Summary
Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-progenitores miógenos derivados son candidatos prometedores para las estrategias de terapia celular para tratar las distrofias musculares. Este protocolo describe el trasplante y las medidas funcionales necesarias para evaluar el injerto y la diferenciación de mesoangioblastos derivados de iPSC (un tipo de progenitores musculares) en modelos de ratón de regeneración muscular aguda y crónica.
Abstract
los iPSCs Paciente-derivados podían ser una fuente inestimable de células para los protocolos autólogos futuros de la terapia celular. Las células madre/progenitoras miógenas derivadas de iPSC similares a los mesoangioblastos derivados del pericito (células madre/progenitoras similares a mesoangioblastos derivadas de iPSC: IDEMs) se pueden establecer a partir de iPSCs generadas a partir de pacientes afectados por diferentes formas de distrofia muscular. Los IDEM específicos del paciente pueden corregirse genéticamente con diferentes estrategias(por ejemplo, vectores lentivirales, cromosomas artificiales humanos) y mejorarse en su potencial de diferenciación miogénica tras la sobreexpresión del regulador de la miogénesis MyoD. Este potencial miógeno se evalúa in vitro con ensayos específicos de diferenciación y se analiza por inmunofluorescencia. El potencial regenerativo de IDEMs se evalúa más a fondo in vivo,sobre el trasplante intramuscular e intrarterial en dos modelos representativos del ratón que exhiben la regeneración aguda y crónica del músculo. La contribución de idems al músculo esquelético del anfitrión entonces es confirmada por diversas pruebas funcionales en ratones trasplantados. En particular, el mejoramiento de la capacidad motora de los animales se estudia con pruebas en cinta de correr. El engraftment y la diferenciación de la célula entonces son evaluados por un número de análisis histológicos y de la inmunofluorescencia en los músculos trasplantados. En general, este trabajo describe los ensayos y herramientas utilizados actualmente para evaluar la capacidad de diferenciación de los IDEMs, centrándose en los métodos de trasplante y las medidas de resultado posteriores para analizar la eficacia del trasplante de células.
Introduction
Los mesoangioblastos (MABs) son progenitores musculares asociados a vasos derivados de un subconjunto de pericitos1-3. La principal ventaja de los MABs sobre los progenitores musculares canónicos, como las células satélite4, reside en su capacidad para cruzar la pared del vaso cuando se entregan intraarteriales y, por lo tanto, contribuir a la regeneración del músculo esquelético en los protocolos de terapia celular. Esta característica ha sido evaluada y confirmada tanto en modelos murinos como caninos de distrofia muscular1,5,6. Estos estudios preclínicos han sentado las bases para un primer ensayo clínico de fase I/II basado en el trasplante intraarterial de MABs HLA-idénticos al donante en niños con distrofia muscular de Duchenne (EudraCT no. 2011-000176-33; actualmente en curso en el Hospital San Raffaele de Milán, Italia). Uno de los principales obstáculos de los enfoques de terapia celular, en los que se necesitan miles de millones de células para tratar el músculo de todo un cuerpo, es el limitado potencial proliferativo del "medicamento" (las células). Por otra parte se ha demostrado recientemente que no es posible obtener MABs de pacientes afectados por algunas formas de distrofias musculares, pues ocurre en la distrofia muscular 2D de la miembro-faja (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Para superar estas limitaciones, recientemente se ha establecido un protocolo para derivar células madre/progenitoras similares al MAB a partir de iPSCs humanas y murinas7. Este procedimiento genera poblaciones celulares fácilmente expandibles con una firma de genes vasculares e inmunofenotipos altamente similares a los MABs derivados del músculo adulto. Tras la expresión del factor regulador miogénico MyoD, tanto murino como humano IDEMs (respectivamente MIDEMs y HIDEMs) experimentan diferenciación terminal del músculo esquelético. Para lograr este objetivo, los IDEMs pueden ser transducidos con vectores capaces de impulsar la expresión de MyoD, ya sea de forma constitutiva o inducible8-10. Se utiliza un vector lentiviral que contiene AdNc MyoD fusionado con el receptor de estrógeno (MyoD-ER), lo que permite su translocación nuclear tras la administración de tamoxifeno (un análogo del estrógeno)11. Esta estrategia resulta en la formación de miotubos multinucleados hipertróficos, con alta eficiencia7. En particular, los IDEM son notumorigenic, pueden engraft y diferenciar dentro de los músculos del anfitrión sobre el trasplante y se pueden corregir genético usando diversos vectores(e.g. lentiviruses o cromosomas artificiales humanos), allanando el camino para las estrategias terapéuticas autólogas futuras. La derivación, caracterización y trasplante de IDEMs han sido descritos en la publicación anterior7. Este papel del protocolo detalla los análisis realizados para evaluar la diferenciación miógena in vitro de IDEMs y las medidas subsecuentes del resultado para probar la eficacia de su trasplante en los modelos del ratón de la regeneración del músculo.
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Protocol
1. Evaluación del potencial miogénico y de injerto
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In vitro: Diferenciación inducida por MyoD
- Generar una línea celular estable de IDEMs transducidos con el vector lentiviral Tamoxifeno-inducible MyoD-ER, titulando la multiplicidad de infección (MOI; por ejemplo, 1, 5 y 50) utilizando la tinción descrita en 1.1.9 (MyHC) como resultado de la eficiencia del procedimiento.
- Recubrir un plato de 3,5 cm con 1 ml de Matrigel al 1% e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Lavar el plato dos veces con la semilla mediana 1 x 105 IDEMs transducidas MyoD-ER en el plato de cultivo de tejidos de 3,5 cm e incubar a 37 °C en medio de crecimiento.
- Espere que las células alcancen la confluencia en uno o dos días y luego agregue 1 μM de 4OH-tamoxifeno en el medio de crecimiento(1ª dosis).
- Después de 24 horas, reemplace el medio de crecimiento con un medio de diferenciación complementado con 1 μM de 4OH-tamoxifeno(2ª y última dosis).
- Reemplace la mitad del medio con un medio de diferenciación fresco cada dos días.
- Examine diariamente las culturas para la formación del myotube.
- Después de una semana (5 días en medio de diferenciación), lavar las placas suavemente con PBS y fijar con paraformadehído al 4 % durante 5 min en RT.
- Realizar una tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos contra la miosina de cadena pesada (MyHC) para confirmar la presencia de miotubos. Counterstain con un tinte nuclear(e.g. Hoechst).
La eficiencia de la diferenciación se evalúa como el porcentaje de núcleos dentro de las células MyHC-positivas: proceder al siguiente paso si la eficiencia es de >50%.
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In vivo: engraftment en un modelo de regeneración muscular aguda
Para evaluar la contribución in vivo de MyoD-ER IDEMs a la regeneración muscular, las células se etiquetan previamente con un vector que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) que permitirá rastrearlos dentro del tejido. Los IDEM de GFP de MyoD-ER se inyectan en los músculos murinos adultos, previamente lesionados con una miotoxina(por ejemplo, cardiotoxina). Para evitar el rechazo inmune contra xenogeneic (tal como HIDEMs) o las células genético manipuladas/corregidas se requiere utilizar ratones inmunodeficientes o immunosuppressed.- Pretratar a los animales con una inyección intraperitoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml de tamoxifeno (forma liposoluble) 24 horas antes del trasplante y pretratar las células añadiendo 1 μM de 4OH-tamoxifeno (forma acuosa) en el medio de crecimiento durante la noche antes del día del trasplante.
- Administrar anestesia y analgesia al ratón siguiendo las pautas específicas que regulan los procedimientos quirúrgicos en el centro animal.
- Inyectar 25 μl de cardiotoxina de 100 μM (CTX; de Naja mossambica mossambica; PRECAUCIÓN: sustancia potencialmente dañina) en los músculos tibiales anteriores (TA).
- 24 horas después de tratar a los animales con tamoxifeno y CTX, separar las células por tripsinización y recuento.
- Centrifugar las células a 232 x g durante 5 min.
- Lave el pellet celular en PbS libre de Ca2+y Mg2+,centrífuga y luego resuspense suavemente el pellet celular en Ca2+- y PBS libre de Mg2+a una concentración final de 106 células/30 μl, que será el volumen final de cada inyección.
- Inyecte 30 μl de suspensión celular en los músculos previamente lesionados usando una jeringa con aguja de 29 o 30 G. Preste especial atención al retirar la aguja del músculo. Hágalo lentamente, evitando derramar la suspensión celular a través de la pista de la aguja. No trasplantar la AT contralateral y utilizarla como control, inyectando 30 μl de PBS libre de Ca2+y Mg2+para replicar las condiciones del trasplantado.
- Trate a los animales con tamoxifeno durante seis días adicionales y administre analgesia(por ejemplo, carprofeno) durante dos días adicionales.
- Explantar los músculos a partir de 14 días después del trasplante. Procesar y analizar las muestras como se detalla en los Protocolos 4 y 5.
2. Trasplante en modelos de ratón de distrofia muscular
Este ensayo de trasplante permite evaluar la extensión del injerto de IDEMs en modelos mural de distrofia muscular. Los animales, tratados de la siguiente manera, también pueden ser evaluados para el mejoramiento funcional del fenotipo de la enfermedad. Las pruebas funcionales se pueden realizar a partir de dos semanas después del trasplante. Con el fin de mejorar el injerto considere la realización de ejercicios pretrasplante en cinta (como se describe en el Protocolo 3) y / o inyecciones de células en serie cada tres semanas para 3x(es decir, para un total de 3 inyecciones / músculo).
- Trasplante intramuscular
- Pretratar a los animales con una inyección intraperitoneal de 3,5 μl/g de 10 mg/ml de tamoxifeno (formulación liposoluble) 24 horas antes del trasplante y pretratar las células añadiendo 1 μM de 4OH-tamoxifeno (formulación acuosa) en el medio de crecimiento durante la noche antes del día del trasplante.
- Separar por tripsinización, contar y centrifugar las células a 232 x g durante 5 min.
- Lavar el pellet celular en Ca2+- y Mg2+- PBS libre, centrífuga y luego resuspend el pellet en Ca2 +- y Mg2 +- PBS libre a una concentración de 106 células / 30 μl.
- Administrar analgesia y desinfectar la piel del animal (opcional) con un desinfectante a base de povidona yodada o clorexidina. Esto también ayudará a localizar los músculos tibiales anteriores (TA), gastrocnemios (GC) y cuádriceps femorales (QC; específicamente el vasto intermedius).
- Inyecte 30 μl de suspensión celular en los músculos usando una jeringa con aguja de 29 o 30 G. Para la AT, inserte 5 mm de la aguja 2 mm por debajo de la inserción del tendón proximal (dirección craneocaudal) con una inclinación de 15° en relación con la tibia e inyecte lentamente la suspensión celular mientras retrae la aguja (vacíe la jeringa con 2 mm de la aguja todavía dentro del músculo). Para el GC y el QC, repita el mismo procedimiento que se detalla para el TA, siendo la principal diferencia la inserción caudocranial de la aguja 2 mm por encima de la unión miotendinosa del tendón de Aquiles para el GC y 2 mm por encima del tendón distal para el QC (inclinación de 15° con respecto al fémur). Preste atención al retirar la aguja del músculo para evitar derramar la suspensión celular a través de la pista de la aguja.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: En caso de bajo injerto, considere la inyección de ratones juveniles (1-2 semanas de edad)7 con 3 x 105 células / 10 μl (tenga en cuenta que en este caso el tamoxifeno debe administrarse por vía subcutánea).
- Trasplante intrarterial
Esta parte del protocolo permite evaluar la capacidad de los MIDEMs y HIDEMs para ser entregados en la circulación arterial, cruzar la pared del vaso y contribuir a la regeneración del músculo esquelético en los músculos aguas abajo hasta el sitio de inyección.- Pretrabate a los animales y las células descritos anteriormente en el paso 2.1.1.
- Separar por tripsinización y filtro con un colador celular de 40 μm (para eliminar los grupos de la suspensión celular en el improbable caso de que la exposición nocturna al tamoxifeno pudiera impulsar la fusión y formación de miotubos de células adyacentes) contar y centrifugar las células a 232 x g durante 5 min
- Lavar el pellet celular en Ca2+- y Mg2+- PBS libre, centrífuga y luego resuspend el pellet en Ca2 +- y Mg2 +- PBS libre con 0.2 Internacional
Unidades de heparina sódica (opcional) a una concentración celular final de 106 células/50 μl. Añadir 10% de colorante azul patente (concentración final: 1,25 mg/ml en solución salina normal o Ca2+- y Mg2+- PBS libre) a la solución con el fin de visualizar la distribución de la suspensión celular. - Administrar anestesia y analgesia al ratón de acuerdo con las directrices que regulan los procedimientos quirúrgicos en el centro animal institucional específico.
- Afeitarse la región inguinal (también conocido como femoral o triángulo de Scarpa) y desinfectar la piel con un desinfectante a base de povidona yodada o clorhexidina.
- Haga una incisión de 5-7 mm y localice el haz femoral: vena, arteria y nervio (el nervio se coloca lateralmente a la arteria y la vena medialmente).
- Retire suavemente la fascia conectiva que cubre el haz con las fuerzas.
- Separe la vena femoral y el nervio de la arteria introduciendo suavemente la punta de un fórceps (o una aguja de 30 G) entre ellos y ampliando progresivamente el agujero.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: La vena femoral es frágil: preste atención a no pellizcarla con el fórceps durante su desprendimiento de la arteria femoral. En caso de hemorragia, drene la sangre con gasa estéril y use un micro cauterizador para facilitar la hemostasia. - Levante la arteria con una punta de las pinzas y sujete la arteria con la otra punta.
- Perfore la arteria con una jeringa equipada con una aguja de 30 G. Inyecte 50 μl de suspensión celular aguas abajo del área sujetada, a una velocidad de infusión de aproximadamente 5 μl/seg.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: Resuspend cuidadosamente las células en la jeringa antes de la inyección: es vital evitar la precipitación de las células y la formación de burbujas de aire dentro de la jeringa. El diámetro de la arteria femoral es ligeramente menor que una aguja de 30 G: tenga cuidado de no truncar la arteria mientras inserta la aguja. El tinte azul patente permite reconocer la efectividad de la inyección: si se inyecta correctamente, toda la extremidad se volverá rápidamente azul claro. - Retire lentamente la aguja y los pinzas de la arteria para restaurar el torrente sanguíneo en la extremidad.
- Aplique presión con gasa estéril para evitar sangrado y/o cauterizar según sea necesario.
- Suturar la herida y vigilar a los animales hasta la recuperación de la anestesia.
- Administre la analgesia por 3 días e inspeccione la herida diariamente (en caso de la infección de la herida discuta esto con el personal animal de la instalación y administre los antibióticos según lo requerido).
3. Medidas de resultado en animales distróficos trasplantados: Prueba de cinta de correr
A partir de dos semanas después del trasplante de células, es posible evaluar el mejoramiento funcional de la capacidad motora de los ratones tratados con las pruebas de cinta de correr. Esta prueba permite la evaluación de la tolerancia al ejercicio /resistencia de los ratones tratados. Un ratón se considera fatigado cuando se pone en el área de descanso durante más de 5 segundos, sin intentar volver a enganchar la cinta de correr después de una serie de 3 estímulos mecánicos consecutivos (uno cada 5 segundos). Las mediciones basales comienzan aproximadamente un mes antes del tratamiento y se utilizan para evaluar la mejoría de cada animal probado. Esta prueba puede ir seguida de ensayos adicionales para controlar la fragilidad de la fibra, la mejora de la fuerza, el injerto, la diferenciación de las células trasplantadas y el mejoramiento morfológico de los músculos trasplantados (consulte Discusión).
- Aclimatar a los animales (generalmente tres grupos: tratados, no tratados y de tipo salvaje/ controles no distróficos) al ejercicio antes de la primera medición: establecer la cinta de correr a una velocidad de 6 m/min durante 10 min. Repita el procedimiento cada dos días durante una semana.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: Registre todas las mediciones a la misma hora del día para evitar sesgos debido a los ciclos circadianos. - Coloque los animales en la cinta de correr, que se ha configurado previamente con una inclinación de 10 °.
- Encienda la cinta de correr, con una velocidad de arranque de 6 m/min (proporcione un estímulo mecánico suave en caso de que los animales no estén dispuestos a comenzar el ejercicio).
- Inicie el temporizador y aumente la velocidad 2 m/min cada 2 min.
- Tan pronto como un animal se acueste en el área de descanso durante más de 5 segundos sin intentar volver a enganchar la cinta de correr, tóquelo suavemente con un palo para estimular el reinicio del ejercicio (ver arriba).
- Registrar el rendimiento (tiempo y/o distancia) de cada animal.
- Repita las mediciones semanalmente o cada 10 días durante al menos 3 veces.
- Repita el mismo procedimiento después del trasplante.
- Analizar los datos de rendimiento comparando la medición de cada animal con su rendimiento basal. Sugerimos trazar los valores en un gráfico como un porcentaje de la capacidad motora promedio en relación con la línea de base y analizarlos mediante una prueba de ANOVA de una o dos vías seguida de una prueba posterior apropiada para comparar los grupos.
SOLUCIÓN DE PROBLEMAS: use un mínimo de 5 animales/grupos de edad, genotipo y sexo y repita las mediciones durante al menos 3 veces después del trasplante.
4. Evaluación Del Injerto Celular Y Diferenciación En Los Músculos Trasplantados
Los músculos trasplantados y de control se cosechan en el momento adecuado (<2 días para el análisis de injerto a corto plazo, 2-3 semanas para el análisis a medio plazo y >1 mes para el análisis a largo plazo). Si las células trasplantadas se etiquetan con GFP, el injerto en músculos recién aislados se puede evaluar por fluorescencia directa bajo un estereomicroscopio equipado con UV.
- Lay y orientar a lo largo del eje vertical músculos recién aislados en la goma tragachanth (6% p/v)
- Deshidratar las muestras en isopentano prechilled durante un minuto, congelarlas en nitrógeno líquido durante al menos 2 min y colocarlas inmediatamente a -80 °C para su almacenamiento.
- Procese las muestras con un criostato para obtener secciones de 7 μm de espesor en portaobjetos polarizados. Muestree la mayoría del músculo en los portaobjetos, recogiendo aproximadamente 8-10 diapositivas con 30-40 secciones / diapositiva. Es recomendable recoger una serie de secciones en un tubo de 1,5 ml para realizar ensayos de biología molecular/bioquímica.
- Evalúe el injerto celular con diferentes tinciones inmunofluorescentes, dependiendo de la configuración experimental. Por ejemplo, en caso de trasplante HIDEM en ratones Sgca-null/scid/bg, manche secciones con: a) un anticuerpo contra Lamin A/C para detectar núcleos de células humanas injertada; b) un anticuerpo contra Laminina para visualizar la estructura general del músculo; y c) un anticuerpo contra Sgca para detectar la restauración donante-derivada de la proteína ausente en el animal distrófico.
- Cuantifique, usando un microscopio de fluorescencia, el número de núcleos donantes por sección muscular dentro y fuera de las fibras musculares y el número de miofiberos esqueléticos derivados de donantes por sección.
5. Histopatología muscular
Los análisis histopatológicos permiten la evaluación de la estructura morfológica del músculo trasplantado. La mejora arquitectónica en la estructura del tejido se espera como resultado del acercamiento de la terapia celular.
- Fije los músculos recién aislados con paraformadehído al 4% durante 1 hora a 4 °C.
- Deshidratar las muestras con un gradiente ascendente de sacarosa(por ejemplo, 7,5-15-30% p/v).
- Deje los músculos durante la noche en la solución de sacarosa más alta.
- Incruste las muestras en Tissue Tek OCT, colóquelas en isopentano prechilled hasta que la OCT se vuelva sólida (evitando la inmersión completa de las muestras), congele en nitrógeno líquido durante al menos 2 min y colóquelas inmediatamente a -80 °C para su almacenamiento.
- Procese las muestras con un criostato para obtener secciones de 7 μm de espesor como se describió anteriormente.
- Manche las secciones con hematoxilina y eosina o tricromo de Masson de acuerdo con los protocolos estándar del fabricante.
La tinción de hematoxilina y eosina permite calcular los sellos distintivos de la regeneración muscular, tales como: a) el número de miofiberos; b) área de sección transversal; c) el número de miofiberos que contienen un núcleo central. El tricromo de Masson se utiliza para calcular el índice fibrótico, haciendo restando el área total ocupada por los miofiberos esqueléticos del área total de la imagen: el área resultante refleja principalmente el infiltrado conectivo y graso del músculo. Todos los análisis de las imágenes se podían realizar utilizando el software ImageJ (NIH) con la herramienta de medición y el complemento de contador de celdas.
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Representative Results
Los resultados representativos reportados siguen los principales ensayos in vitro/in vivo representados en el flujo de trabajo en la Figura 1. 48 horas después de la administración de 4OH-tamoxifeno Los núcleos MyoD-positivos son identificables dentro de los IDEMs transducidos por MyoD-ER en cultivo(Figura 2A). A continuación, las células se fusionan y se diferencian en miotubos multinucleados(Figura 2B). Cuando se trasplantan por vía intramuscular a un modelo murino de lesión muscular aguda, los IVM contribuyen a la regeneración tisular(Figura 3). La eficacia de los IDEMs en un entorno de terapia génica y celular para modelos murinos de distrofia muscular fue evaluada por la prueba de tolerancia al ejercicio en cinta de correr: La Figura 4 muestra los resultados obtenidos después del trasplante de MIDEMs de tipo salvaje en ratones Sgca-null/scid/beige, mostrando una mejora de la capacidad motora en ratones tratados7. Los análisis ex vivo de los músculos trasplantados muestran áreas positivas para la GFP que representan el grado de colonización de los IDEMs en el tejido huésped(Figuras 5A-C),demostrando así que las células donantes se injertan en el músculo distrófico. Es importante destacar que las células trasplantadas son capaces de diferenciarse in vivo,formando nuevos miofiberos esqueléticos. De hecho, la Figura 5 muestra la expresión de Sgca de HIDEMs corregidos genéticamente en ratones Sgca-null/scid/beige (Figuras 5D y 5E). El mejoramiento estructural en la arquitectura de los músculos trasplantados se puede evaluar a través de la tinción tricroma de Masson: La Figura 5F muestra una disminución en la cantidad de tejido fibrótico en el músculo tratado.
Figura 1. Diagrama de flujo de protocolo. El esquema proporciona una visión general de la estrategia basada en IDEM, desde ensayos preliminares de diferenciación in vitro (izquierda) hasta los diversos pasos necesarios para evaluar el injerto, el potencial miogénico y el mejoramiento funcional in vivo y ex vivo (derecha). Las cajas grises oscuras contienen los diversos pasos descritos en el protocolo; los cuadros gris claro contienen partes del método no detalladas en este artículo. Haga clic aquí para ver la figura más grande.
Figura 2. Evaluación del potencial miogénico in vitro. (A) Inmunofluorescencia que muestra expresión nuclear de MyoD en 4 de los 7 núcleos midem transducidos myoD-ER después de 48 horas de exposición a 4OH-tamoxifeno. (B) Tinción de inmunofluorescencia para la cadena pesada de miosina (MyHC) en miotubos derivados de HIDEM inducidos por 4OH-tamoxifeno después de una semana en medio de diferenciación (Barra de escala, 200 μm). Haga clic aquí para ver la figura más grande.
Figura 3. Gravamen in vivo del engraftment de la célula en un modelo de la regeneración aguda del músculo. (A) Imágenes estereomicroscópicas de fluorescencia de GFP de músculos anteriores tibiales cardiotoxina-dañados recientemente aislados explantados 2 semanas después de la inyección intramuscular de10 6 GFP-HIDEMs (izquierda) y GFP-MIDEMs (centro). Barra de escala, 2 mm. (B) Imágenes de aumento bajo (superior) y alto (inferior) del músculo trasplantado con MIDEMs que se muestran en (A) mostrando miofiberos positivos para GFP. Barra de escala, 200 μm. Haga clic aquí para ver la figura más grande.
Figura 4. Prueba de tolerancia al ejercicio de cinta de correr. Prueba representativa de la cinta de correr para trasplantados (IM = intramuscular; IA = intraarterial). Sgca-null/scid/beige mice (106 cell/injection) versus nontransplanted dystrophic and nondystrophic control immunodeficient mice. La gráfica muestra un mejoramiento funcional de ratones distróficos trasplantados con MIDEMs (12-22% más que los animales no transplantados 35 días después del trasplante). Los datos se muestran como capacidad motora promedio en relación con los rendimientos basales(es decir, el 100% representa el rendimiento basal de cada grupo y solo los ratones tratados lo mejoran significativamente en mediciones repetidas). *P < 0,05; **P < 0.005, ANOVA unidireccional. De trabajos previamente publicados de los autores7. Haga clic aquí para ver la figura más grande.
Figura 5. Evaluación in vivo del engraftment y del potencial miógeno en modelos del ratón de la distrofia muscular. (A) Imágenes estereomicroscópicas de fluorescencia de GFP de músculos tibiales anteriores recién aislados de ratones Sgca-null/scid/beige explantados 3-4 semanas después de la inyección intramuscular de 106 humanos (HIDEMs, izquierda; trasplante en ratones juveniles) y murinos (MIDEMs; derecha) GFP-IDEMs. Barra de la escala, 2 milímetros. (b) Imagen estereomicroscópica de la fluorescencia de GFP de un músculo recientemente aislado del gastrocnemius explanted 3 semanas después de la inyección intrarterial de10 6 GFP-MIDEMs. Barra de la escala, 1 milímetro. (c) Sección transversal congelada fresca del músculo trasplantado con MIDEMs mostrado en (a) que exhibe un racimo de myofibers GFP-positivos. Barra de escala, 200 μm. (D) Tinción de inmunofluorescencia en secciones de músculos trasplantados intramuscularmente (como en A)que muestran grupos de fibras genéticamente corregidas, originadas a partir de IDEMs injertados. Barra de escala, 150 μm. (E) Cuantificación de α-sarcoglicano (Sgca)-myofibers positivos un mes después del trasplante intramuscular de IDEMs genéticamente corregidos en ratones Sgca-null/scid/beige. (F) Tinción tricroma de Masson de los músculos tibiales anteriores de ratones Trasplantados y control Sgca-null/scid/beige (rojo: fibras musculares; azul: fibrosis) destacando la reducción del infiltrado fibrótico en el músculo tratado. Barra de escala, 200 μm. Haga clic aquí para ver la figura más grande.
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Discussion
Los iPSC pueden ampliarse indefinidamente preservando su potencial de auto-renovación y, por lo tanto, ser dirigidos a diferenciarse en una amplia gama de linajes celulares12. Por esta y otras razones, las células madre/progenitoras derivadas de iPSC se consideran una fuente prometedora para los enfoques autólogos de terapia génica y celular13. Un trabajo publicado previamente de los autores informó de la generación de progenitores miógenos de ratón y humanos a partir de iPSCs con un fenotipo similar al de los MABs derivados de pericitos (IDEMs) y su contribución eficiente a la regeneración muscular en un modelo de ratón de distrofia muscular7.
Un requisito previo para maximizar el potencial miogénico IDEM es la expresión del factor miogénico MyoD en las células. La transducción con un casete Tamoxifeno-inducible MyoD-ER permitió tener un control temporal preciso sobre su expresión con la ventaja de sincronizar su activación en todo el cultivo y posteriormente in vivo. Una estrategia del trasplante basada sobre una sola administración de células por el músculo (o por la arteria femoral) se ha descrito en este artículo. Sin embargo, las inyecciones repetidas de células han demostrado ser eficaces en el aumento del injerto de MAB en diferentes protocolos de terapia celular8. Por lo tanto, en caso de resultados subóptimos con IDEMs, vale la pena realizar trasplantes repetidos para aumentar la dosis celular y, por lo tanto, la contribución al músculo huésped.
Las mediciones de los resultados permiten evaluar la contribución de las células donantes en el mejoramiento funcional del fenotipo de los animales tratados. Además de la prueba de tolerancia/resistencia al ejercicio realizada con la cinta de correr, se pueden considerar pruebas adicionales para analizar la capacidad motora voluntaria(por ejemplo, prueba de rueda libre), fragilidad de la fibra(por ejemplo, ensayo de absorción de tinte azul evans) y fuerza específica(por ejemplo, fibras individuales o mecánica muscular completa)8. Los métodos adicionales para probar el mejoramiento funcional del fenotipo están disponibles como procedimientos operativos estándar en el sitio web de Treat-NMD(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
Para recopilar información significativa de los animales trasplantados, el mejoramiento funcional debe ser seguido y validado por análisis inmunohistoquívocos e histológicos, para evaluar el injerto celular y la arquitectura/remodelación tisular. En particular, es importante evaluar la estructura morfométrica de los músculos injertados para las características de regeneración y fibrosis, como la evaluación del número de fibras con un núcleo central, el área transversal de los miofiberos y el índice fibrótico. Estos últimos análisis, junto con los resultados funcionales, proporcionan una visión general exhaustiva de la eficacia de la estrategia. Por otra parte, el seguimiento del linaje adoptado por las células trasplantadas en términos de contribución al tejido(es decir, miofiberos) y el mantenimiento del compartimiento de células madre es importante para la eficacia a largo plazo de todas las estrategias de terapia celular. En este caso, ya se ha informado de la contribución de donantes in vivo al compartimento de pericitos del que se derivan los mesoangioblastos7; además, los resultados preliminares indican la contribución funcional de los IDEMs también al grupo de células satélite (Gerli y Tedesco, resultados inéditos). Los análisis moleculares para demostrar el engraftment y la expresión del gene corregido(es decir la polimerización en cadena cuantitativa y la mancha blanca /negra occidental) son también críticos, pero están más allá del alcance de este papel y requerirían un artículo dedicado.
Aunque este protocolo se ha desarrollado principalmente utilizando ratones Sgca-null/scid/beige7 (un modelo inmunodeficiente recientemente publicado de LGMD2D), se espera que pueda ser fácilmente aplicable a otros modelos de enfermedad muscular. En el caso de Sgca-null/scid/beige, los ratones no utilizamos cardiotoxina, ya que los músculos de estos animales están gravemente comprometidos y crónicamente sujetos a ciclos de degeneración y regeneración (por lo tanto, no es necesario un daño adicional por cardiotoxina). Sin embargo, no podríamos excluir que un tratamiento previo con cardiotoxina podría facilitar el injerto en modelos más leves de distrofia muscular(por ejemplo, ratones mdx). Los mejoramientos de nuestra estrategia pueden incluir métodos para aumentar la inmunodeficiencia del anfitrión del ratón (que en los modelos actuales es todavía subóptimo) y la eficacia del engraftment dispensador de aceite de la célula, particularmente sobre la entrega intrarterial de células xenogeneic. Aunque el trasplante de células múltiples y el uso de ratones juveniles contribuyen al aumento del injerto celular7,8,las moléculas de adhesión de ratón encontradas por las células humanas durante la extravasación y/o migración podrían plantear obstáculos adicionales a la inmunodeficiencia limitada de los modelos actuales. Las direcciones futuras para la traducción de este enfoque de terapia génica y celular en un entorno clínico pueden incluir estrategias farmacológicas para mejorar la extravasación celular y el uso de vectores no integradores(por ejemplo, plásmidos, ARNm, cromosomas artificiales humanos o vectores virales nointegrantes) para reprogramar y corregir genéticamente las células, evitando así el riesgo de mutagénesis de inserción.
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Disclosures
F.S.T. ha presentado una solicitud internacional de patente (no. PCT/GB2013/050112) incluyendo parte de la estrategia descrita en este artículo. Recibió financiación de Promimetic y DWC ltd. para su investigación.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Giulio Cossu, Martina Ragazzi y todo el laboratorio por su útil discusión y apoyo, y a Jeff Chamberlain por proporcionar amablemente el vector MyoD-ER. Todos los experimentos con animales vivos se completaron de conformidad y cumplimiento con todas las agencias reguladoras e institucionales pertinentes, reglamentos y directrices. El trabajo en el laboratorio de autores cuenta con el apoyo del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido, los proyectos Optistem y Biodesign del 7º Marco de la Comunidad Europea y el Proyecto Italiano Duchenne Parent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
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References
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- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
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- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
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- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
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- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
