجسمة لفلورة GFP لعضلات الساق الأمامية المصابة بسمسرة القلب المعزولة حديثا بعد أسبوعين من الحقن العضلي من 106 GFP-HIDEMs (يسار) وGFP-MIDEMs (في الوسط). شريط المقياس، 2 مم (ب) صور تكبير منخفضة (علوية) وعالية (أسفل) للعضلات المزروعة مع MIDEMs الموضحة في (A) التي تعرض ألياف عضلية إيجابية GFP. شريط المقياس، 200 ميكرومتر. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال حلقة مفرغة ممارسة اختبار التسامح. اختبار حلقة مفرغة تمثيلية لزرع (IM = العضلي; IA = داخل الشرايين). فئران Sgca-null/scid/beige (106 خلايا/حقن) مقابل فئران الخلل في التشنج غير المخطط وغير الكثني. تظهر المؤامرة التحسين الوظيفي للفئران العسرة المزروعة ب MIDEMs (12-22٪ أكثر من الحيوانات غير المزروعة بعد 35 يوما من زرعها). وتظهر البيانات كمتوسط للقدرة الحركية مقارنة بأداء خط الأساس(أي أن 100٪ تمثل الأداء الأساسي لكل مجموعة ولا تحسنه إلا الفئران المعالجة بشكل كبير عند القياسات المتكررة). *P < 0.05; ** P < 0.005، في اتجاه واحد ANOVA. من العمل المنشور سابقا للمؤلفين7. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم في تقييم الجسم الحي من engraftment والإمكانات العضلية في نماذج الماوس من ضمور العضلات. (أ) صور مجسمة مجسمة GFP مضان من العضلات الأمامية التيبياليس معزولة حديثا من Sgca-null/scid/beige الفئران المنقوطة 3-4 أسابيع بعد الحقن العضلي من 106 الإنسان (HIDEMs، إلى اليسار؛ زرع في الفئران الأحداث) ومورين (MIDEMs؛ حق) GFP-IDEMs. شريط مقياس, 2 مم(ب) صورة مجسمة GFP مضان من عضلة المعدة والأمعاء معزولة حديثا explanted 3 أسابيع بعد الحقن داخل الشرايين من 106 GFP-MIDEMs. شريط المقياس، 1 مم (C) المقطع العرضي المجمدة الطازجة من العضلات المزروعة مع MIDEMs هو مبين في (A) عرض مجموعة من الألياف العضلية إيجابية GFP. شريط المقياس، 200 ميكرومتر. (د) تلطيخ immunofluorescence على أجزاء من العضلات داخل العضلات المزروعة (كما هو الحال في أ)تظهر مجموعات من الألياف المصححة وراثيا، نشأت من IDEMs المطعمة. شريط المقياس، 150 ميكرومتر. (ه) تحديد كمي للألياف العضلية α الساركوغليكانية (Sgca) الإيجابية بعد شهر واحد من زرع عضلي ل IDEMs المصححة وراثيا في فئران Sgca-null/scid/beige. (F) ماسون ثلاثي الألوان تلطيخ العضلات الأمامية الساق من زرع والسيطرة على الفئران Sgca-null/scid/beige (الأحمر: ألياف العضلات؛ الأزرق: التليف) تسليط الضوء على الحد من التسلل الليفي في العضلات المعالجة. شريط المقياس، 200 ميكرومتر. انقر هنا لعرض الرقم الأكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن توسيع iPSCs إلى أجل غير مسمى مع الحفاظ على إمكانات التجديد الذاتي وبالتالي يتم توجيهها للتمييز إلى مجموعة واسعة من أنساب الخلايا12. لهذا السبب وغيره من الأسباب التي تعتبر الخلايا الجذعية / السلف المشتقة من iPSC مصدرا واعدا للجينات الذاتية والعلاج بالخلايا النهج13. وقد أبلغ عمل نشر سابقا من المؤلفين عن جيل من السلف الموجينية الماوس والبشرية من iPSCs مع النمط الظاهري مماثلة لتلك التي من MABs المشتقة من بيريسيت (IDEMs) ومساهمتها الفعالة لتجديد العضلات في نموذج الماوس من ضمور العضلات7.
شرط أساسي لتحقيق أقصى قدر من إمكانات IDEM myogenic هو التعبير عن عامل الميوجينية MyoD في الخلايا. تمكين نقل مع تاموكسيفين لا يمكن الحصول عليها MyoD-ER كاسيت أن يكون لها سيطرة زمنية دقيقة على التعبير مع ميزة مزامنة تفعيلها في الثقافة بأكملها، وبعد ذلك في الجسم الحي. وقد وصفت استراتيجية زرع على أساس إدارة واحدة من الخلايا في العضلات (أو لكل الشريان الفخذي) في هذه المقالة. ومع ذلك، فقد ثبت حقن الخلايا المتكررة لتكون فعالة في زيادة الحرمان MAB في بروتوكولات العلاج بالخلايا المختلفة8. لذلك، في حالة النتائج دون المستوى الأمثل مع IDEMs، يجدر إجراء عمليات زرع متكررة لزيادة جرعة الخلية وبالتالي، المساهمة في استضافة العضلات.
تسمح قياسات النتائج بتقييم مساهمة الخلايا المانحة في التحسين الوظيفي للنمط الظاهري للحيوانات المعالجة. بالإضافة إلى اختبار التسامح / التحمل ممارسة أجريت مع حلقة مفرغة، يمكن اعتبار مزيد من الاختبارات لتحليل القدرة الحركية الطوعية(مثل اختبار freewheel)، هشاشة الألياف(على سبيل المثال إيفانز الأزرق امتصاص امتصاص الصبغة) وقوة محددة(مثل ألياف واحدة أو ميكانيكا العضلات كله)8. تتوفر طرق إضافية لاختبار تحسين النمط الظاهري الوظيفي كالإجراءات التشغيلية القياسية في موقع Treat-NMD(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
لجمع معلومات هامة من الحيوانات المزروعة ، يجب اتباع التحسين الوظيفي والتحقق من صحته من خلال التحليلات المناعية والهستولوجية ، لتقييم زراعة الخلايا وهندسة الأنسجة / إعادة عرضها. على وجه الخصوص ، من المهم تقييم البنية المورفومترية للعضلات المطعمة للعلامات المميزة للتجديد والتليف ، مثل تقييم عدد الألياف ذات النواة المركزية ، ومنطقة الألياف العضلية العرضية والمؤشر الليفي. وتعطي التحليلات الأخيرة، إلى جانب النتائج الوظيفية، لمحة شاملة عن فعالية الاستراتيجية. وعلاوة على ذلك، فإن مراقبة النسب الذي تعتمده الخلايا المزروعة من حيث المساهمة في الأنسجة(أي الألياف العضلية) والحفاظ على مقصورة الخلايا الجذعية أمر مهم لفعالية جميع استراتيجيات العلاج بالخلايا على المدى الطويل. وفي هذه الحالة، تم الإبلاغ بالفعل عن المساهمة المستمدة من المانحين في الجسم الحي إلى مقصورة المحيط المحيطي التي تستمد منها الأرومات الميوانجيوائية7؛ وبالإضافة إلى ذلك، تشير النتائج الأولية إلى مساهمة وظيفية من منظمة IDEMs أيضا في مجمع الخلايا الساتلية (جيرلي وتيديسكو، نتائج غير منشورة). التحليلات الجزيئية لإثبات engraftment والتعبير عن الجينات المصححة(أي PCR الكمية ولطخة الغربية) هي أيضا حاسمة، ولكن خارج نطاق هذه الورقة، وسوف تتطلب مادة مخصصة.
على الرغم من أن هذا البروتوكول قد وضعت أساسا باستخدام Sgca-null/scid/beige الفئران7 (نموذج مناعي نشرت مؤخرا من LGMD2D)، فمن المتوقع أن يمكن أن تنطبق بسهولة على نماذج أخرى من أمراض العضلات. في حالة Sgca-null/scid/beige ، لم نستخدم الفئران سم القلب ، لأن عضلات هذه الحيوانات معرضة للخطر بشدة وتخضع بشكل مزمن لدورات الانحطاط والتجديد (وبالتالي فإن تلفا إضافيا من السموم القلبية ليس ضروريا). ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد أن المعالجة المسبقة مع سم القلب يمكن أن تسهل engraftment في نماذج أكثر اعتدالا من ضمور العضلات(على سبيل المثال الفئران mdx). قد تتضمن تحسينات استراتيجيتنا طرقا لتعزيز نقص المناعة لمضيف الماوس (الذي لا يزال دون المستوى الأمثل في النماذج الحالية) وفعالية رعي الخلايا المانحة ، خاصة عند الولادة داخل الشرايين للخلايا الزينوجينية. على الرغم من أن زرع خلايا متعددة واستخدام الفئران الأحداث تسهم في زيادة في زراعة الخلايا7،8، وجزيئات التصاق الماوس التي تواجهها الخلايا البشرية أثناء البذخ و / أو الهجرة قد تشكل عقبات إضافية أمام نقص المناعة المحدود للنماذج الحالية. قد تتضمن الاتجاهات المستقبلية لترجمة هذا النهج العلاج الجيني والخلايا في بيئة سريرية استراتيجيات دوائية لتعزيز البذخ الخلية واستخدام ناقلات nonintegrating(مثل البلازميدات، mRNAs، الكروموسومات الاصطناعية البشرية، أو ناقلات الفيروسية nonintegrating) لإعادة برمجة وتصحيح وراثيا الخلايا، وبالتالي تجنب خطر الطفرات الغرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
قدمت شركة F.S.T. طلب براءة اختراع دولي (رقم PCT/GB2013/050112) بما في ذلك جزء من الاستراتيجية الموضحة في هذه المقالة. حصل على تمويل من بروميتيك وDWC المحدودة لأبحاثه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون جوليو كوسو ومارتينا راغازي والمختبر بأكمله على المناقشة والدعم المفيدين، وجيف تشامبرلين على تقديم ناقل ميو دي-إي. وقد أنجزت جميع التجارب التي شملت حية وفقا لجميع الوكالات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة واللوائح والمبادئ التوجيهية، والامتثال لها. ويدعم العمل في مختبر المؤلفين من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة، والجماعة الأوروبية 7 مشاريع الإطار Optistem وBiodesign ومشروع الأم دوشين الإيطالية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
