Summary
תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים (iPSC) שמקורם באבות מיוגניים מבטיחים מועמדים לאסטרטגיות טיפול בתאים לטיפול בדיסטרופיות שרירים. פרוטוקול זה מתאר השתלות ומדידות תפקודיות הנדרשות כדי להעריך את החריטה והבידול של מזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (סוג של אבות שרירים) במודלים של עכברים של התחדשות שרירים חריפה וכרונית.
Abstract
IPSCs שמקורם בחולה יכול להיות מקור תאים שלא יסולא בפז עבור פרוטוקולים עתידיים של טיפול בתאים אוטולוגיים. תאי גזע/אב מיוגניים שמקורם ב- iPSC בדומה לזואנגיובלסטים שמקורם ב- iPSC (תאי גזע/אב דמויי iPSC: IDEMs) יכולים להיווצר מ- iPSCs המופקים מחולים המושפעים מצורות שונות של ניוון שרירים. IDEMs ספציפיים למטופל ניתן לתקן גנטית עם אסטרטגיות שונות(למשל, וקטורים lentiviral, כרומוזומים מלאכותיים אנושיים) ומשופר בפוטנציאל הבידול המיוגני שלהם על חשיפת יתר של MyoD הרגולטור myogenesis. פוטנציאל מיוגני זה מוערך לאחר מכן במבחנה עם מבחני בידול ספציפיים ומנותח על ידי כשל חיסוני. הפוטנציאל ההתחדשותי של IDEMs מוערך עוד יותר vivo, על השתלה תוך שרירית תוך עורקית בשני מודלים של עכבר מייצג המציגים התחדשות שרירים חריפה וכרונית. תרומתם של IDEMs לשריר השלד המארח מאושרת לאחר מכן על ידי בדיקות תפקודיות שונות בעכברים מושתלים. בפרט, ההשתלבות של היכולת המוטורית של בעלי החיים נחקרת בבדיקות הליכון. חריטה של תאים ובידול מוערכים לאחר מכן על ידי מספר מבחני היסטולוגיה ואימונופלואורסצנטיות על השרירים המושתלים. בסך הכל, מאמר זה מתאר את הבדיקות והכלים המשמשים כיום להערכת יכולת הבידול של IDEMs, תוך התמקדות בשיטות ההשתלה ובאמצעי התוצאה הבאים כדי לנתח את היעילות של השתלת תאים.
Introduction
Mesoangioblasts (MABs) הם אבות שרירים הקשורים לכלי שמקורם בקבוצת משנה של pericytes1-3. היתרון העיקרי של MABs על אבות שרירים קנוניים כגון תאי לווין4 שוכן ביכולתם לחצות את קיר כלי השיט כאשר מועברים תוך עורקי ולכן לתרום התחדשות שריר השלד בפרוטוקולים טיפול בתא. תכונה זו הוערכה ואושרה הן במודלים מורין והן במודלים של ניוון שרירים1,5,6. מחקרים פרה-קליניים אלה בנו את היסודות לניסוי קליני שלב I/II ראשון באדם המבוסס על השתלת פנים-עורקים של MABS זהה HLA בילדים עם ניוון שרירים דושן (EudraCT מס '2011-000176-33; כרגע הולך בבית החולים סן רפאלה של מילאנו, איטליה). אחד המכשולים העיקריים של גישות טיפול בתאים, שבו מיליארדי תאים נדרשים לטיפול בשריר של גוף שלם, הוא הפוטנציאל המשגשג המוגבל של "המוצר הרפואי" (התאים). יתר על כן הוכח לאחרונה כי לא ניתן להשיג MABs מחולים מושפעים על ידי צורות מסוימות של ניוון שרירים, כפי שהוא מתרחשת ניוון שרירים מחוך גפיים 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול להפקת תאי גזע / אב דמויי MAB מ- IPSCs אנושיים ומורין הוקם לאחרונה7. הליך זה מייצר אוכלוסיות תאים הניתנות להרחבה בקלות עם חתימת גן כלי דם ואימונופנוטיפ הדומה מאוד ל- MABs שמקורם בשרירים למבוגרים. עם ביטוי של גורם רגולטורי מיוגני MyoD, הן מורין ו IDEMs אנושי (בהתאמה MIDEMs ו HIDEMs) לעבור בידול שריר השלד סופני. כדי להשיג מטרה זו IDEMs יכול להיות transduced עם וקטורים מסוגלים לנהוג ביטוי MyoD, או מכונן או באופן בלתי ניתן להעברה8-10. וקטור lentiviral המכיל MyoD cDNA התמזגו עם קולטן האסטרוגן (MyoD-ER) משמש, ובכך מאפשר טרנסלוקציה הגרעינית שלה על טמוקסיפן (אנלוגי אסטרוגן) הממשל11. אסטרטגיה זו גורמת להיווצרות של myotubes רב-גרעיני היפרטרופי, עם יעילות גבוהה7. יש לציין, IDEMs הם nontumorigenic, יכול לחרוט ולהבדיל בתוך השרירים המארחים בעת ההשתלה והוא יכול להיות מתוקן גנטית באמצעות וקטורים שונים(למשל lentiviruses או כרומוזומים מלאכותיים אנושיים), סולל את הדרך אסטרטגיות טיפוליות אוטולוגיות בעתיד. הנגזרת, האפיון וההשתלה של IDEMs תוארו בפרסוםלעיל 7. נייר פרוטוקול זה מפרט את הבדיקות שבוצעו כדי להעריך את הבידול המיוגני במבחנה של IDEMs ואת מדידות התוצאה הבאות כדי לבדוק את היעילות של ההשתלה שלהם במודלים העכבר של התחדשות שרירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הערכת פוטנציאל מיוגני וחריטה
-
במבחנה: בידול הנגרמת על ידי MyoD
- צור קו תאים יציב של IDEMs transduced עם טמוקסיפן-בלתי ניתן להמצאה MyoD-ER lentiviral וקטור, titrating ריבוי של זיהום (MOI; למשל 1, 5 ו-50) באמצעות הכתם המתואר ב-1.1.9 (MyHC) כתוצאה מיעילות ההליך.
- מעיל צלחת 3.5 ס"מ עם 1 מ"ל של 1% Matrigel ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הצלחת פעמיים עם בינוני, זרעים 1 x 105 MyoD-ER transduced IDEMs בצלחת תרבית רקמות 3.5 ס"מ דגירה ב 37 °C (70 °F) במדיום צמיחה.
- מצפה כי תאים להגיע מפגש ביום או יומיים ולאחר מכן להוסיף 1 μM 4OH-טמוקסיפן לתוך מדיום הצמיחה (מנה 1st).
- לאחר 24 שעות, להחליף את מדיום הצמיחה עם מדיום בידול בתוספת 1 מיקרומטר 4OH-טמוקסיפן (2nd ואת המנה האחרונה).
- החלף מחצית המדיום עם מדיום בידול טרי כל יומיים.
- בחן מדי יום את התרבויות להיווצרות myotube.
- לאחר שבוע אחד (5 ימים במדיום בידול), לשטוף את הצלחות בעדינות עם PBS ולתקן עם 4 % paraformaldehyde במשך 5 דקות ב RT.
- בצע מכתים immunofluorescence עם נוגדנים נגד שרשרת כבדה myosin (MyHC) כדי לאשר את נוכחותם של myotubes. כתם נגדי עם צבע גרעיני(למשל הויסט).
יעילות הבידול מוערכת כאחוז הגרעינים בתוך התאים החיוביים של MyHC: המשך לשלב הבא אם היעילות היא >50%.
-
In vivo: חריטה במודל של התחדשות שרירים חריפה
כדי להעריך את תרומת in vivo של IDEMs MyoD-ER להתחדשות שרירים, התאים מסומנים בעבר עם קידוד וקטור עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שיאפשר לעקוב אחריהם בתוך הרקמה. IDEMs GFP MyoD-ER מוזרקים לאחר מכן לתוך שרירי מורין מבוגרים, שנפצעו בעבר עם מיוטוקסין(למשל, קרדיוטוקסין). כדי למנוע דחייה חיסונית נגד קסנוגני (כגון HIDEMs) או תאים שעברו מניפולציה גנטית/מתוקנת, יש להשתמש בעכברים חיסוניים או מדכאי חיסון.- Pretreat בעלי החיים עם הזרקה תוך-הצפק של 3.5 μl / g של 10 מ"ג / מ"ל טמוקסיפן (צורה liposoluble) 24 שעות לפני ההשתלה ותאי pretreat הוספת 1 μM 4OH-טמוקסיפן (צורה מימית) לתוך מדיום הצמיחה לילה לפני יום ההשתלה.
- לנהל הרדמה ומשככי כאבים לעכבר בעקבות ההנחיות הספציפיות המסדירות הליכים כירורגיים במתקן בעלי החיים.
- הזרק 25 μl של 100 מיקרומטר קרדיוטוקסין (CTX; מ Naja mossambica mossambica; התראה: חומר שעלול להזיק) בשרירי השוקית (ת"א).
- 24 שעות לאחר טיפול בבעלי החיים עם טמוקסיפן ו- CTX, נתק את התאים על ידי טריפסיניזציה וספירה.
- צנטריפוגה התאים ב 232 x g במשך 5 דקות.
- לשטוף את גלולת התא Ca2 +- ו מ"ג2 +ללא PBS, צנטריפוגה ולאחר מכן בעדינות resuspend גלולת התא ב Ca2 +- ו מ"ג2 +- PBS חינם לריכוז הסופי של 106 תאים / 30 μl, אשר יהיה הנפח הסופי של כל זריקה.
- להזריק 30 μl של השעיית התא לתוך השרירים שנפצעו בעבר באמצעות מזרק עם 29 או 30 G מחט. שים לב במיוחד בעת הסרת המחט מהשריר. לעשות את זה לאט, הימנעות לשפוך את המתלה התא דרך המסלול של המחט. אין להשתיל את ת"א הנגדי ולהשתמש בו כבקרה, הזרקת 30 μl של Ca2 +- ו מ"ג2 +ללא PBS כדי לשכפל את התנאים של המושתל.
- לטפל בבעלי החיים עם טמוקסיפן במשך שישה ימים נוספים ולנהל משככי כאבים (למשל Carprofen) במשך יומיים נוספים.
- explant את השרירים מ 14 ימים לאחר ההשתלה ואילך. עבד ונתח את הדגימות כמפורט בפרוטוקולים 4 ו- 5.
2. השתלה במודלים עכבר של ניוון שרירים
מבחני השתלה אלה מאפשרים להעריך את היקף החריטה של IDEMs במודלים עכבר של ניוון שרירים. בעלי החיים, מטופלים כדלקמן, ניתן גם להעריך עבור amelioration תפקודי של פנוטיפ המחלה. ניתן לבצע בדיקות תפקודיות החל משבועיים לאחר ההשתלה. על מנת לשפר את החריטה לשקול ביצוע תרגיל הליכון pretransplantation (כמתואר בפרוטוקול 3) ו / או זריקות תאים סדרתי כל שלושה שבועות עבור 3x(כלומר בסך הכל 3 זריקות / שריר).
- השתלה תוך שרירית
- Pretreat בעלי החיים עם הזרקה תוך-הצפק של 3.5 μl / g של 10 מ"ג / מ"ל טמוקסיפן (ניסוח liposoluble) 24 שעות לפני ההשתלה ותאי pretreat הוספת 1 μM 4OH-טמוקסיפן (ניסוח מימית) לתוך מדיום הצמיחה לילה לפני יום ההשתלה.
- נתק על-ידי טריפסיניזציה, ספור וצנטריפוגה של התאים ב- 232 x g למשך 5 דקות.
- לשטוף את גלולת התא Ca2 +- ו מ"ג2 +ללא PBS, צנטריפוגה ולאחר מכן resuspend גלולה ב Ca2 +- ו מ"ג2 +ללא PBS לריכוז של 106 תאים / 30 μl.
- יש לתת משככי כאבים ולחטא את עור החיה (אופציונלי) עם חומר חיטוי מבוסס יוד או כלורקסידין. זה גם יעזור לוקליזציה של השרירים טיביאליס anterior (ת"א), gastrocnemius (GC), ו femoris quadriceps (QC; במיוחד את השרירים intermedius vastus).
- להזריק 30 μl של השעיית התא לתוך השרירים באמצעות מזרק עם 29 או 30 G מחט. עבור ת"א, הכנס 5 מ"מ של המחט 2 מ"מ מתחת להחדרת הגיד הפרוקסימלי (כיוון craniocaudal) עם נטייה של 15 מעלות יחסית השוקה ולהזריק לאט את השעיית התא תוך ביטול המחט (רוקן את המזרק עם 2 מ"מ של המחט עדיין בתוך השריר). עבור GC ו QC, לחזור על אותו הליך כמפורט עבור ת"א, עם ההבדל העיקרי להיות החדרה caudocranial של המחט 2 מ"מ מעל הצומת myotendinous של גיד אכילס עבור GC ו 2 מ"מ מעל הגיד הדיסטלי עבור QC (15 ° נטייה ביחס עצם הירך). שים לב בעת הסרת המחט מהשריר על מנת למנוע שפיכת השעיית התא דרך המסלול של המחט.
פתרון בעיות: במקרה של חריטה נמוכה לשקול הזרקת עכברים לנוער (1-2 שבועות)עכברים 7 עם 3 x 105 תאים / 10 μl (שים לב כי במקרה זה טמוקסיפן צריך להינתן תת עורית).
- השתלה תוך-עורקית
חלק זה של הפרוטוקול מאפשר הערכה של היכולת של MIDEMs ו HIDEMs להיות מועבר במחזור העורקים, לחצות את דופן הכלי ולתרום התחדשות שריר השלד בשרירים במורד הזרם לאתר ההזרקה.- טיפול בבעלי חיים ובתאים כמתואר לעיל בשלב 2.1.1.
- נתק על ידי טריפסיניזציה וסינון עם מסננת תאים 40 מיקרומטר (כדי להסיר אשכולות מהשעיית התא במקרה הלא סביר כי חשיפה לילה טמוקסיפן יכול לנהוג היתוך והיווצרות של myotubes מתאים סמוכים) לספור צנטריפוגה התאים ב 232 x g במשך 5 דקות
- לשטוף את גלולת התא Ca2+- ו מ"ג2 +ללא PBS, צנטריפוגה ולאחר מכן resuspend גלולה ב Ca2 +- ו מ"ג2 +ללא PBS עם 0.2 הבינלאומי
יחידות של נתרן הפרין (אופציונלי) לריכוז תאים סופי של 106 תאים / 50 μl. הוסף 10% צבע כחול פטנט (ריכוז סופי: 1.25 מ"ג / מ"ל מלוחים רגילים או Ca2 +- ו מ"ג2 +ללא PBS) לפתרון על מנת לדמיין את ההפצה של השעיית התא. - לנהל הרדמה ומשככי כאבים לעכבר על פי ההנחיות המסדירות הליכים כירורגיים במתקן החייתי המוסדי הספציפי.
- גילחו את האזור המפשעה (הידוע גם כמשולש הירך או הסקארפה) וחטאו את העור בחומר חיטוי מבוסס יוד או כלורקסידין.
- הפוך חתך 5-7 מ"מ ולמקם את צרור הירך: וריד, עורק ועצב (העצב שוכב לרוחב על העורק ואת הווריד בינוני).
- הסר בעדינות את הפאשיה המחברת המכסה את הצרור עם מלקחיים.
- להפריד את וריד הירך ואת העצב מן העורק על ידי בעדינות הצגת קצה של מלקחיים (או מחט 30 G) ביניהם ועל ידי הגדלה הדרגתית של החור.
פתרון בעיות: וריד הירך הוא שביר: לשים לב לא לצבוט אותו עם מלקחיים במהלך ניתוקו מעורק הירך. במקרה של דימום, לנקז את הדם עם גזה סטרילית ולהשתמש צורב מיקרו כדי להקל על hemostasis. - הרם את העורק עם קצה אחד של המלקחיים והדק את העורק בקצה השני.
- לנקב את העורק עם מזרק מצויד מחט 30 G. להזריק 50 μl של התא השעיה במורד הזרם של האזור מהודק, במהירות עירוי של כ 5 μl / שניה.
פתרון בעיות: בזהירות resuspend התאים במזרק לפני ההזרקה: חיוני כדי למנוע משקעים של תאים היווצרות בועת אוויר בתוך המזרק. קוטר עורק הירך קטן במקצת ממחט של 30 גרם: היזהרו לא לחתוך את העורק תוך החדרת המחט. צבע כחול פטנט מאפשר לזהות את האפקטיביות של הזריקה: אם מוזרק כראוי, האיבר כולו יהפוך במהירות כחול בהיר. - לאט להסיר את המחט ואת המלקחיים מן העורק כדי לשחזר את מחזור הדם באיבר.
- יש להפעיל לחץ באמצעות גזה סטרילית כדי למנוע דימום ו/או לצרוב כנדרש.
- לתפור את הפצע ולפקח על בעלי החיים עד התאוששות מהרדמה.
- לנהל משככי כאבים במשך 3 ימים ולבדוק את הפצע מדי יום (במקרה של זיהום בפצע לדון בכך עם אנשי מתקן בעלי חיים ולנהל אנטיביוטיקה כנדרש).
3. מדדי תוצאה על בעלי חיים דיסטרופיים מושתלים: בדיקת הליכון
החל משבועיים לאחר השתלת תאים, ניתן להעריך את ההשתלה התפקודית של הקיבולת המוטורית של עכברים מטופלים עם בדיקות ההליכון. בדיקה זו מאפשרת הערכה של סובלנות תרגיל / סיבולת של עכברים שטופלו. עכבר נחשב עייף כאשר שוכב באזור המנוחה במשך יותר מ 5 שניות, מבלי לנסות reengage ההליכון לאחר סדרה של 3 גירויים מכניים רצופים (אחד כל 5 שניות). מדידות בסיסיות מתחילות כחודש לפני הטיפול ומשמשות להערכת השיפור של כל בעל חיים שנבדק. בדיקה זו יכולה להיות מלווה במבחנים נוספים כדי לפקח על שבריריות סיבים, שיפור כוח, חריטה, בידול של תאים מושתלים, ו amelioration מורפולוגי של השרירים המושתלים (ראה דיון).
- התאקלמו בבעלי החיים (בדרך כלל שלוש קבוצות: פקדים מטופלים, לא מטופלים ופראיים/לא דיסטרופיים) לתרגיל לפני המדידה הראשונה: קבעו את ההליכון במהירות של 6 מ'/דקה למשך 10 דקות. חזור על ההליך כל יומיים במשך שבוע אחד.
פתרון בעיות: רשום את כל המדידות באותה שעה ביום כדי למנוע הטיות בשל המחזורים הביולוגיים. - מניחים את בעלי החיים לתוך ההליכון, אשר הוקם בעבר עם נטייה של 10 מעלות.
- הפעל את ההליכון, עם מהירות התחלתית של 6 מ '/ דקה (לספק גירוי מכני עדין במקרה בעלי החיים אינם מוכנים להתחיל את התרגיל).
- התחל את שעון העצר ולהגדיל את המהירות 2 מ '/ דקה כל 2 דקות.
- ברגע שבעל חיים שוכב באזור המנוחה במשך יותר מ -5 שניות מבלי לנסות להפעיל מחדש את ההליכון, לגעת בו בעדינות עם מקל כדי לעורר את ההפעלה מחדש של התרגיל (ראה לעיל).
- הקלט את הביצועים (זמן או מרחק) של כל בעל חיים.
- חזור על המדידות מדי שבוע או כל 10 ימים לפחות 3x.
- חזור על אותו הליך לאחר ההשתלה.
- נתח נתוני ביצועים המשווים את המדידה של כל בעל חיים לביצועים הבסיסיים שלו. אנו מציעים להתוות את הערכים בגרף כאחוז מהקיבולת המוטורית הממוצעת ביחס לקו הבסיס ולנתח אותם באמצעות בדיקת ANOVA חד-כיוונית או דו-כיוונית ואחריה מבחן שלאחר הבדיקה המתאים להשוואת הקבוצות.
פתרון בעיות: השתמש במינימום של 5 בעלי חיים/קבוצה תואמי גנוטיפ ומין וחזור על המדידות לפחות 3x לאחר ההשתלה.
4. הערכת חריטה של תאים ובידול בשרירים מושתלים
שרירי השתלה ובקרה נקצרים בנקודת הזמן המתאימה (<2 ימים לניתוח חריטה לטווח קצר, 2-3 שבועות לאמצע טווח ו >1 חודש לניתוח ארוך טווח). אם התאים המושתלים מסומנים ב- GFP, ניתן להעריך את החריטה בשרירים מבודדים טריים על ידי פלואורסצנטיות ישירה תחת סטריאומיקרוסקופ המצויד ב- UV.
- שכב והתמצאות לאורך הציר האנכי שרירים מבודדים טריים מסטיק tragachanth (6% w / v)
- לייבש את הדגימות איזופנטאן prechilled במשך דקה אחת, להקפיא אותם חנקן נוזלי לפחות 2 דקות ומניחים אותם מיד ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
- לעבד את הדגימות עם cryostat כדי לקבל 7 μm קטעים עבים על שקופיות מקוטבות. דגימת רוב השריר על השקופיות, איסוף כ 8-10 שקופיות עם 30-40 מקטעים / שקופית. מומלץ לאסוף סדרה של חלקים לתוך צינור 1.5 מ"ל לבצע ביולוגיה מולקולרית / ביוכימיה מבחנים.
- להעריך חריטה של תאים עם כתמים immunofluorescent שונים, בהתאם ההתקנה הניסיונית. לדוגמה, במקרה של השתלת HIDEM בעכברים Sgca-null/scid/bg, קטעי כתמים עם: א) נוגדן נגד Lamin A/C כדי לזהות גרעיני תאים אנושיים מושתלים; ב) נוגדן נגד למינין כדי לדמיין את המבנה הכולל של השריר; ו-ג) נוגדן נגד Sgca לגילוי שיקום החלבון הנגרם על ידי תורמים הנעדרים בחיה הדיסטרופית.
- לכמת, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, את מספר גרעיני התורם לכל מקטע שריר בתוך ומחוץ סיבי שריר ומספר myofibers השלד שמקורו תורם לכל סעיף.
5. היסטופתולוגיה של השרירים
ניתוחים היסטופטולוגיים מאפשרים הערכה של המבנה המורפולוגי של השריר המושתל. שיפור אדריכלי במבנה הרקמה צפוי כתוצאה של גישת הטיפול בתאים.
- תקן את השרירים המבודדים טריים עם 4% paraformaldehyde במשך 1 שעה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לייבש את הדגימות עם שיפוע סוכרוז עולה(למשל 7.5-15-30% w / v).
- השאירו את השרירים לילה בתמיסת סוכרוז הגבוהה ביותר.
- להטביע את הדגימות ברקמה Tek OCT, למקם אותם איזופנטאן prechilled עד OCT הופך מוצק (הימנעות טבילה מלאה של הדגימות), להקפיא אותם חנקן נוזלי לפחות 2 דקות ומניחים אותם מיד ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון.
- לעבד את הדגימות עם cryostat כדי לקבל 7 μm קטעים עבים כמתואר לעיל.
- הכתים את החלקים עם המטוקסילין ואאוסין או טריקרום של מאסון על פי פרוטוקולי היצרן הסטנדרטיים.
כתמי המטוקסילין ואאוסין מאפשרים לחשב סימני ההיכר של השריר המתחדש, כגון: א) מספר המופיברים; ב) אזור חתך רוחב; ג) מספר המיסטיברים המכילים גרעין מרכזי. טריכרום של Masson משמש לחישוב המדד הפיברוטי, נעשה על ידי חיסור השטח הכולל שנכבש על ידי myofibers השלד מן השטח הכולל של התמונה: האזור וכתוצאה מכך משקף בעיקר את חדירת החיבור והשומן של השריר. כל הניתוחים על התמונות יכול להתבצע באמצעות תוכנת ImageJ (NIH) עם כלי המדידה ותוסף מונה התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות הייצוגיות המדווחות עוקבות אחר הבדיקות העיקריות במבחנה/in vivo המתוארות בזרימת העבודה באיור 1. 48 שעות לאחר ניהול 4OH-טמוקסיפן גרעינים חיוביים MyoD ניתנים לזיהוי בתוך MYoD-ER transduced IDEMs בתרבות (איור 2A). לאחר מכן התאים מתמזגים ומבדילים לתוך מיוטובים רב-גרעיניים (איור 2B). כאשר מושתלים תוך שרירית במודל מורין של פגיעה חריפה בשרירים, IDEMs תורמים להתחדשות רקמות (איור 3). היעילות של IDEMs בסביבה של ריפוי בגנים ובתאים עבור מודלים מוריניים של ניוון שרירים הוערכה על ידי בדיקת הסובלנות של תרגיל ההליכון: איור 4 מראה את התוצאות המתקבלות לאחר השתלת MIDEMs מסוג בר לעכברים מסוג Sgca-null/scid/beige, המציגים שיפור של הקיבולת המוטורית בעכברים מטופלים7. ניתוחי Ex vivo של שרירים מושתלים מראים אזורים חיוביים GFP המייצגים את היקף הקולוניזציה של IDEMs לתוך הרקמה המארחת (איורים 5A-C), ובכך להוכיח כי תאים תורמים לחרוט לתוך שריר דיסטרופי. חשוב לציין, תאים מושתלים מסוגלים להבדיל vivo, יצירת myofibers השלד החדש. ואכן איור 5 מראה ביטוי Sgca מ HIDEMs מתוקנים גנטית לעכברים Sgca-null /scid/בז ' (איורים 5D ו 5E). שיפור מבני בארכיטקטורה של השרירים המושתלים ניתן להעריך באמצעות כתמי טריכרום של מאסון: איור 5F מראה ירידה בכמות הרקמה הסיבית בשריר המטופל.
איור 1. תרשים זרימת פרוטוקול. התוכנית מספקת סקירה של האסטרטגיה מבוססת IDEM, החל מבחני התמיינות במבחנה ראשונית (משמאל) ועד לשלבים השונים הדרושים להערכת חריטה, פוטנציאל מיוגני ואמליוציה תפקודית ב- vivo ו- ex vivo (מימין). קופסאות אפורות כהות מכילות את השלבים השונים המתוארים בפרוטוקול; תיבות אפורות בהירות מכילות חלקים מהשיטה שאינם מפורטים במאמר זה. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
איור 2. הערכה של פוטנציאל מיוגני במבחנה. (א) אימונופלואורסצנטיות מראה ביטוי MyoD גרעיני ב 4 מתוך 7 MyoD-ER transduced גרעיני MIDEM לאחר 48 שעות של חשיפה 4OH-טמוקסיפן. (ב) כתמי כשל חיסוני עבור שרשרת כבדה מיוסין (MyHC) על 4OH-טמוקסיפן-induced HIDEM-induced MYotubes לאחר שבוע במדיום בידול (סרגל סולם, 200 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
איור 3. להערכת vivo של חריטה של תאים במודל של התחדשות שרירים חריפה. (א) תמונות פלואורסצנטיות של פלואורסצנטיות סטריאומיקרוסקופית של שרירים קרדיו-רעילים טריים שנפצעו בשוקה, שהוסברו שבועיים לאחר הזרקה תוך שרירית של 106 GFP-HIDEMs (משמאל) ו- GFP-MIDEMs (במרכז). סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. (B) נמוך (למעלה) וגבוה (למטה) תמונות הגדלה של השריר מושתל עם MIDEMs המוצגים (A) המציגים myofibers חיובי GFP. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
איור 4. מבחן סובלנות תרגיל הליכון. בדיקת הליכון מייצגת להשתלה (IM = תוך שרירית; IA = תוך עורקי). עכברי Sgca-null/scid/בז' (106 תאים/הזרקה) לעומת עכברים חיסוניים לא נטרופיים ובקרה לא סטרואידית. העלילה מראה תפקוד של עכברים דיסטרופיים מושתלים עם MIDEMs (12-22% יותר מבעלי חיים לא משוילים 35 ימים לאחר ההשתלה). הנתונים מוצגים כקיבולת מוטורית ממוצעת ביחס לביצועים בסיסיים(כלומר 100% מייצגים את הביצועים הבסיסיים של כל קבוצה ורק עכברים מטופלים משפרים אותה באופן משמעותי במדידות חוזרות). *P < 0.05; **P < 0.005, לכיוון אחד ANOVA. מתוך עבודה שפורסמה בעבר של המחברים7. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
איור 5. בהערכת vivo של חריטה ופוטנציאל מיוגני במודלים העכבר של ניוון שרירים. (א) תמונות פלואורסצנטיות של פלואורסצנטיות של פלואורסצנטיות של טיביאליס מבודדים טריים של עכברי Sgca-null/scid/beige מוסברים 3-4 שבועות לאחר הזרקה תוך שרירית של 106 בני אדם (HIDEMs, שמאל; השתלה בעכברים צעירים) ומורין (MIDEMs; ימין) GFP-IDEMs. סרגל קנה מידה, 2 מ"מ. (B) תמונת פלואורסצנטיות GFP סטריאומיקרוסקופית של שריר gastrocnemius מבודד טרי explanted 3 שבועות לאחר הזרקה תוך עורקית של 106 GFP-MIDEMs. סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. (C) חלק רוחבי קפוא טרי של השריר מושתל עם MIDEMs המוצגים (A) המציגים מקבץ של myofibers חיובי GFP. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. (ד) כתמי שפעת אימונופלואורסצנטיים על קטעים של שרירים מושתלים תוך-שריריים (כמו ב- A)המראים אשכולות של סיבים מתוקנים גנטית, שמקורם ב- IDEMs מושתלים. סרגל קנה מידה, 150 מיקרומטר. (ה) כימות של α סרקוגליקן (Sgca) חיובי myofibers חודש לאחר השתלת תוך שרירית של IDEMs מתוקן גנטית לתוך Sgca-null / scid / בז 'עכברים. (ו) מאסון טריכרום מכתים את השרירים השריריים של טיביאליס מעכברים מושתלים ושולטים בעכברים מסוג Sgca-null/scid/beige (אדום: סיבי שריר; כחול: פיברוזיס) המדגישים את הפחתת הסתננות הסיבית בשריר המטופל. סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג איור גדול יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs ניתן להרחיב ללא הגבלת זמן תוך שמירה על פוטנציאל ההתחדשות העצמית שלהם ובכך להיות מופנה להבדיל למגוון רחב של שושלת התא12. מסיבות אלה ואחרות תאי גזע/אב שמקורם ב- iPSC נחשבים למקור מבטיח לטיפול אוטולוגי בגנים ובתאים מתקרבל -13. עבודה שפורסמה בעבר מן המחברים דיווחה על הדור של עכברים ואבים מיוגניים אנושיים מ- iPSCs עם פנוטיפ דומה לזה של MABs נגזר pericyte (IDEMs) ואת תרומתם היעילה התחדשות שרירים במודל העכבר של ניוון שרירים7.
תנאי מוקדם כדי למקסם את הפוטנציאל המיוגני IDEM הוא הביטוי של הגורם המיוגני MyoD בתאים. הטרנסדוקציה עם קלטת MyoD-ER בלתי ניתנת להעברה של טמוקסיפן אפשרה שליטה זמנית מדויקת על הביטוי שלה עם היתרון של סנכרון ההפעלה שלה בתרבות כולה ולאחר מכן vivo. אסטרטגיה השתלה המבוססת על ממשל יחיד של תאים לכל שריר (או לכל עורק הירך) תואר במאמר זה. עם זאת, זריקות תאים חוזרות ונשנות הוכחו כיעילות בהגדלת תחריט MAB בפרוטוקולים שונים של טיפול בתאים8. לכן, במקרה של תוצאות תת אופטימליות עם IDEMs, כדאי לבצע השתלות חוזרות ונשנות כדי להגדיל את המינון של התא ומכאן, תרומה שריר המארח.
מדידות תוצאות מאפשרות הערכה של תרומתם של תאים תורמים בשיפור תפקודי של פנוטיפ של בעלי חיים מטופלים. בנוסף לבדיקת סובלנות/סיבולת התרגיל המבוצעת עם ההליכון, בדיקות נוספות לניתוח יכולת מוטורית מרצון(למשל בדיקת גלגל חופשי), שבריריות סיבים(למשל אוונס כחול ספיגת צבע asssay) וכוח ספציפי (למשל סיבים בודדים או מכניקת שרירים שלמה) יכול להיחשב8. שיטות נוספות לבדיקת אמליוציה פנוטיפית תפקודית זמינות כהליכי הפעלה סטנדרטיים באתר האינטרנט של Treat-NMD (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
כדי לאסוף מידע משמעותי מבעלי החיים המושתלים, יש לעקוב אחר ההשתלה התפקודית ולאמת אותה על ידי ניתוחים אימונוהיסטוכימיים והיסטולוגיים, כדי להעריך חריטה של תאים וארכיטקטורת רקמות/ שיפוץ. בפרט, חשוב להעריך את המבנה המורפומטרי של השרירים המושתלים עבור סימני ההיכר של התחדשות ופיברוזיס, כגון הערכת מספר הסיבים עם גרעין מרכזי, אזור חתך myofibers ואת האינדקס הסיבי. הניתוחים האחרונים, יחד עם התוצאות הפונקציונליות, נותנים סקירה ממצה על האפקטיביות של האסטרטגיה. יתר על כן, ניטור השושלת שאומצה על ידי תאים מושתלים במונחים של תרומה לרקמה(כלומר myofibers) ותחזוקה של תא תאי הגזע חשוב עבור היעילות לטווח ארוך של כל אסטרטגיות הטיפול בתאים. במקרה זה, זה כבר דווח על תרומת התורם נגזר vivo לתא pericyte שממנו mesoangioblasts נגזרים7; בנוסף, תוצאות ראשוניות מצביעות על תרומה תפקודית מ- IDEMs גם למאגר תאי הלוויין (Gerli ו- Tedesco, תוצאות שלא פורסמו). ניתוחים מולקולריים להדגמת חריטה וביטוי של הגן המתוקן(כלומר PCR כמותי וכתם מערבי) הם גם קריטיים, אך הם מעבר להיקף של נייר זה וידרשו מאמר ייעודי.
למרות פרוטוקול זה פותחה בעיקר ניצול Sgca-null / scid / בז 'עכברים7 (מודל immunodeficient שפורסם לאחרונה של LGMD2D), צפוי כי זה יכול להיות ישים בקלות מודלים אחרים של מחלת שרירים. במקרה של Sgca-null / scid / בז ', עכברים לא השתמשנו אירובי, שכן השרירים של בעלי חיים אלה נפגעים קשות וכפופים כרונית ניוון מחזורי התחדשות (ולכן נזק נוסף של אירובי אינו הכרחי). עם זאת, לא יכולנו לשלול כי טיפול מקדים עם אירוטוקסין יכול להקל על חריטה במודלים מתונים יותר של ניוון שרירים(למשל עכברי mdx). Ameliorations של האסטרטגיה שלנו עשוי לכלול שיטות כדי לשפר את הכשל החיסוני של מארח העכבר (אשר במודלים הנוכחיים הוא עדיין suboptimal) ואת היעילות של תחריט התא התורם, במיוחד על אספקה תוך עורקית של תאים קסנוגניים. למרות השתלת תאים מרובים ושימוש בעכברים צעירים לתרום לעלייה תחריט התא7,8, מולקולות הידבקות העכבר נתקל על ידי תאים אנושיים במהלך פזרנות ו / או הגירה עלול להוות משוכות נוספות לכשל החיסוני המוגבל של המודלים הנוכחיים. כיוונים עתידיים לתרגום גישה זו של ריפוי בגנים ובתאים בסביבה קלינית עשויים לכלול אסטרטגיות פרמקולוגיות לשיפור פזרנות התאים ושימוש בווקטורים לא-משתקים(למשל פלסמידים, mRNAs, כרומוזומים מלאכותיים אנושיים, או וקטורים ויראליים שאינם מתורגמים) כדי לתכנת מחדש ולתקן גנטית את התאים, ובכך למנוע את הסיכון להחדרת מוטגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. הגישה בקשה בינלאומית לפטנט (לא. PCT/GB2013/050112) כולל חלק מהאסטרטגיה המתוארת במאמר זה. הוא קיבל מימון מחברת פרומימטיק ו-DWC בע"מ עבור מחקרו.
Acknowledgments
המחברים מודים לג'וליו קוסו, מרטינה רגאזי ולכל המעבדה על דיון ותמיכה מועילים, וג'ף צ'מברליין על שסיפק בחביבות וקטור MyoD-ER. כל הניסויים בבעלי חיים חיים הושלמו בהתאם לעמידה בכל הגופים הרגולטוריים והמוסדיים הרלוונטיים, תקנות והנחיות. העבודה במעבדת המחברים נתמכת על ידי המועצה למחקר רפואי בבריטניה, הקהילה האירופית 7 פרויקטים Optistem ו Biodesign ופרויקט ההורה האיטלקי דושן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
