Summary
诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肌原祖是细胞治疗策略治疗肌肉营养不良的有希望的候选人。该协议描述了评估急性和慢性肌肉再生小鼠模型中 iPSC 衍生中生肌肉细胞（一种肌肉祖先）的移植和分化所需的移植和功能测量。
Abstract
患者衍生的iPSC可能是未来自体细胞治疗协议的宝贵细胞来源。iPSC 衍生的肌原干细胞/祖细胞类似于腹膜衍生的间质细胞（iPSC 衍生的中生代细胞（类似 IPSC 的干细胞/祖细胞：IDEMs）可以从受不同形式的肌肉营养不良患者产生的 iPSC 中建立。患者特异性IDEM可以通过不同的策略（如 扁桃体载体、人为染色体）进行基因校正，并在肌生成调节器MyoD过度表达后增强其肌原分化潜力。然后，通过特定的分化检测 在体外 评估这种致肌潜力，并通过免疫荧光进行分析。在显示急性和慢性肌肉再生的两个具有代表性的小鼠模型进行肌肉内和动脉内移植后，在 体内进一步评估IDEM的再生潜力。然后，在移植的小鼠中，不同的功能测试证实了IDEM对宿主骨骼肌肉的贡献。特别是，通过跑步机测试研究动物运动能力的改善。然后，通过对移植肌肉的一些组织学和免疫荧光检测来评估细胞的移植和分化。总的来说，本文描述了目前用于评估IDEM分化能力的检测方法和工具，重点是移植方法和后续结果措施，以分析细胞移植的功效。
Introduction
中生代细胞（MABs）是来自1-3个潜细胞子集的血管相关肌肉祖先。MAB比卫星细胞4 等规范性肌肉祖先的主要优势在于它们在动脉内传递时穿过血管壁的能力，从而有助于细胞治疗协议中的骨骼肌肉再生。这一特点已被评估和确认在肌肉萎缩症的穆林和犬模型1，5，6。这些临床前研究为基于杜琴肌肉营养不良儿童的捐赠者HLA相同MAB的动脉内移植（EudraCT 2011-000176-33;目前正在意大利米兰圣拉斐尔医院进行）的一人第一阶段I/II临床试验奠定了基础。细胞治疗方法的主要障碍之一是"药物产品"（细胞）的增殖潜力有限，需要数十亿个细胞来治疗整个身体的肌肉。此外，最近已经证明，不可能从受某些形式的肌肉营养不良症影响的患者那里获得MAB，因为它发生在肢体-腰肌营养不良2D（LGMD2D：奥米姆#608099）7.
为了克服这些限制，最近建立了一个协议，从人类和穆林iPSC中衍生出类似MAB的干细胞/祖细胞。这个过程产生容易膨胀的细胞群与血管基因特征和免疫嗜血型高度类似于成人肌肉衍生的MAB。在表达肌原调节因子MyoD时，穆林和人类IDEM（分别是MIDM和HIDEM）都会经历末期骨骼肌肉分化。为了实现这个目标，IDEM可以用能够驱动MyoD表达的载体进行转换，无论是构成还是以一种不可推断的方式8-10。使用含有肌激素受体（MyoD-ER）的扁桃体载体，从而允许其核转移后，塔莫西芬（雌激素模拟）管理11。这一策略导致形成富营养多核肌结核，具有高效率7。值得注意的是，IDEM是非肿瘤性的，移植后可以移植后在宿主肌肉内移植和分化，并且可以使用不同的载体（如 扁豆病毒或人类人工染色体）进行基因矫正，为未来的自体治疗策略铺平道路。上述出版物7中描述了IDEM的衍生、定性和移植。本协议文件详细说明了为评估IDEM的 体外 肌原分化而进行的检测以及随后的结果测量，以测试其移植在小鼠肌肉再生模型中的疗效。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 对肌原和增生潜力的评估
-
体外： 肌电图诱导分化
- 生成稳定的IDEM细胞系，该细胞系与塔莫西芬-可致病肌-ER扁桃体载体一起转化，对感染的多重性（MOI： 例如，1、5 和 50）使用 1.1.9 （MyHC） 中描述的染色作为程序效率的结果。
- 涂上3.5厘米的菜，1毫升1%的甲基凝乳，在37°C孵育30分钟。
- 用介质（种子 1 x 105 MyoD-ER）在 3.5 厘米组织培养盘中两次清洗盘子，并在生长介质中以 37 °C 孵育。
- 预计细胞在一两天内达到汇合，然后在生长介质（1st 剂量）中加入 1 μM 4OH-tamoxifen。
- 24小时后，用分化介质替换生长介质，辅以1μM 4OH-tamoxifen（第2次和最后一 剂）。
- 每隔一天用新鲜分化介质替换一半的介质。
- 每天检查肌管形成的文化。
- 一周后（分化介质为5天），用PBS轻轻清洗板，并在RT用4%的副甲醛固定5分钟。
- 对肌素重链 （MyHC） 进行免疫荧光染色，以确认肌管的存在。用核染料（如霍奇斯特）进行计数器。
区分效率被评估为MyHC阳性细胞内核的百分比：如果效率为50%>，则进入下一步。
-
体内：急性肌肉再生模型的灌动
为了评估MyoD-ER IDEM对肌肉再生的 体内 贡献，这些细胞以前被标记为绿色荧光蛋白（GFP）的载体编码，该载体能够在组织内追踪它们。然后将MyoD-ER GFP IDEM注射到成人肌肉中，以前曾因肌毒素（如 心毒素）而受伤。为了避免对异种基因（如HIDEM）或基因操纵/矫正细胞的免疫排斥，需要使用免疫缺陷或免疫抑制小鼠。- 移植前24小时，在移植和预处理细胞前24小时，在生长介质中加入1微米4OH-tamoxifen（血浆形式），在移植日前将3.5微克/克的10毫克/毫升塔莫西芬（脂溶性形式）注射到动物身上。
- 按照规范动物设施外科手术的具体指南，对小鼠进行麻醉和镇痛。
- 注射25微克100μM心毒素（CTX：来自 纳贾莫桑比卡莫桑比卡;注意：头 肌前部 （TA）肌肉中潜在的有害物质）
- 用塔莫西芬和CTX治疗动物24小时后，通过尝试去皮素化和计数分离细胞。
- 将细胞以232 x g分5分钟进行离心。
- 在 Ca2+和 Mg2 +无 PBS、离心机中清洗细胞颗粒，然后轻轻地将 Ca2+中的细胞颗粒和 Mg2+无 PBS 中恢复到 106 个细胞/30 μl 的最终浓度，这将是每次注射的最终体积。
- 使用29或30 G针的注射器将30μl的细胞悬浮注射到先前受伤的肌肉中。在从肌肉中取出针头时要特别注意。慢慢做，避免将细胞悬架溢出到针头的轨道上。不要移植反向 TA 并将其用作控制，注射 30 μl 的 Ca2+- 和 Mg2 +免费 PBS 来复制移植的 PBS 的条件。
- 再用塔莫西芬治疗动物六天，再给镇痛药（如卡洛芬）服用两天。
- 从移植后14天开始切除肌肉。按照《议定书》第 4 和第 5 部分的详细说明处理和分析样本。
2. 肌肉萎缩小鼠模型移植
这种移植检测允许评估小鼠肌肉萎缩症模型中IDEM的移植程度。动物，如下列处理，也可以评估功能改善的疾病表型。功能测试可以从移植后两周开始进行。为了增强适应力，请考虑每三周进行一次移植前跑步机运动（如第3号议定书所述）和/或连续细胞注射3次（即总共3次注射/肌肉）。
- 肌肉内移植
- 在移植和预处理细胞在移植日前在生长介质中加入1μM 4OH-tamoxifen（含血量配方）24小时，在腹膜内注射3.5微克/克的10毫克/毫升塔莫西芬（脂溶性制剂）进行预处理。
- 通过尝试分化分离，在232 x g下对细胞进行计数和离心5分钟。
- 在 Ca2+和 Mg2 +无 PBS、离心机中清洗细胞颗粒，然后在 Ca2+中重新插入颗粒 - 和 Mg2+无 PBS 中重新注入浓度为 106 细胞/30 μl。
- 使用碘或氯西丁消毒剂对动物的皮肤进行镇痛和消毒（可选）。这也将有助于本地化 头骨前部 （TA）、 胃肠 炎（GC）和 四头肌股骨 （QC;特别是 大块的间歇性）肌肉。
- 使用带 29 或 30 G 针的注射器将 30μl 的细胞悬浮注射到肌肉中。对于 TA，在插入近肌腱（颅道方向）下方插入5毫米的针头2毫米，相对于头骨有15°的倾向，在收回针头时慢慢注射细胞悬架（用2毫米的针头在肌肉内清空注射器）。对于 GC 和 QC，重复与 TA 详细相同的程序，主要区别是针头在 GC 跟腱肌腱的肌腱结上方 2 mm 上方的细胞插入，以及 QC 的脱毛肌腱上方 2 毫米（股骨倾斜度为 15° ）。在从肌肉中取出针头时注意，以避免将细胞悬架溢出到针的轨道上。
故障排除：在低受精的情况下，考虑注射幼鼠（1-2周大）小鼠7 与3 x 105 细胞/10 μl（注意，在这种情况下，塔莫西芬需要皮下管理）。
- 动脉内移植
该协议的这一部分允许评估在动脉循环中交付的 MIDEM 和 HIDEM 的能力，穿过血管壁，并有助于在注射部位下游肌肉的骨骼肌肉再生。- 预处理动物和细胞，如上文所述，在第2.1.1步。
- 通过尝试脱脂和过滤与40μm细胞过滤器分离（从细胞悬架中去除集群，万一一夜之间接触塔莫西芬可以驱动融合和形成肌管从相邻的细胞）计数和离心机在232 x g5分钟
- 在 Ca2+和 Mg2 +无 PBS 中清洗细胞颗粒，然后在 Ca2+中重新插入颗粒 - 和 Mg2+无 PBS 与 0.2 国际
肝素钠（可选）单位至106 个细胞/50微克的最终细胞浓度。在溶液中加入 10% 专利蓝色染料（最终浓度：1.25 毫克/毫升普通盐水或 Ca2+- 和 Mg2+无 PBS），以便可视化细胞悬架的分布。 - 根据特定机构动物设施外科手术指南，给小鼠进行麻醉和镇痛。
- 剃须内分区域（也称为股骨或斯卡帕的三角形），用碘或氯西丁消毒剂对皮肤进行消毒。
- 做一个5-7毫米的切口，并本地化股骨束：静脉，动脉和神经（神经横向躺在动脉和静脉中间）。
- 轻轻取出用钳子覆盖捆绑包的连接筋膜。
- 通过在股骨之间轻轻引入钳子尖（或30G针）和逐渐扩大孔，将股骨静脉和神经从动脉中分离出来。
故障排除：股骨静脉是脆弱的：注意不要捏它与钳子在其脱离股动脉。出血时，用无菌纱布排干血液，并使用微烧灼剂促进血液转移。 - 用钳子的一尖抬起动脉，用另一个尖端夹住动脉。
- 用装有 30 G 针的注射器刺穿动脉。在夹紧区域下游注入 50 μl 的细胞悬浮液，输液速度约为 5 μl/秒。
故障排除：在注射前小心地恢复注射器中的细胞：避免细胞沉淀和注射器内的气泡形成至关重要。股动脉的直径略小于30G针：在插入针头时小心不要截断动脉。专利蓝色染料允许识别注射的有效性：如果正确注射，整个肢体将迅速变成浅蓝色。 - 慢慢取出针头和钳子从动脉恢复血液的肢体。
- 使用无菌纱布施加压力，避免出血和/或根据需要烧灼。
- 缝合伤口，监测动物，直到麻醉恢复。
- 管理镇痛3天，每天检查伤口（在伤口感染的情况下，与动物设施人员讨论这个问题，并按要求施用抗生素）。
3. 移植萎缩动物的效果测量：跑步机测试
从细胞移植后两周开始，通过跑步机测试评估治疗小鼠运动能力的功能改善是可能的。此测试允许评估经过治疗的小鼠的运动耐受性/耐力。当鼠标在休息区放置超过 5 秒时，在连续 3 次机械刺激（每 5 秒 1 次）后，不会尝试重新接触跑步机，因此被视为疲劳。基线测量大约在治疗前一个月开始，用于评估每个测试动物的改善情况。此测试之后可以进行额外的检测，以监测纤维脆弱性、力改善、移植细胞的移植、分化以及移植肌肉的形态改善（参见讨论）。
- 在第一次测量之前，将动物（通常为三组：治疗、未经治疗和野生类型/非营养不良控制）适应锻炼：将跑步机设定为6米/分钟的速度10分钟。每隔一天重复一次手术一周。
故障排除：在一天的同一时间记录所有测量结果，以避免由于昼夜周期而出现偏差。 - 将动物放入跑步机中，跑步机以前设置的倾斜度为 10°。
- 打开跑步机，起跑速度为6米/分钟（在动物不愿意开始运动的情况下提供温和的机械刺激）。
- 启动计时器，每 2 分钟提高速度 2 米/分钟。
- 一旦动物躺在休息区超过5秒，而无需尝试重新接触跑步机，用棍子轻轻触摸它，以刺激运动的重新启动（见上文）。
- 记录每种动物的性能（时间和距离）。
- 每周或每 10 天重复测量至少 3 次。
- 移植后重复相同的程序。
- 分析性能数据，比较每种动物的测量结果和基线性能。我们建议将图表中的值绘制为相对于基线的平均电机容量百分比，并通过单向或双向 ANOVA 测试进行分析，然后进行适当的测试后进行比较。
故障排除：使用至少5个年龄、基因型和性别匹配的动物/组，并在移植后重复测量至少3次。
4. 移植肌肉细胞移植和分化评估
移植和控制肌肉是在适当时间点收获的（短期移植分析为<2天，中期为2-3周，长期分析为>1个月）。如果移植的细胞被贴上GFP的标签，新分离的肌肉的移植可以通过紫外线设备的立体显微镜下的直接荧光来评估。
- 沿着垂直轴铺设和定向，在特拉加昌斯牙龈中新分离的肌肉（6% w/v）
- 将样品脱水在预制的同丙烷中一分钟，将样品冷冻在液氮中至少2分钟，并立即将其放置在-80°C以储存。
- 用低温统计器处理样品，在极化滑梯上获取 7 μm 厚的部分。采样幻灯片上的大部分肌肉，收集约 8-10 张幻灯片，其中 30-40 节/滑梯。建议将一系列部分收集到 1.5 毫升管中，以执行分子生物学/生物化学检测。
- 根据实验设置，评估具有不同免疫荧光染色成分的细胞移植。例如，在Sgca-null/scid/bg小鼠进行HIDEM移植的情况下，污渍部分有：a） 抗拉明A/C的抗体，以检测移植的人类细胞核：b） 抗拉米宁的抗体，可视化肌肉的整体结构：和 c） 一种抗体对 Sgca 检测捐赠者衍生的蛋白质恢复缺乏营养不良的动物。
- 使用荧光显微镜量化每个肌肉部分的供体核数量和每节供体衍生的骨骼肌泡数量。
5. 肌肉组织病理学
组织学分析允许对移植肌肉的形态结构进行评估。组织结构的结构改善有望作为细胞治疗方法的结果。
- 修复新分离的肌肉与4%的副甲醛1小时在4°C。
- 用上升的蔗糖梯度（例如 7.5-15-30%w/v）使样品脱水。
- 将肌肉过夜放在最高的蔗糖溶液中。
- 将样品嵌入组织 Tek OCT 中，将其置于预切的同丙烷中，直到 OCT 变为固体（避免样品完全浸入），将样品冷冻在液氮中至少 2 分钟，并立即将其放置在 -80 °C 以进行储存。
- 用低温统计器处理样品，获得上述 7 μm 厚的部分。
- 根据标准制造商的协议，用血氧林和欧辛或马森的三色染色部分。
血氧素和肌素染色可计算再生肌肉的标志，例如：a） 肌瘤的数量：b） 横截面区域：c） 含有中央核的肌泡数量。Masson 的三色用于计算纤维素指数，通过从图像的总面积中减去骨骼肌瘤所占用的总面积来计算：由此产生的区域主要反映肌肉的连接和脂肪渗透。图像上的所有分析都可以使用带有测量工具和单元计数器插件的 ImageJ 软件 （NIH） 执行。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
报告的代表结果遵循图 1中工作流程中描述的主要体外/体外测定。48小时后4OH-塔莫西芬管理MyoD阳性核在肌电图-ER转导IDEM中可识别（图2A）。然后，细胞融合并分化成多核肌管（图2B）。当肌肉内移植到急性肌肉损伤的穆林模型中时，IDEM 有助于组织再生（图 3）。跑步机运动耐受性测试评估了IDEM在肌肉营养不良的murine模型基因和细胞治疗环境中的功效：图4显示了将野生型MEDM移植到Sgca-null/scid/米色小鼠后获得的结果，显示治疗小鼠7的运动能力得到改善。移植肌肉的外活体分析显示，GFP阳性区域表示IDEM进入宿主组织（图5A-C）的殖民化程度，从而表明供体细胞会渗入营养不良的肌肉。重要的是，移植的细胞能够在体内分化，形成新的骨骼肌化器。事实上，图5显示斯格卡表达从基因校正的隐藏到斯格卡-空/西德/米色小鼠（图5D和5E）。移植肌肉结构中的结构改善可以通过马森的三色染色进行评估：图5F显示治疗肌肉中纤维组织的数量减少。
图1。协议流程图。该计划概述了基于 IDEM 的战略，从初步体外分化测定（左）到评估体内和前体内（右）的增生、肌原潜力和功能改善所需的各种步骤。深灰色框包含协议中描述的各种步骤;浅灰色框包含本文未详细说明的方法的某些部分。单击此处查看较大的图。
图2。体外肌原潜力评估。（A）免疫荧光显示核肌民主联盟表达在 4 出 7 MyoD -ER 转导 MIDEM 核后 48 小时暴露到 4OH-tamoxifen.（B）在分化介质（Scale bar， 200 μm）一周后，在 4OH-tamoxifen 诱导的 HIDEM 衍生肌管上对肌素重链 （MyHC） 进行免疫荧光染色。单击此处查看较大的图。
图3。在急性肌肉再生模型中细胞移植的体内评估。（A）在肌肉注射106 GFP-HIDEMs（左）和GFP-MIDEM（中）2周后，新分离的心毒素受伤头骨前肌肉的立体显微GFP荧光图像被喷出。比例杆，2毫米（B）低（上）和高（下）放大图片的肌肉移植与MEDEm显示在（A）显示GFP阳性肌化剂。比例杆，200微米。单击此处查看较大的图。
图4。跑步机运动耐受性测试。移植代表跑步机测试（IM = 肌肉内;IA = 动脉内）。Sgca-null/scid/米色小鼠（106细胞/注射）与非移植营养不良和非嗜血性控制免疫缺陷小鼠。图示使用 MIDEM 移植的营养不良小鼠的功能改善（比移植后 35 天的非移植动物多 12-22%）。数据显示为相对于基线性能的平均电机容量（即100% 表示每组的基线性能，并且只有经过处理的小鼠在反复测量后显著改善它）。*P<0.05;**P < 0.005，单向新星。摘自作者此前发表的作品7。单击此处查看较大的图。
图5。在肌肉营养不良的小鼠模型的体外评估中，对移植和肌原潜力进行评估。（A） Sgca-null/scid/米色小鼠新分离的头骨前肌肉的立体显微GFP荧光图像在肌肉注射106人（隐藏，左;幼鼠移植）和穆林（MIDEM;右）GFP-IDEMs后3-4周解释。比例杆，2毫米（B）立体显微GFP荧光图像，新分离的胃内膜肌肉在动脉内注射106 GFP-MIDEM后3周喷出。比例杆，1毫米（C）肌肉的新鲜冷冻横向部分移植与MIDM显示在（A）显示一组GFP阳性肌化剂。比例杆，200微米。（D）肌肉内移植肌肉部分的免疫荧光染色（如A）显示基因校正纤维簇，这些纤维来自移植的IDEM。比例杆，150微米。（E）在肌肉内将基因校正的IDEM移植到Sgca-null/scid/米色小鼠一个月后，对α-沙糖（Sgca）阳性肌瘤进行量化。（F）马森三色染色从移植和控制Sgca-null/scid/米色小鼠（红色：肌肉纤维;蓝色：纤维化）突出减少纤维渗透在治疗的肌肉。比例杆，200微米。单击此处查看较大的图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC可以无限期地扩展，同时保持其自我更新的潜力，从而被引导到广泛的细胞血统12。由于这个和其他原因，iPSC衍生的干细胞/祖细胞被认为是自体基因和细胞治疗方法13的有希望的来源。作者先前发表的一篇著作报告了iPSC中小鼠和人类肌原祖先的生成，其表型与围网衍生的MAB（IDEMs）相似，并在小鼠肌肉营养不良7模型中对肌肉再生的有效贡献。
最大化 IDEM 肌原电位的先决条件是细胞中肌激素因子 MyoD 的表达。转导与塔莫西芬诱导MyoD-ER盒式磁带，使具有精确的时间控制其表达的优势，同步其激活在整个文化 ，随后在体内。本文描述了基于每块肌肉（或每股股动脉）细胞单一管理的移植策略。然而，重复的细胞注射已被证明对增加不同细胞治疗方案8中的MAB增大是有效的。因此，如果IDEM的结果不理想，值得进行重复移植，以增加细胞剂量，从而对宿主肌肉的贡献。
结果测量允许评估供体细胞在治疗动物表型功能改善中的贡献。除了在跑步机上进行的运动耐受性/耐力测试外，分析自愿运动能力（如 自由车测试）、纤维脆弱性（如 Evans 蓝色染料吸收检测）和特定力（如 单纤维或全肌肉力学）的进一步测试可视为8。在治疗-NMD网站（http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/）中，测试功能表型改善的其他方法可作为标准操作程序提供。
为了从移植动物身上收集重要信息，功能改善必须遵循并经过免疫化学和组织学分析的验证，以评估细胞移植和组织结构/重塑。特别是，重要的是要评估移植肌肉的形态结构，以寻找再生和纤维化的标志，例如评估具有中央核的纤维数量、肌瘤横截面区域和纤维指数。后一种分析以及功能结果对战略的有效性进行了详尽的概述。此外，监测移植细胞对组织的贡献（即肌细胞）和干细胞室的维护对所有细胞治疗策略的长期疗效非常重要。在这种情况下，已经报告了捐赠者在 体内 对中生细胞衍生7的围网舱的贡献：此外，初步结果表明，IDEM也对卫星电池池（格力和特德斯科，未公布的结果）的功能贡献。分子分析，以证明纠错基因（即 定量PCR和西方污点）的纠缠和表达也是至关重要的，但超出了本文的范围，需要一篇专门的文章。
虽然此协议主要使用 Sgca-null/scid/米色小鼠7（ 最近发布的 LGMD2D 免疫缺陷模型）开发，但预计它很容易适用于其他肌肉疾病模型。在Sgca-null/scid/米色的情况下，我们没有使用心毒素的小鼠，因为这些动物的肌肉受到严重损害，并长期受到退化和再生周期（因此没有必要从心毒素的额外损害）。然而，我们不能排除，心毒素的预治疗可以促进在温和的肌肉营养不良模型（如mdx小鼠）的移植。我们策略的改进可能包括增强小鼠宿主免疫缺陷的方法（在目前的模型中，这种缺陷仍然不理想）和供体细胞移植的功效，特别是在动脉内传递异种细胞时。虽然多细胞移植和使用幼鼠有助于细胞移植7，8的增加，但人类细胞在外化和/或迁移过程中遇到的小鼠粘附分子可能会对当前模型的免疫缺陷有限构成额外的障碍。在临床环境中翻译这种基因和细胞治疗方法的未来方向可能包括药理学策略，以增强细胞外泄和使用非整合载体（如 质粒、mRNA、人类人造染色体或非整合病毒载体）来重新编程和基因校正细胞，从而避免插入性突变的风险。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T.已提交国际专利申请（否）PCT/GB2013/050112）包括本文中描述的战略的一部分。他得到了专业和DWC有限公司的资助，用于他的研究。
Acknowledgments
作者感谢朱利奥·科苏、玛蒂娜·拉加齐和整个实验室的有益讨论和支持，感谢杰夫·张伯伦亲切地提供MyoD-ER载体。所有涉及活体动物的实验都是按照所有相关的监管和体制机构、条例和准则完成的。作者实验室的工作得到了英国医学研究理事会、欧洲共同体第七框架项目Optisem和Biodesign以及意大利杜尚家长项目的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
