Summary
İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.
Abstract
Hasta kaynaklı iPSC'ler, gelecekteki otolog hücre tedavisi protokolleri için paha biçilmez bir hücre kaynağı olabilir. Perisit türevi mezoangioblastlara benzer iPSC türevi miyojenik kök/progenitör hücreler (iPSC türevi mezoangioblast benzeri kök/progenitör hücreler: IDEM'ler) farklı kas distrofisi formlarından etkilenen hastalardan oluşturulan iPSC'lerden kurulabilir. Hastaya özgü IDEM'ler genetik olarak farklı stratejilerle düzeltilebilir(örneğin lentiviral vektörler, insan yapay kromozomları) ve miyojenik farklılaşma potansiyellerinde miyogenez regülatörü MyoD'nin aşırı ifade edilmesi üzerine geliştirilebilir. Bu miyojenik potansiyel daha sonra spesifik farklılaşma tahlilleri ile in vitro olarak değerlendirilir ve immünofolüoresans ile analiz edilir. IDEM'lerin rejeneratif potansiyeli in vivoolarak daha da değerlendirilir Akut ve kronik kas yenilenmesini gösteren iki temsili fare modelinde intramüsküler ve intra-arteriyel transplantasyon üzerine. İDEM'lerin konak iskelet kasına katkısı daha sonra nakledilen farelerde farklı fonksiyonel testlerle doğrulanır. Özellikle, hayvanların motor kapasitesinin iyilaştırılması koşu bandı testleri ile çalışılmaktadır. Hücre engraftasyonu ve farklılaşması daha sonra nakledilen kaslarda bir dizi histolojik ve immünofluoresans tahlilleri ile değerlendirilir. Genel olarak, bu makalede IDEM'lerin farklılaşma kapasitesini değerlendirmek için şu anda kullanılan tahliller ve araçlar açıklanmaktadır, hücre naklinin etkinliğini analiz etmek için transplantasyon yöntemlerine ve sonraki sonuç önlemlerine odaklanmaktadır.
Introduction
Mezoangioblastlar (MAB'ler) perisitlerin bir alt kümesinden elde edilen damarla ilişkili kas progenitörleridir1-3. MAB'lerin uydu hücreleri4 gibi kanonik kas progenitörlerine göre temel avantajı, intra-arteriyel olarak teslim edildiğinde damar duvarını geçme yeteneklerinde bulunur ve bu nedenle hücre tedavisi protokollerinde iskelet kası yenilenmesine katkıda bulunur. Bu özellik kas distrofisinin hem murine hem de köpek modellerinde değerlendirilmiş ve onaylanmıştır1,5,6. Bu preklinik çalışmalar, Duchenne musküler distrofisi olan çocuklarda donör HLA-özdeş MAB'lerin intra-arteriyel nakline dayanan ilk in-man faz I/II klinik çalışmasının temellerini oluşturmuştur (EudraCT no. 2011-000176-33; şu anda İtalya Milano San Raffaele Hastanesi'nde devam etmektedir). Tüm vücudun kasını tedavi etmek için milyarlarca hücreye ihtiyaç duyulan hücre tedavisi yaklaşımlarının ana engellerinden biri, "tıbbi ürünün" (hücreler) sınırlı proliferatif potansiyelidir. Ayrıca son zamanlarda, uzuv-korse kas distrofisi 2D'de (LGMD2D) ortaya çıktığı için bazı kas distrofisi formlarından etkilenen hastalardan MAB elde etmenin mümkün olmadığı gösterilmiştir; OMIM #608099)7.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, MAB benzeri kök / progenitör hücreleri insan ve murine iPSC'lerden türetmek için bir protokol yakın zamanda kurulmuştur7. Bu prosedür, yetişkin kas türevi MAB'lere oldukça benzeyen vasküler gen imzası ve immünofenotip ile kolayca genişletilebilir hücre popülasyonları oluşturur. Miyojenik düzenleyici faktör MyoD'nin ifade edilmesi üzerine, hem murin hem de insan IDEM'leri (sırasıyla MİDEM'ler ve HIDEM'ler) terminal iskelet kas farklılaşmasına uğrar. Bu amaca ulaşmak için IDEM'ler, MyoD ekspresyonünü, yaklaşık olarak veya8-10indüklenebilir bir şekilde yönlendirebilen vektörlerle transdüklenebilir. Östrojen reseptörü (MyoD-ER) ile kaynaşmış MyoD cDNA içeren bir lentiviral vektör kullanılır, böylece tamoksifen (östrojen analogu) uygulama11üzerinde nükleer translokasyonuna izin verir. Bu strateji, yüksek verimli7ile hipertrofik çok noktayaükle edilmiş miyotütlerin oluşumuyla sonuçlanır. Özellikle, IDEM'ler nontumorijeniktir, transplantasyon sırasında konak kaslarının içinde yer alabilir ve farklı vektörler(örneğin lentivirüsler veya insan yapay kromozomları) kullanılarak genetik olarak düzeltilebilir ve gelecekteki otolog terapötik stratejilerin önünü açabilir. IDEM'lerin türetmesi, karakterizasyonu ve nakli yukarıdaki yayında açıklanmıştır7. Bu protokol makalesi, IDEM'lerin in vitro miyojenik farklılığını değerlendirmek için yapılan tahlilleri ve daha sonra yapılan sonuç ölçümlerini, kas yenilenmesinin fare modellerinde transplantasyonlarının etkinliğini test etmek için detaylandırmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Miyojenik ve Engraftment Potansiyelinin Değerlendirilmesi
-
In vitro: MYOD kaynaklı farklılaşma
- Enfeksiyonun çokluğunu titreterek tamoksifen indüklenen MyoD-ER lentiviral vektör ile transdüklenmiş kararlı bir IDEM hücre hattı oluşturun (MOI; örneğin 1, 5 ve 50) 1.1.9 'da (MyHC) açıklanan lekeyi prosedürün verimliliğinin bir sonucu olarak kullanmak.
- 3,5 cm'lik bir yemeği 1 ml% 1 Matrigel ile kaplayın ve 37 ° C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Plakayı orta, tohum 1 x 105 MyoD-ER transdüklenmiş IDEM'lerle 3,5 cm doku kültürü çanağı ile iki kez yıkayın ve büyüme ortamında 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Hücrelerin bir veya iki gün içinde birleştiği yerde olmasını bekleyin ve ardından büyüme ortamına 1 μM 4OH-tamoksifen ekleyin (1st doz).
- 24 saat sonra, büyüme ortamını 1 μM 4OH-tamoksifen (2nd ve son doz) ile desteklenmiş farklılaşma ortamı ile değiştirin.
- Ortamın yarısını her gün taze farklılaşma ortamıyla değiştirin.
- Myotube oluşumu için günlük kültürleri inceleyin.
- Bir hafta sonra (farklılaşma ortamında 5 gün), plakaları PBS ile hafifçe yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca % 4 paraformaldehit ile sabitlayın.
- Miyotütlerin varlığını doğrulamak için miyosin ağır zincirine (MyHC) karşı antikorlarla immünoresans lekesi gerçekleştirin. Nükleer boya ile karşı çekim(örneğin Hoechst).
Farklılaşmanın verimliliği MyHC pozitif hücrelerin içindeki çekirdek yüzdesi olarak değerlendirilir: verimlilik% >50 ise bir sonraki adıma geçin.
-
In vivo: akut kas rejenerasyon modelinde engraftment
MyoD-ER IDEM'lerin kas yenilenmesine in vivo katkısını değerlendirmek için, hücreler daha önce yeşil floresan protein (GFP) için doku içinde onları izlemeyi sağlayacak bir vektör kodlaması ile etiketlenmiştir. MyoD-ER GFP IDEM'leri daha önce bir miyotoksin (örneğin kardiyotoksin) ile yaralanan yetişkin murine kaslarına enjekteedilir. Ksenogeneik (HIDEM'ler gibi) veya genetik olarak manipüle edilmiş/düzeltilmiş hücrelere karşı bağışıklık reddini önlemek için immün yetmezlikli veya bağışıklığı baskılanmış fareler kullanmak gerekir.- Nakilden 24 saat önce 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoksifen (liposoluble form) periton içi enjeksiyon ile hayvanları ön işlemden geçirdi ve transplantasyon gününden önce büyüme ortamına 1 μM 4OH-tamoksifen (sulu form) ekleyerek hücreleri ön işlemden geçirdi.
- Hayvan tesisindeki cerrahi prosedürleri düzenleyen özel yönergeleri izleyerek fareye anestezi ve analjezi uygulayın.
- 25 μl 100 μM kardiyotoksin enjekte edin (CTX; Naja mossambica mossambica'dan); DİkKAT: potansiyel olarak zararlı madde) tibialis ön (TA) kaslarında.
- Tamoksifen ve CTX ile hayvanları tedavi ettikten 24 saat sonra, hücreleri trypsinization ve count ile ayırın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 232 x g'da santrifüj edin.
- Hücre peletini Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS, santrifüj ve ardından hücre peletini Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS'de, her enjeksiyonun son hacmi olacak 106 hücre/30 μl'lik son konsantrasyona hafifçe yeniden boşaltın.
- 29 veya 30 G iğneli bir şırınga kullanarak daha önce yaralanan kaslara 30 μl hücre süspansiyonu enjekte edin. İğneyi kastan çıkarırken özellikle dikkat edin. Hücre süspansiyonu iğnenin yolundan dökülmekten kaçınarak yavaşça yapın. Kontralasyon ta'yı nakletmeyin ve kontrol olarak kullanmayın, nakledilenin koşullarını çoğaltmak için30 μlCa 2 + ve Mg2 +içermeyen PBS enjekte edin.
- Hayvanları altı gün boyunca tamoksifen ile tedavi edin ve iki ek gün boyunca analjezi(örneğin Carprofen) verin.
- Nakilden sonraki 14 günden itibaren kasları dışarı dökin. Protokol 4 ve 5'te ayrıntılı olarak belirtildiği gibi örnekleri işleyin ve analiz edin.
2. Kas Distrofisinin Fare Modellerinde Transplantasyon
Bu transplantasyon testi, kas distrofisinin fare modellerinde IDEM'lerin engrafmentinin kapsamının değerlendirilmesini sağlar. Aşağıdaki gibi tedavi edilen hayvanlar, hastalık fenotipinin fonksiyonel iyileştiriciliği için de değerlendirilebilir. Transplantasyondan sonraki iki haftadan itibaren fonksiyonel testler yapılabilir. Engraftasyon geliştirmek için 3x(yani toplam 3 enjeksiyon / kas için) için her üç haftada bir ön-iletim koşu bandı egzersizi (Protokol 3'te açıklandığı gibi) ve / veya seri hücre enjeksiyonları yapmayı düşünün.
- Kas içi transplantasyon
- Nakilden 24 saat önce 3,5 μl/g 10 mg/ml tamoksifen (liposoluble formülasyonu) periton içi enjeksiyon ile hayvanları ön işlemden geçirdi ve transplantasyon gününden önce büyüme ortamına 1 μM 4OH-tamoksifen (sulu formülasyon) ekleyerek ön işlem hücrelerine başvurdu.
- Trypsinization ile ayırın, hücreleri 5 dakika boyunca 232 x g'da sayın ve santrifüj edin.
- Hücre peletini Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS, santrifüj ve ardından peleti Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS'de 106 hücre/30 μl konsantrasyonda yeniden biriktirin.
- Analjeziyi uygulayın ve hayvanın cildini (isteğe bağlı) povidon iyot veya klorexidin bazlı bir dezenfektanla dezenfekte edin. Bu aynı zamanda tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) ve kuadriseps femoris (QC; özellikle vastus intermedius) kaslarını lokalize etmeye yardımcı olacaktır.
- 29 veya 30 G iğneli bir şırınga kullanarak kaslara 30 μl hücre süspansiyonu enjekte edin. TA için, iğnenin 5 mm'sini tibiaya göre 15° eğimli proksimal tendonun (kraniosaudal yön) yerleştirilmesinin 2 mm altına yerleştirin ve iğneyi geri alırken hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin (şırıngayı hala kasın içinde 2 mm iğne ile boşaltın). GC ve QC için, TA için ayrıntılı olarak aynı prosedürü tekrarlayın, ana fark, iğnenin GC için Aşil tendonunun miyotendinöz kavşağından 2 mm ve QC için distal tendonun 2 mm üzerinde kaudokranial yerleştirilmesidir (uyluk kemiğine göre 15 ° eğim). Hücre süspansiyonun iğnenin yolundan dökülmemesi için iğneyi kastan çıkarırken dikkat edin.
SORUN GİDERME: Düşük engraftment durumunda, 3 x 10 5 hücre/10 μl ile7 yavru (1-2 haftalık) farelere enjekte etmeyi düşünün (bu durumda tamoksifen'in deri altından uygulanması gerektiğini unutmayın).
- İntra-arteriyel transplantasyon
Protokolün bu kısmı, MİDEM'lerin ve HIDEM'lerin arteriyel dolaşımda teslim edilebilmelerinin değerlendirilmesine, damar duvarını geçmesine ve enjeksiyon bölgesine kadar olan kaslarda iskelet kaslarının yenilenmesine katkıda bulunmasını sağlar.- 2.1.1 adımında yukarıda açıklandığı gibi hayvanları ve hücreleri ön işlemden geçin.
- 40 μm hücre süzgeçli trypsinization ve filtre ile ayırın (tamoksifen'e bir gecede maruz kalmanın bitişik hücrelerden füzyon ve miyotüp oluşumunu yönlendirebileceği olası bir durumda kümeleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için) hücreleri 5 dakika boyunca 232 x g'da sayar ve santrifüjler
- Hücre peletini Ca2+- ve Mg2+içermeyen PBS, santrifüjde yıkayın ve ardından peleti Ca2+ve Mg2+içermeyen PBS'de 0.2 International ile yeniden satın
Sodyum heparin birimleri (isteğe bağlı) 106 hücre/50 μl nihai hücre konsantrasyonuna. Hücre süspansiyonunun dağılımını görselleştirmek için çözeltiye %10 Patent mavi boyası (son konsantrasyon: normal salin veya Ca2+- ve Mg 2+ içermeyen PBS'de1,25mg/ml) ekleyin. - Belirli kurumsal hayvan tesisinde cerrahi prosedürleri düzenleyen yönergelere göre fareye anestezi ve analjezi uygulayın.
- Kasık bölgesini tıraş edin (femoral veya Scarpa üçgeni olarak da bilin) ve cildi povidon iyot veya klorheksidin bazlı bir dezenfektanla dezenfekte edin.
- 5-7 mm'lik bir kesi yapın ve femoral demeti lokalize edin: damar, arter ve sinir (sinir atardamara ve damara medial olarak yanal olarak uzanır).
- Paketi tostikülle kaplayan bağ fasyasını yavaşça çıkarın.
- Femoral damarı ve siniri, aralarındaki bir tostisin (veya 30 G iğnenin) ucunu hafifçe sokarak ve deliği kademeli olarak büyüterek arterden ayırın.
SORUN GİDERME: Femoral damar kırılgandır: femoral arterden ayırması sırasında tokmaklarla sıkıştırmamaya dikkat edin. Kanama durumunda, kanı steril gazlı bezle boşaltın ve hemostazı kolaylaştırmak için bir mikro koterizatör kullanın. - Atardamarı bir ucuyla kaldırıp diğer ucuyla sıkıştırın.
- Atardamarı 30 G iğne ile donatılmış bir şırınga ile delin. Yaklaşık 5 μl/sn infüzyon hızında, kenetlenmiş bölgenin aşağısına 50 μl hücre süspansiyonu enjekte edin.
SORUN GİDERME: Enjeksiyondan önce şırınnadaki hücreleri dikkatlice yeniden biriktirin: Şırındının içindeki hücrelerin çökeltmelerini ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek hayati önem taşır. Femoral arterin çapı 30 G'lık bir iğneden biraz daha küçüktür: iğneyi yerleştirirken atardamarı kesilmemeye dikkat edin. Patent mavi boyası enjeksiyonun etkinliğini tanımaya izin verir: doğru enjekte edilirse, tüm uzuv hızla açık maviye döner. - Uzuvdaki kan dolaşımını geri kazanmak için iğneyi ve tokaları yavaşça atardamardan çıkarın.
- Kanamayı önlemek ve/veya gerektiği gibi dağlamak için steril gazlı bezle basınç uygulayın.
- Yarayı dikin ve anesteziden iyileşene kadar hayvanları izleyin.
- Analjeziyi 3 gün boyunca uygulayın ve yarayı günlük olarak inceleyin (yara enfeksiyonu durumunda bunu hayvan tesisi personeliyle tartışın ve gerektiği gibi antibiyotikler sürün).
3. Nakledilen Distrofik Hayvanlarda Sonuç Önlemleri: Koşu Bandı Testi
Hücre naklinden sonraki iki haftadan başlayarak, tedavi edilen farelerin motor kapasitesinin fonksiyonel olarak iyilaştırılmasını koşu bandı testleri ile değerlendirmek mümkündür. Bu test, tedavi edilen farelerin egzersiz toleransının / dayanıklılığının değerlendirilmesini sağlar. Bir fare, 3 ardışık mekanik uyaran serisinden (her 5 saniyede bir) sonra koşu bandını yeniden kurmaya çalışmadan, 5 saniyeden fazla dinlenme alanında uzandığında yorgun olarak kabul edilir. Temel ölçümler tedaviden yaklaşık bir ay önce başlar ve test edilen her bir hayvanın iyileştirilmesini değerlendirmek için kullanılır. Bu testi lif kırılganlığı, kuvvet iyileştirme, engraftasyon, nakledilen hücrelerin farklılaşması ve nakledilen kasların morfolojik ameliorasyonunu izlemek için ek testler takip edebilir (bkz. Tartışma).
- hayvanları (genellikle üç grup: tedavi edilmiş, işlenmemiş ve vahşi tip / distrofik olmayan kontroller) ilk ölçümden önce egzersize alıştırın: koşu bandını 10 dakika boyunca 6 m / dak hızında ayarlayın. İşlemi bir hafta boyunca her gün tekrarlayın.
SORUN GİDERME: Sirkadiyen döngüler nedeniyle önyargıları önlemek için tüm ölçümleri günün aynı saatinde kaydedin. - Hayvanları daha önce 10 ° eğimle kurulmuş olan koşu bandına yerleştirin.
- Koşu bandını 6 m / dk başlangıç hızıyla açın (hayvanların egzersize başlamak istememesi durumunda hafif bir mekanik uyaran sağlayın).
- Zamanlayıcıyı başlatın ve hızı her 2 dakikada bir 2 m/dk artırın.
- Bir hayvan koşu bandını yeniden birleştirmeye çalışmadan 5 saniyeden fazla dinlenme alanında uzanır uzanmaz, egzersizin yeniden başlatılmasını teşvik etmek için bir çubukla hafifçe dokunun (yukarıya bakın).
- Her hayvanın performansını (zaman ve veya mesafe) kaydedin.
- Ölçümleri haftalık olarak veya her 10 günde bir en az 3x boyunca tekrarlayın.
- Transplantasyondan sonra aynı işlemi tekrarlayın.
- Her hayvanın ölçümünü temel performansıyla karşılaştırarak performans verilerini analiz edin. Grafikteki değerleri taban çizgisine göre ortalama motor kapasitesinin yüzdesi olarak çizmeyi ve grupları karşılaştırmak için uygun test sonrası uygun bir anova testi ile analiz etmeyi öneriyoruz.
SORUN GİDERME: en az 5 yaş, genotip ve cinsiyete uygun hayvan/grup kullanın ve nakilden sonra ölçümleri en az 3 kat tekrarlayın.
4. Nakledilen Kaslarda Hücre Engraftasyonu ve Farklılaşmanın Değerlendirilmesi
Nakledilen ve kontrol kasları uygun zaman noktasında toplanır (kısa süreli engraftasyon analizi için <2 gün, orta vadeli için 2-3 hafta ve uzun süreli analiz için >1 ay). Nakledilen hücreler GFP ile etiketlenmişse, yeni izole edilmiş kaslardaki engrafitasyon UV donanımlı bir stereomikroskop altında doğrudan floresan ile değerlendirilebilir.
- Tragachanth sakızında dikey eksen boyunca yeni izole edilmiş kasları döşeyin ve yönlendirin (%6 w/v)
- Numuneleri önlüklü izopentan içinde bir dakika susuz bırak, sıvı nitrojende en az 2 dakika dondurun ve depolama için hemen -80 ° C'ye yerleştirin.
- Polarize slaytlarda 7 μm kalınlığında bölüm elde etmek için numuneleri kriyostatla işleyin. 30-40 bölüm / slayt ile yaklaşık 8-10 slayt toplayarak, slaytlarda kasların çoğunu örnekleyin. Moleküler biyoloji/ biyokimya tahlilleri yapmak için 1,5 ml'lik bir tüpe bir dizi bölüm toplanması tavsiye edilir.
- Deneysel kuruluma bağlı olarak hücre engraftmentini farklı immünofluoresan lekeleme ile değerlendirin. Örneğin, Sgca-null/scid/bg farelerde HIDEM nakli durumunda, leke bölümleri: a) Aşılanmış insan hücre çekirdeklerini tespit etmek için Lamin A/C'ye karşı bir antikor; b) Kasın genel yapısını görselleştirmek için Laminin'e karşı bir antikor; ve c) Distrofik hayvanda bulunmayan proteinin donör türevi restorasyonu tespit etmek için Sgca'ya karşı bir antikor.
- Floresan mikroskobu kullanarak, kas liflerinin içindeki ve dışındaki kas bölümü başına donör çekirdeği sayısını ve kesit başına donör türevli iskelet miyofiberlerinin sayısını ölçün.
5. Kas Histopatolojisi
Histopatolojik analizler nakledilen kasın morfolojik yapısının değerlendirilmesini sağlar. Hücre tedavisi yaklaşımının bir sonucu olarak doku yapısında mimari iyileşme bekmektedir.
- Yeni izole edilmiş kasları 4 °C'de 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitle.
- Numuneleri artan bir sakkaroz gradyanı ile susuzluktan arındırın(örneğin% 7.5-15-30 w/v).
- Kasları gece boyunca en yüksek sakkaroz çözeltisinde bırakın.
- Örnekleri Doku Tek OCT'ye gömün, OCT katılaşana kadar ön izopente yerleştirin (numunelerin tamamen batırılmasını önleyerek), en az 2 dakika sıvı nitrojende dondurun ve depolama için hemen -80 °C'ye yerleştirin.
- Yukarıda açıklandığı gibi 7 μm kalınlığında bölüm elde etmek için numuneleri kriyostatla işleyin.
- Bölümleri standart üretici protokollerine göre hematoksilin ve eozin veya Masson'un üç renkli ile lekelenin.
Hematoksilin ve eozin boyama, aşağıdakiler gibi yenileyici kasların ayırt edici özelliklerinin hesaplanmasına olanak tanır: a) miyofiberlerin sayısı; b) kesit alanı; c) merkezi bir çekirdek içeren miyofiberlerin sayısı. Masson'un üç renklisi, iskelet miyofiberlerinin kapladığı toplam alanı görüntünün toplam alanından çıkararak fibrotik indeksi hesaplamak için kullanılır: ortaya çıkan alan esas olarak kasın bağ ve yağ sızmasını yansıtır. Görüntülerdeki tüm analizler, ölçüm aracı ve hücre sayacı eklentisi ile ImageJ yazılımı (NIH) kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildirilen temsili sonuçlar, Şekil 1'deiş akışında gösterilen ana in vitro / in vivo testlerini izler. 4OH-tamoksifen uygulamasından sonra 48 saat MyoD pozitif çekirdekler, kültürdeki MyoD-ER transdüklenmiş IDEM'lerde tanımlanabilir (Şekil 2A). Hücreler daha sonra kaynaştırılır ve çok noktaya çok yönlü miyotüplere farklılaştırılır (Şekil 2B). Akut kas yaralanmasının bir murine modeline intramüsküler olarak nakledildiğinde, IDEM'ler doku yenilenmesine katkıda bulunur (Şekil 3). Kas distrofisinin murine modelleri için gen ve hücre tedavisi ortamındaki IDEM'lerin etkinliği koşu bandı egzersiz tolerans testi ile değerlendirildi: Şekil 4, vahşi tip MİDEM'lerin Sgca-null/scid/bej farelere naklinden sonra elde edilen sonuçları gösterir ve tedavi edilen farelerde motor kapasitesinin iyileştirici bir şekilde gösterilmesini gösterir7. Nakledilen kasların ex vivo analizleri, IDEM'lerin konak dokuya kolonizasyonunun kapsamını temsil eden GFP pozitif alanları göstermektedir (Şekil 5A-C), böylece donör hücrelerin distrofik kas içine yerleştiği gösterilmiştir. Daha da önemlisi, nakledilen hücreler in vivofarklılaşabiliyor Yeni iskelet miyofiberleri oluşturuyor. Gerçekten de Şekil 5, genetik olarak düzeltilmiş HIDEM'lerden Sgca-null/scid/bej farelere Sgca ifadesini göstermektedir (Şekil 5D ve 5E). Nakledilen kasların mimarisindeki yapısal iyileştirme Masson'un üç renkli lekelenmesi ile değerlendirilebilir: Şekil 5F, tedavi edilen kastaki fibrotik doku miktarında bir azalma olduğunu göstermektedir.
Şekil 1. İletişim kuralı akış şeması. Şema, ön in vitro farklılaşma testlerinden (solda) engraftasyon, miyojenik potansiyel ve fonksiyonel iyileştirme in vivo ve ex vivo (sağda) değerlendirmek için gerekli çeşitli adımlara kadar IDEM tabanlı stratejiye genel bir bakış sağlar. Koyu gri kutular protokolde açıklanan çeşitli adımları içerir; açık gri kutular, bu makalede ayrıntılı olarak açık olmayan yöntemin bölümlerini içerir. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 2. Miyojenik potansiyel in vitro değerlendirmesi. (A) 4OH-tamoksifen maruz kaldıktan sonra 7 MyoD-ER transdüklenmiş MIDEM çekirdeğinin 4'ında nükleer MyoD ekspresyonunun gösterilmesini gösteren immünoresans. (B) Miyosin ağır zinciri (MyHC) için immünoresans lekelenmesi, farklılaşma ortamında bir hafta sonra 4OH-tamoksifen kaynaklı HIDEM türevi miyotüplerde (Ölçek çubuğu, 200 μm). Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 3. Akut kas rejenerasyon modelinde hücre gravürlerinin in vivo değerlendirilmesi. (A) 106 GFP-HIDEM (solda) ve GFP-MIDEM'lerin (ortada) intramüsküler enjeksiyonundan 2 hafta sonra ekilen yeni izole kardiyotoksin-yaralı tibialis ön kaslarının stereomikroskopik GFP floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu, 2 mm. (B) GFP pozitif miyofiberleri gösteren (A) olarak gösterilen MİDEM'lerle nakledilen kasın düşük (üst) ve yüksek (alt) büyütme resimleri. Ölçek çubuğu, 200 μm. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 4. Koşu bandı egzersiz tolerans testi. Nakledilenler için temsili koşu bandı testi (IM = intramüsküler; IA = intra-arteriyel). Sgca-null/scid/ bej fareler (106 hücre/enjeksiyon) ve nontransplanted distrofik ve nondystrofik kontrol immün yetmez fareler. Arsa, MİDEM'lerle nakledilen distrofik farelerin fonksiyonel iyileştiriciliğini gösterir (transplantasyondan 35 gün sonra nakledilmemiş hayvanlardan% 12-22 daha fazla). Veriler, taban çizgisi performanslarına göre ortalama motor kapasitesi olarak gösterilir(yani% 100, her grubun temel performansını temsil eder ve yalnızca tekrarlanan ölçümlerde tedavi edilen fareler önemli ölçüde iyileştirir). *P < 0,05; **P < 0.005, tek yönlü ANOVA. Yazarların daha önce yayınlanan çalışmalarından7. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Şekil 5. Kas distrofisinin fare modellerinde engraftment ve miyojenik potansiyelin in vivo değerlendirmesi. (A) 106 insanın intramüsküler enjeksiyonundan 3-4 hafta sonra (HIDEM'ler, sol; çocuk farelerde transplantasyon) ve murine (MİDEMler; sağda) GFP-IDEM'lerin taze izole edilmiş tibialis ön kaslarının stereomikroskopik GFP floresan görüntüleri. Ölçek çubuğu, 2 mm. (B) 106 GFP-MIDEM'in intra-arteriyel enjeksiyonundan 3 hafta sonra ekilen yeni izole edilmiş bir gastroknemius kasının stereomikroskopik GFP floresan görüntüsü. Ölçek çubuğu, 1 mm. (C) (A) GFP pozitif miyofiber kümesini gösteren MIDEM'lerde gösterilen mİYE'lerle nakledilen kasın taze donmuş enine bölümü. Ölçek çubuğu, 200 μm. (D) Aşılanmış IDEM'lerden kaynaklanan genetik olarak düzeltilmiş lif kümelerini gösteren kas içi nakledilen kasların (A'daolduğu gibi) bölümlerinde immünoresans lekelenmesi. Ölçek çubuğu, 150 μm. (E) Genetik olarak düzeltilmiş IDEM'lerin Sgca-null/scid/bej farelere intramüsküler naklinden bir ay sonra α-sarkoglen (Sgca)pozitif miyoberlerin nicelemesi. (F) Nakledilen tibialis ön kaslarının masson üç renkli lekesi ve tedavi edilen kaslarda fibrotik infiltratın azalmasını vurgulayan Sgca-null /scid/bej fareleri (kırmızı: kas lifleri; mavi: fibrozis) kontrol eder. Ölçek çubuğu, 200 μm. Daha büyük bir rakam görüntülemek için burayı tıklatın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSC'ler, kendi kendini yenileme potansiyellerini korurken süresiz olarak genişletilebilir ve böylece çok çeşitli hücre soylarına farklılaşmaya yönlendirilebilir12. Bu ve diğer nedenlerle iPSC türevi kök/progenitör hücreler otolog gen için umut verici bir kaynak olarak kabul edilir ve hücre tedavisi yaklaşır13. Authors'ın daha önce yayınlanan bir çalışması, perisit türevi MAB'lerin (IDEM'ler)kine benzer bir fenotipe sahip iPSC'lerden fare ve insan miyojenik atalarının neslini ve kas distrofisinin bir fare modelinde kas yenilenmesine verimli katkılarını bildirdi7.
IDEM miyojenik potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için bir ön koşul, hücrelerdeki miyojenik faktör MyoD'nin ekspresyonudur. Tamoksifen indükleyici MyoD-ER kaseti ile transdüksiyon, tüm kültürde ve daha sonra in vivoaktivasyonunu senkronize etmenin avantajı ile ifadesi üzerinde hassas bir zamansal kontrole sahip olmasını sağladı. Bu makalede, kas başına (veya femoral arter başına) hücrelerin tek bir yönetimine dayanan bir transplantasyon stratejisi açıklanmıştır. Bununla birlikte, tekrarlanan hücre enjeksiyonlarının farklı hücre tedavisi protokollerinde MAB engraftmentini artırmada etkili olduğu gösterilmiştir8. Bu nedenle, IDEM'lerle yetersiz sonuçlar olması durumunda, hücre dozajını artırmak ve dolayısıyla konak kaslara katkıda bulunmak için tekrarlanan transplantasyonlar yapmaya değer.
Sonuç ölçümleri, tedavi edilen hayvanların fenotipinin fonksiyonel iyileştiricisinde donör hücrelerin katkısının değerlendirilmesine izin verir. Koşu bandı ile yapılan egzersiz toleransı/dayanıklılık testine ek olarak, gönüllü motor kapasitesini(örneğin serbest çark testi), fiber kırılganlığını (örneğin Evans mavi boya alma testi) ve spesifik kuvveti(örneğin tek lifler veya tüm kas mekaniği) analiz etmek için daha fazla test8olarak kabul edilebilir. Fonksiyonel fenotip iyileştirmesini test etmek için ek yöntemler Treat-NMD web sitesinde standart işletim prosedürleri olarak mevcuttur(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
Nakledilen hayvanlardan önemli bilgiler toplamak için, hücre engraftment ve doku mimarisi / remodelingini değerlendirmek için fonksiyonel iyileştirme immünohistokimyasal ve histolojik analizlerle takip edilmeli ve doğrulanmalıdır. Özellikle, aşılanan kasların morfometrik yapısını, merkezi bir çekirdeğe sahip lif sayısını, miyofiberler kesit alanını ve fibrotik indeksi değerlendirmek gibi rejenerasyon ve fibrozis ayırt edici özellikleri için değerlendirmek önemlidir. İkinci analizler, işlevsel sonuçlarla birlikte stratejinin etkinliği hakkında kapsamlı bir genel bakış sunun. Ayrıca nakledilen hücrelerin benimsediği soyun dokuya katkı(yani miyofiberler) açısından izlenmesi ve kök hücre bölmesinin bakımı tüm hücre tedavi stratejilerinin uzun süreli etkinliği açısından önemlidir. Bu durumda, mezoangioblastların türetildiği perisit bölmesine donör kaynaklı katkı in vivo zaten bildirilmiştir7; ayrıca, ilk sonuçlar IDEM'lerin uydu hücre havuzuna işlevsel katkısını gösterir (Gerli ve Tedesco, yayınlanmamış sonuçlar). Düzeltilmiş genin(yani nicel PCR ve batı lekesi) engraftment ve ekspresyonunu gösteren moleküler analizler de kritiktir, ancak bu makalenin kapsamı dışındadır ve özel bir makale gerektirecektir.
Bu protokol esas olarak Sgca-null /scid/bej fareler7 (LGMD2D'nin yakın zamanda yayınlanan bir immün yetmezlik modeli) kullanılarak geliştirilmiş olsa da, diğer kas hastalığı modellerine kolayca uygulanabilmesi beklenebilir. Sgca-null / scid / bej durumunda, fareler kardiyotoksin kullanmadık, çünkü bu hayvanların kasları ciddi şekilde tehlikeye girer ve kronik olarak dejenerasyon ve rejenerasyon döngülerine maruz kalır (bu nedenle kardiotoksinden ek bir hasar gerekli değildir). Bununla birlikte, kardiyotoksin ile yapılan bir ön tedavinin daha hafif kas distrofisi modellerinde(örneğin mdx fareler) engraftasyonu kolaylaştırabileceğini dışlayamadık. Stratejimizin düzelticileri, fare konağının immün yetmezliğini (mevcut modellerde hala yetersiz olan) ve donör hücre gravürlerinin etkinliğini, özellikle ksenogeneik hücrelerin intra-arteriyel doğumunu artırmaya ilişkin yöntemleri içerebilir. Birden fazla hücre nakli ve juvenil farelerin kullanımı hücre engraftment7,8'in artmasına katkıda bulunsa da, insan hücrelerinin ekstravazasyon ve/veya göç sırasında karşılaştığı fare yapışma molekülleri, mevcut modellerin sınırlı immün yetmezliği için ek engeller oluşturabilir. Bu gen ve hücre tedavisi yaklaşımının klinik bir ortamda çevirisi için gelecekteki talimatlar, hücre ekstravazasyonunu ve hücreleri yeniden programlamak ve genetik olarak düzeltmek için nonintegrating vektörlerinin(örneğin plazmidler, mRNA'lar, insan yapay kromozomları veya nonintegrating viral vektörler) kullanımını geliştirmek için farmakolojik stratejiler içerebilir, böylece eklemesel mutajensis riskini önleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. uluslararası patent başvurusunda bulunmuştur (hayır. PCT/GB2013/050112) bu makalede açıklanan stratejinin bir bölümünü içerir. Promimetic ve DWC ltd. tarafından araştırmaları için fon aldı.
Acknowledgments
Yazarlar Giulio Cossu, Martina Ragazzi ve tüm laboratuvara yararlı tartışma ve destek için ve Jeff Chamberlain'e MyoD-ER vektörünü nazik olarak sağladığı için teşekkür ediyor. Canlı hayvanları içeren tüm deneyler, ilgili tüm düzenleyici ve kurumsal kurumlara, yönetmeliklere ve yönergelere uygun ve uygun olarak tamamlanmıştır. Yazarlar laboratuvarındaki çalışmalar İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi, Avrupa Topluluğu 7th Framework projeleri Optistem ve Biodesign ve İtalyan Duchenne Ebeveyn Projesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
