Summary
Induceret pluripotente stamceller (iPSC) afledte myogen forfædre er lovende kandidater til celleterapi strategier til behandling af muskeldystrofier. Denne protokol beskriver transplantation og funktionelle målinger, der kræves for at evaluere engraftment og differentiering af iPSC-afledte mesoangioblasts (en type muskel stamfadere) i musemodeller af akut og kronisk muskel regenerering.
Abstract
Patient-afledte iPSCs kunne være en uvurderlig kilde til celler til fremtidige autologe celleterapi protokoller. iPSC-afledte myogen stamceller svarende til pericyte-afledte mesoangioblaster (iPSC-afledte mesoangioblastlignende stamceller/stamceller: IDEM'er) kan etableres ud fra iPSC'er, der genereres fra patienter, der er ramt af forskellige former for muskeldystrofi. Patientspecifikke IDEM'er kan genetisk korrigeres med forskellige strategier(f.eks. lentivirale vektorer, humane kunstige kromosomer) og forbedres i deres myogen differentieringspotentiale ved overekspression af myogeneseregulatoren MyoD. Dette myogeniske potentiale vurderes derefter in vitro med specifikke differentieringsanalyser og analyseres ved immunfluorescens. IDEM'ernes regenerative potentiale evalueres yderligere in vivoved intramuskulær og intra-arteriel transplantation i to repræsentative musemodeller, der viser akut og kronisk muskelgendannelse. IDEM'ernes bidrag til værtsmuskulaturen bekræftes derefter af forskellige funktionelle tests i transplanterede mus. Især undersøges forbedringen af dyrenes motorkapacitet med løbebåndstest. Celle engraftment og differentiering vurderes derefter ved en række histologiske og immunfluorescensanalyser på transplanterede muskler. Samlet set beskriver dette papir de analyser og værktøjer, der i øjeblikket anvendes til at evaluere differentieringskapaciteten af IDEM'er, med fokus på transplantationsmetoderne og efterfølgende resultatforanstaltninger til at analysere effekten af celletransplantation.
Introduction
Mesoangioblasts (MAB) er kar-associerede muskel forfædre stammer fra en delmængde af pericytes1-3. Den største fordel ved MABs over kanoniske muskel forfædre såsom satellitceller4 ligger i deres evne til at krydse fartøjet væggen, når de leveres intra-arteriel og dermed bidrage til skeletmuskulatur regenerering i celleterapi protokoller. Denne funktion er blevet evalueret og bekræftet i både murin- og hundemodeller af muskeldystrofi1,5,6. Disse prækliniske undersøgelser har bygget grundlaget for et første-i-mand fase I/II klinisk forsøg baseret på intra-arteriel transplantation af donor HLA-identiske MABs hos børn med Duchenne muskeldystrofi (EudraCT nr. 2011-000176-33; i øjeblikket på vej på San Raffaele Hospital i Milano, Italien). En af de største forhindringer for celleterapi tilgange, hvor milliarder af celler er nødvendige for at behandle musklen i en hel krop, er den begrænsede proliferative potentiale "lægemiddel" (cellerne). Desuden er det for nylig blevet påvist, at det ikke er muligt at få maBs fra patienter, der er ramt af visse former for muskeldystrofi, da det forekommer i limb-girdle muskeldystrofi 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
For at overvinde disse begrænsninger er der for nylig blevet udarbejdet en protokol for afledning af MAB-lignende stamceller/stamceller fra humane og murin-iPSC'er7. Denne procedure genererer let udvides cellepopulationer med en vaskulær gen signatur og immunophenotype meget lig voksne muskel-afledte MABs. Efter udtryk for den myogeniske reguleringsfaktor MyoD gennemgår både murin og menneskelige IDEM'er (henholdsvis MIDEMs og HIDEMs) terminal skeletmuskeldifferentiering. For at nå dette mål IDEMs kan transduceres med vektorer i stand til at køre MyoD udtryk, enten konstituerende eller i en inducible måde8-10. Der anvendes en lentiviral vektor, der indeholder MyoD cDNA, fusioneret med østrogenreceptoren (MyoD-ER), hvilket gør det muligt at overføre den på tamoxifen (en østrogenanalog) administration11. Denne strategi resulterer i dannelsen af hypertrofiske multinukleerede myorør med høj effektivitet7. Især IDEM'er er ikke-kønsopdemærksom, kan engraft og differentiere inde værtsmuskler ved transplantation og kan genetisk korrigeres ved hjælp af forskellige vektorer(f.eks lentivirus eller humane kunstige kromosomer), hvilket baner vejen for fremtidige autologe terapeutiske strategier. Afledning, karakterisering og transplantation af IDEM'er er beskrevet i ovennævntepublikation 7. Denne protokol papir beskriver de assays udført for at evaluere in vitro myogen differentiering af IDEMs og de efterfølgende resultatmålinger for at teste effekten af deres transplantation i musemodeller af muskel regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vurdering af myogenisk og engraftment potentiale
-
In vitro: MyoD-induceret differentiering
- Generer en stabil cellelinje af IDEM'er, der transduceres med den tamoxifen-uucerbare MyoD-ER lentivirale vektor, der titrerer infektionens mangfoldighed (MOI; f.eks. 1, 5 og 50) ved hjælp af farvningen som beskrevet i 1.1.9 (MyHC) som et resultat af procedurens effektivitet.
- Coat en 3,5 cm skål med 1 ml 1% Matrigel og inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Pladen vaskes to gange med medium, frø 1 x 105 MyoD-ER transducerede IDEM'er i 3,5 cm vævskulturskålen og inkuberes ved 37 °C i vækstmedium.
- Forvent, at cellerne når sammenløb om en eller to dage, og tilsæt derefter 1 μM 4OH-tamoxifen i vækstmediet(1. dosis).
- Efter 24 timer skal vækstmediet erstattes med differentieringsmedium suppleret med 1 μM 4OH-tamoxifen (2. og sidste dosis).
- Udskift halvdelen af mediet med frisk differentieringsmedium hver anden dag.
- Undersøg dagligt kulturerne for myotube dannelse.
- Efter en uge (5 dage i differentieringsmedium) vaskes pladerne forsigtigt med PBS og fastgøres med 4 % paraformaldehyd i 5 min ved RT.
- Udfør en immunfluorescens farvning med antistoffer mod myosin tung kæde (MyHC) for at bekræfte tilstedeværelsen af myotubes. Modstain med et nukleart farvestof(f.eks.
Differentieringens effektivitet evalueres som procentdelen af kerner inde i MyHC-positive celler: Fortsæt til næste trin, hvis effektiviteten er >50%.
-
In vivo: engraftment i en model af akut muskel regenerering
For at evaluere MyoD-ER IDEM'ernes in vivo-bidrag til muskelgendannelse er cellerne tidligere mærket med en vektorkodning for det grønne fluorescerende protein (GFP), der gør det muligt at spore dem inde i vævet. MyoD-ER GFP IDEMs injiceres derefter i voksne murinmuskler, tidligere skadet med et myotoxin(f.eks. kardiotoksin). For at undgå immunafstødning mod xenogene (såsom HIDEMs) eller genetisk manipulerede/korrigerede celler er det nødvendigt at bruge enten immundefekt eller immunosuppressede mus.- Forbehandle dyrene med en intra-peritoneal injektion på 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoxifen (liposoluble form) 24 timer før transplantation og pretreat celler tilføje 1 μM 4OH-tamoxifen (vandig form) i vækstmediet natten før transplantationen dag.
- Administrere anæstesi og smertestillende midler til musen efter de specifikke retningslinjer, der regulerer kirurgiske procedurer i dyrefaciliteten.
- 25 μl μl μl μM kardiotoksin (CTX; fra Naja mossambica mossambica; ADVARSEL: potentielt skadeligt stof) i tibialis-musklerne foran (TA).
- 24 timer efter behandling af dyrene med tamoxifen og CTX, løsne cellerne ved trypsinisering og tælle.
- Centrifuge cellerne ved 232 x g i 5 min.
- Cellepillen vaskes i Ca2+- og Mg2+-fri PBS, centrifuge og genbruges derefter forsigtigt cellepillen i Ca2+- og Mg2+-fri PBS til en endelig koncentration på 106 celler/30 μl, hvilket vil være det endelige volumen af hver injektion.
- Der injiceres 30 μl celleaffjedring i de tidligere skadede muskler ved hjælp af en sprøjte med 29 eller 30 G nål. Vær særlig opmærksom, mens du fjerner nålen fra musklen. Gør det langsomt, undgå at spilde celleaffjedringen gennem nålens spor. Den kontralaterale TA må ikke transplanteres og anvendes som kontrol, idet der injiceres 30 μl Ca2+- og Mg2+-fri PBS for at kopiere betingelserne for den transplanterede.
- Dyr behandles med tamoxifen i yderligere seks dage og smertestillende midler(f.eks.
- Udjdr. musklerne fra 14 dage efter transplantationen og fremefter. Behandl og analysér prøverne som beskrevet i protokol 4 og 5.
2. Transplantation i musemodeller af muskelsvind
Denne transplantation assay gør det muligt at vurdere omfanget af engraftment af IDEMs i musemodeller af muskelsvind. Dyrene, der behandles som følger, kan også vurderes for funktionel forbedring af sygdomsfoenotypen. Funktionelle tests kan udføres fra to uger efter transplantation. For at forbedre engraftment overveje at udføre pretransplantation løbebånd øvelse (som beskrevet i protokol 3) og / eller seriel celle injektioner hver tredje uge for 3x(dvs. for i alt 3 injektioner / muskel).
- Intramuskulær transplantation
- Forbehandle dyrene med en intra-peritoneal injektion på 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoxifen (liposoluble formulering) 24 timer før transplantation og pretreat celler tilføje 1 μM 4OH-tamoxifen (vandig formulering) i vækstmediet natten før transplantationen dag.
- Løsrive ved trypsinisering, tælle og centrifuge cellerne på 232 x g i 5 min.
- Cellepillen vaskes i Ca2+- og Mg2+-fri PBS, centrifuge og derefter genbruges pellet i Ca2+- og Mg2+-fri PBS til en koncentration på 106 celler/30 μl.
- Administrere analgesi og desinficere dyrets hud (valgfrit) med et povidone jod- eller chlorexidinbaseret desinfektionsmiddel. Dette vil også bidrage til at lokalisere tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC), og quadriceps femoris (QC; specielt vastus intermedius)muskler.
- Der injiceres 30 μl celleaffjedring i musklerne ved hjælp af en sprøjte med en nål på 29 eller 30 G. For TA skal du indsætte 5 mm af nålen 2 mm under indsættelsen af den proksimale sene (kraniokadale retning) med en 15° hældning i forhold til skinnebenet og langsomt injicere celleaffjedringen, mens du trækker nålen tilbage (tøm sprøjten med 2 mm nålen stadig inde i musklen). For GC og QC gentages samme procedure som nærmere beskrevet for TA, hvor den væsentligste forskel er den caudocraniale indsættelse af nålen 2 mm over det myotendinøse kryds af akillessenen for GC og 2 mm over distal sene for QC (15° hældning med hensyn til lårbenet). Vær opmærksom, mens du fjerner nålen fra musklen for at undgå at spilde celleaffjedringen gennem nålesporet.
FEJLFINDING: I tilfælde af lav engraftment overveje at injicere unge (1-2 uger gamle) mus7 med 3 x 105 celler/10 μl (bemærk, at i dette tilfælde tamoxifen skal administreres subkutant).
- Transplantation inden for arterien
Denne del af protokollen gør det muligt at evaluere MIDEMs og HIDEMs evne til at blive leveret i arteriel cirkulation, krydse karvæggen og bidrage til skeletmuskulatur regenerering i musklerne nedstrøms til injektionsstedet.- Forbehandling af dyr og celler som beskrevet ovenfor i trin 2.1.1.
- Løsrive ved trypsinisering og filtrere med en 40 μm celle si (for at fjerne klynger fra celle suspension i det usandsynlige tilfælde, at natten eksponering for tamoxifen kunne drive fusion og dannelse af myorør fra tilstødende celler) tælle og centrifuge cellerne på 232 x g i 5 min
- Vask cellepillen i Ca2+- og Mg2+-fri PBS, centrifuge og genbrug derefter pellet i Ca2+- og Mg2+-fri PBS med 0,2 International
Enheder af natrium heparin (valgfrit) til en slutcellekoncentration på 106 celler/50 μl. Der tilsættes 10% patentblåt farvestof (endelig koncentration: 1,25 mg/ml i normal saltvand eller Ca2+- og Mg2+-fri PBS) til opløsningen for at visualisere celleaffjedringens fordeling. - Administrere anæstesi og smertestillende midler til musen i henhold til retningslinjerne for kirurgiske procedurer i den specifikke institutionelle dyrefacilitet.
- Barber inguinalregionen (også kendt som femoral eller Scarpas trekant) og desinficer huden med et povidone jod- eller klorhexidinbaseret desinfektionsmiddel.
- Lav et 5-7 mm snit og lokalisere lårbenet bundt: vene, arterie og nerve (nerven ligger sideværts til arterien og venen medialely).
- Fjern forsigtigt den bindende fascia, der dækker bundtet med tang.
- Adskil lårbenet vene og nerve fra arterien ved forsigtigt at indføre spidsen af en pincet (eller en 30 G nål) i mellem dem og ved gradvist at udvide hullet.
FEJLFINDING: Lårbenets vene er skrøbelig: Vær opmærksom på ikke at klemme det med tangen under dens løsrivelse fra lårpulsåren. I tilfælde af blødning, dræne blodet med steril gaze og bruge en mikro cauterizer at lette hemostase. - Løft arterien med den ene spids af tangen og klem arterien med den anden spids.
- Punkter arterien med en sprøjte udstyret med en 30 G nål. Der injiceres 50 μl celleaffjedring nedstrøms for det fastspændte område ved en infusionshastighed på ca. 5 μl/sek.
FEJLFINDING: Resuspend cellerne i sprøjten forsigtigt før injektionen: Det er vigtigt at undgå udfældning af celler og luftbobledannelse inde i sprøjten. Femoralpulsårens diameter er lidt mindre end en 30 G nål: Pas på ikke at afkorte arterien, mens du indsætter nålen. Patentblåt farvestof gør det muligt at genkende injektionens effektivitet: Hvis det injiceres korrekt, vil hele lemmerne hurtigt blive lyseblå. - Fjern langsomt nålen og tangen fra arterien for at genoprette blodbanen i lemmerne.
- Tryk med steril gaze for at undgå blødning og/eller cauterize efter behov.
- Sutur såret og overvåge dyrene, indtil inddrivelse fra anæstesi.
- Administrere analgesi i 3 dage og inspicere såret dagligt (i tilfælde af sårinfektion diskutere dette med dyret facilitet personale og administrere antibiotika efter behov).
3. Resultat Foranstaltninger om transplanterede dystrofiske dyr: Løbebånd Test
Fra to uger efter celletransplantation er det muligt at evaluere funktionel forbedring af motorkapaciteten hos behandlede mus med løbebåndstestene. Denne test gør det muligt at vurdere motionstolerance/udholdenhed hos behandlede mus. En mus betragtes som træt, når den ligger i hvileområdet i mere end 5 sek. uden at forsøge at reengage løbebåndet efter en serie på 3 på hinanden følgende mekaniske stimuli (en hvert 5 sek. ). Basismålinger starter ca. en måned før behandlingen og bruges til at evaluere forbedringen af hvert enkelt testet dyr. Denne test kan efterfølges af yderligere analyse for at overvåge fiber skrøbelighed, kraft forbedring, engraftment, differentiering af transplanterede celler, og morfologiske forbedring af transplanterede muskler (se diskussion).
- Akklimatisere dyrene (normalt tre grupper: behandlet, ubehandlet, og vilde type / ikke dystrofisk kontrol) til øvelsen før den første måling: sæt løbebåndet med en hastighed på 6 m / min i 10 min. Gentag proceduren hver anden dag i en uge.
FEJLFINDING: Registrer alle målingerne på samme tidspunkt af dagen for at undgå skævheder på grund af døgnrytmen. - Placer dyrene i løbebåndet, som tidligere er sat op med en hældning på 10°.
- Tænd for løbebåndet med en starthastighed på 6 m/min (giv en blid mekanisk stimulus, hvis dyrene ikke er villige til at starte træningen).
- Start timeren og øg hastigheden 2 m/min hver 2 min.
- Så snart et dyr ligger i hvileområdet i mere end 5 sek uden at forsøge at reengage løbebåndet, skal du forsigtigt røre ved det med en pind for at stimulere genstarten af øvelsen (se ovenfor).
- Registrer hvert dyrs ydeevne (tid og eller afstand).
- Gentag målingerne ugentligt eller hver 10. dag i mindst 3x.
- Gentag den samme procedure efter transplantation.
- Analyser præstationsdata, der sammenligner målingen af hvert dyr med dets oprindelige ydeevne. Vi foreslår at afbilde værdierne i en graf som en procentdel af den gennemsnitlige motorkapacitet i forhold til baseline og analysere dem ved en en- eller tovejs ANOVA-test efterfulgt af passende post-test for at sammenligne grupperne.
FEJLFINDING: Brug mindst fem alders-, genotype- og kønsmatchede dyr/gruppe, og gentag målingerne i mindst 3x efter transplantationen.
4. Evaluering af celle engraftment og differentiering i transplanterede muskler
Transplanterede og kontrolmuskler høstes på det rette tidspunkt (<2 dage til kortsigtet engraftmentanalyse, 2-3 uger til midtvejs- og >1 måned til langsigtet analyse). Hvis de transplanterede celler er mærket med GFP, kan engraftmentet i frisk isolerede muskler vurderes ved direkte fluorescens under et UV-udstyret stereomikroskop.
- Læg og orient langs den lodrette akse frisk isolerede muskler i tragachanth tyggegummi (6% w/ v)
- Dehydrer prøverne i prechilled isopentan i et minut, frys dem i flydende nitrogen i mindst 2 minutter og læg dem straks ved -80 °C til opbevaring.
- Prøverne behandles med en kryostat for at opnå 7 μm tykke sektioner på polariserede dias. Prøve størstedelen af musklen på dias, indsamle ca 8-10 dias med 30-40 sektioner / dias. Det anbefales at samle en række sektioner i et 1,5 ml rør for at udføre molekylærbiologi / biokemianalyse.
- Vurder celle engraftment med forskellige immunfluorescerende farvning, afhængigt af den eksperimentelle opsætning. I tilfælde af HIDEM-transplantation i Sgca-null/scid/bg-mus skal du f.eks. b) et antistof mod Laminin for at visualisere musklens overordnede struktur; og c) et antistof mod Sgca til påvisning af donorafledt genopretning af proteinet, der ikke er i dystrofiskt dyr.
- Kvantificere, ved hjælp af en fluorescens mikroskop, antallet af donor kerner pr muskel sektion i og uden for muskelfibre og antallet af donor-afledte skelet myofibers per sektion.
5. Muskel histopatologi
Histopatologiske analyser gør det muligt at vurdere den transplanterede muskels morfologiske struktur. Arkitektonisk forbedring i vævsstrukturen forventes som et resultat af celleterapimetoden.
- De frisk isolerede muskler fastgøres med 4% paraformaldehyd i 1 time ved 4 °C.
- Dehydrer prøverne med en stigende saccharosegradient(f.eks. 7,5-15-30% w/v).
- Lad musklerne natten over i den højeste saccharoseopløsning.
- Prøverne integreres i Tissue Tek OCT, anbringes i forspring, indtil OLT bliver fast (uden fuldstændig nedsænkning af prøverne), fryses i flydende nitrogen i mindst 2 minutter, og de anbringes straks ved -80 °C til opbevaring.
- Prøverne behandles med en kryostat for at opnå 7 μm tykke sektioner som beskrevet ovenfor.
- Plette sektionerne med hematoxylin og eosin eller Massons trikrom i henhold til standardproducentens protokoller.
Hematoxylin- og eosinpletter gør det muligt at beregne kendetegnene for regenererende muskler, f.eks.: a) antallet af myofibers; b) tværsnitsareal c) antallet af myofibers indeholdende en central kerne. Massons trikrom bruges til at beregne det fibrotiske indeks, udført ved at trække det samlede areal, der er besat af skelettets myofibers, fra billedets samlede areal: Det resulterende område afspejler hovedsageligt muskelens binde- og fedtinfiltration. Alle analyser på billederne kunne udføres ved hjælp af ImageJ software (NIH) med måleværktøjet og celle tæller plugin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De rapporterede repræsentative resultater følger de vigtigste in vitro/in vivo-analysepunkter, der er afbildet i arbejdsprocessen i figur 1. 48 timer efter 4OH-tamoxifen administration MyoD-positive kerner kan identificeres inden for MyoD-ER transducerede IDEMs i kultur (Figur 2A). Cellerne smelter derefter sammen og differentieres til multinukleerede myorør (Figur 2B). Ved intramuskulært transplantation til en murinmodel af akut muskelskade bidrager IDEM'er til vævsregenerering (Figur 3). Effekten af IDEM'er i en gen- og celleterapiindstilling for murinmodeller af muskeldystrofi blev vurderet ved test af løbebåndsøvelsestolerance: Figur 4 viser de resultater, der er opnået efter transplantation af midems af vildtype til Sgca-null/scid/beige mus, og viser en forbedring af motorkapaciteten hos behandlede mus7. Ex vivo-analyser af transplanterede muskler viser GFP-positive områder, der repræsenterer omfanget af kolonisering af IDEM'er i værtsvævet (Figur 5A-C), hvilket viser, at donorceller engrafter ind i dystrofisk muskel. Vigtigere, transplanterede celler er i stand til at differentiere in vivo, danner nye skelet myofibers. Figur 5 viser Sgca-udtryk fra genetisk korrigerede HIDEMs til Sgca-null/scid/beige mus (Figur 5D og 5E). Strukturel forbedring i arkitekturen af transplanterede muskler kan vurderes gennem Massons trikrome farvning: Figur 5F viser et fald i mængden af fibrotisk væv i behandlede muskler.
Figur 1. Protokolrutediagram. Ordningen giver et overblik over den IDEM-baserede strategi, fra indledende in vitro differentieringsanalyser (til venstre) til de forskellige trin, der er nødvendige for at vurdere engraftment, myogent potentiale og funktionel forbedring in vivo og ex vivo (højre). Mørkegrå bokse indeholder de forskellige trin, der er beskrevet i protokollen. lysegrå bokse indeholder dele af metoden, som ikke er beskrevet i denne artikel. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 2. Vurdering af myogent potentiale in vitro. (A) Immunfluorescens viser nukleare MyoD udtryk i 4 ud af 7 MyoD-ER transduceret MIDEM kerner efter 48 timers eksponering for 4OH-tamoxifen. (B) Immunofluorescensfarvning for myosin tung kæde (MyHC) på 4OH-tamoxifen-induceret HIDEM-afledte myorør efter en uge i differentieringsmedium (Scale bar, 200 μm). Klik her for at få vist en større figur.
Figur 3. In vivo vurdering af celle engraftment i en model af akut muskel regenerering. (A) Stereomicroskopisk GFP fluorescens billeder af frisk isolerede kardiotoxin-skadede tibialis forreste muskler udplantet 2 uger efter intramuskulær injektion af 106 GFP-HIDEMs (venstre) og GFP-MIDEMs (center). Skala bar, 2 mm. (B) Lav (top) og høj (bund) forstørrelse billeder af musklen transplanteret med MIDEMs vist i (A) viser GFP-positive myofibers. Skalastang, 200 μm. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 4. Løbebånd motion tolerance test. Repræsentativ løbebåndstest for transplanteret (IM = intramuskulær; IA = intra-arteriel). Sgca-null/scid/beige mice (106 celle/injektion) versus ikke-genplantede dystrofiske og nondystrofiske kontrol immundefektmus. Plottet viser funktionel forbedring af dystrofiske mus transplanteret med MIDEMs (12-22% mere end ikke-genplantede dyr 35 dage efter transplantation). Data vises som gennemsnitlig motorkapacitet i forhold til baseline-ydeevne(dvs. 100% repræsenterer basisresultaterne for hver gruppe og forbedrer den kun betydeligt ved gentagne målinger). *P < 0,05; ** P < 0,005, envejs ANOVA. Fra tidligere offentliggjorte værker af forfatterne7. Klik her for at få vist en større figur.
Figur 5. In vivo vurdering af engraftment og myogenic potentiale i musemodeller af muskelsvind. (A) Stereomicroskopisk GFP-fluorescensbilleder af frisk isolerede tibialis forreste muskler hos Sgca-null/scid/beige mus udgravet 3-4 uger efter intramuskulær injektion på 106 humane (HIDEMs, venstre; transplantation hos unge mus) og murin (MIDEMs; højre) GFP-IDEMs. Skala bar, 2 mm. (B) Stereomicroskopisk GFP fluorescens billede af en frisk isoleret gastrocnemius muskel udplantet 3 uger efter intra-arteriel injektion af 106 GFP-MIDEMs. Skala bar, 1 mm. (C) Frisk frossen tværgående del af musklen transplanteret med MIDEMs vist i (A) viser en klynge af GFP-positive myofibers. Skalastang, 200 μm. (D) Immunfluorescenspletter på dele af intramuskulært transplanterede muskler (som i A),der viser klynger af genetisk korrigerede fibre, stammer fra podede IDEM'er. Skalastang, 150 μm. (E) Kvantificering af α-sarcoglycan (Sgca)-positive myofibre en måned efter intramuskulær transplantation af genetisk korrigerede IDEM'er til Sgca-null/scid/beige mus. (F) Masson trichrom farvning af tibialis forreste muskler fra transplanteret og kontrol Sgca-null/scid/beige mus (rød: muskelfibre; blå: fibrose), der fremhæver reduktionen af den fibrotiske infiltrere i behandlede muskler. Skalastang, 200 μm. Klik her for at få vist en større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IPSC'er kan udvides på ubestemt tid , samtidig med at deres selvfornyelsespotentiale bevares , og dermed rettes mod at differentiere sig til en bred vifte af cellelinjer12. Af denne og andre grunde betragtes iPSC-afledte stamceller/stamceller som en lovende kilde til autologe gen- og celleterapimetoder13. En tidligere offentliggjort arbejde fra forfatterne rapporterede generation af mus og humane myogeniske forfædre fra iPSCs med en fænotype svarende til pericyte-afledte MABs (IDEMs) og deres effektive bidrag til muskel regenerering i en mus model af muskelsvind7.
En forudsætning for at maksimere IDEM myogenisk potentiale er udtryk for den myogeniske faktor MyoD i cellerne. Transduktionen med en tamoxifen-uuducerbar MyoD-ER-kassette gjorde det muligt at have en præcis tidsmæssig kontrol over sit udtryk med den fordel, at den synkroniserede sin aktivering i hele kulturen og efterfølgende in vivo. En transplantationsstrategi baseret på en enkelt indgift af celler pr. muskel (eller pr. lårpulsåre) er beskrevet i denne artikel. Imidlertid har gentagne celleinjektioner vist sig at være effektive til at øge MAB-engraftment i forskellige celleterapiprotokoller8. Derfor er det i tilfælde af suboptimale resultater med IDEM'er værd at udføre gentagne transplantationer for at øge celledæsning og dermed bidrag til værtsmusklen.
Resultatmålinger gør det muligt at vurdere donorcellernes bidrag til den funktionelle forbedring af fænotypen af behandlede dyr. Ud over træningstolerancen/udholdenhedstesten udført med løbebåndet kan yderligere test til analyse af frivillig motorkapacitet(f.eks. frihjulstest), fiberdyenhed(f.eks. Evans blue dye uptake assay) og specifik kraft(f.eks. enkeltfibre eller fuldmuskelmekanik) betragtes som8. Yderligere metoder til test af funktionel fænotypeforståelse er tilgængelige som standardprocedurer på Treat-NMD's websted (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
For at indsamle væsentlige oplysninger fra de transplanterede dyr skal den funktionelle forbedring efterfølges og valideres ved hjælp af immunokemiske og histologiske analyser for at evaluere celleindretning og vævsarkitektur/remodeling. Det er især vigtigt at evaluere den morfometriske struktur af de podede muskler for kendetegnende for regenerering og fibrose, såsom at vurdere antallet af fibre med en central kerne, myofibers tværsnitsareal og det fibrotiske indeks. Sidstnævnte analyser giver sammen med de funktionelle resultater et udtømmende overblik over strategiens effektivitet. Desuden er overvågning af den afstamning, der anvendes af transplanterede celler med hensyn til bidrag til vævet(dvs. myofibers) og vedligeholdelse af stamcellerummet, vigtig for den langsigtede effekt af alle celleterapistrategier. I dette tilfælde er det allerede blevet indberettet det donorbaserede bidrag in vivo til det pericyte-rum, hvorfra mesoangioblaster stammer7; Desuden viser foreløbige resultater funktionelt bidrag fra IDEM'er også til satellitcellepuljen (Gerli og Tedesco, ikke-offentliggjorte resultater). Molekylære analyser til påvisning af engraftment og ekspression af det korrigerede gen (dvs. kvantitativ PCR og vestlig skamplet) er også kritiske, men ligger uden for dette papirs anvendelsesområde og ville kræve en dedikeret artikel.
Selv om denne protokol hovedsageligt er udviklet ved hjælp af Sgca-null/scid/beige mice7 (en nyligt offentliggjort immundefektmodel af LGMD2D), forventes det, at den let kan anvendes på andre modeller af muskelsygdomme. I tilfælde af Sgca-null/scid/beige brugte vi ikke kardiotoksin, da musklerne hos disse dyr er alvorligt kompromitteret og kronisk udsat for degenerations- og regenereringscyklusser (derfor er en yderligere skade fra kardiotoksin ikke nødvendig). Vi kunne dog ikke udelukke, at en forbehandling med kardiotoksin kunne lette engraftment i mildere modeller af muskeldystrofi(f.eks. mdx mus). Forbedringer af vores strategi kan omfatte metoder til at øge immundefekten hos museværten (som i de nuværende modeller stadig er suboptimal) og effekten af donorcelleindretning, især ved intra-arteriel levering af xenogene celler. Selv om flere celletransplantation og brugen af unge mus bidrager til stigningen i celle engraftment7,8, musen vedhæftning molekyler stødt på menneskelige celler under ekstravasation og / eller migration kan udgøre yderligere forhindringer for den begrænsede immundefekt af de nuværende modeller. Fremtidige retningslinjer for oversættelse af denne gen- og celleterapimetode i kliniske omgivelser kan omfatte farmakologiske strategier til at forbedre celleekstraktion og brugen af ikke-integrerende vektorer(f.eks. plasmider, mRNA'er, humane kunstige kromosomer eller ikke-integrerende virale vektorer) til at omprogrammere og genetisk korrigere cellerne og dermed undgå risikoen for insistent mutagenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. har indgivet en international patentansøgning (nr. PCT/GB2013/050112), herunder en del af den strategi, der er beskrevet i denne artikel. Han modtog støtte fra Promimetic og DWC ltd. til sin forskning.
Acknowledgments
Forfatterne takker Giulio Cossu, Martina Ragazzi og hele laboratoriet for nyttig diskussion og støtte, og Jeff Chamberlain for venligt at give MyoD-ER vektor. Alle forsøg med levende dyr blev gennemført i overensstemmelse med og i overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle agenturer, forordninger og retningslinjer. Arbejdet i forfatternes laboratorium støttes af UK Medical Research Council, Det Europæiske Fællesskabs 7. rammeprogram Optistem og Biodesign og det italienske Duchenne Parent Project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
