Summary
I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.
Abstract
Gli iPSC derivati dal paziente potrebbero essere una fonte inestimabile di cellule per i futuri protocolli di terapia cellulare autologa. Le cellule staminali/progenitrici miogeniche derivate da iPSC simili ai mesoangioblasti derivati dai periciti (cellule staminali/progenitrici simili a mesoangioblasti derivate da iPSC: IDEM) possono essere stabilite da iPSC generati da pazienti affetti da diverse forme di distrofia muscolare. Gli IDEM specifici del paziente possono essere corretti geneticamente con diversestrategie (ad esempio vettori lentivirali, cromosomi artificiali umani) e potenziati nel loro potenziale di differenziazione miogenica dopo l'iperespressione del regolatore di miogenesi MyoD. Questo potenziale miogenico viene quindi valutato in vitro con specifici saggi di differenziazione e analizzato per immunofluorescenza. Il potenziale rigenerativo degli IDEM viene ulteriormente valutato in vivo, su trapiantointramuscolare e intra-arterioso in due modelli rappresentativi di topo che mostrano rigenerazione muscolare acuta e cronica. Il contributo degli IDEM al muscolo scheletrico ospite è quindi confermato da diversi test funzionali nei topi trapiantati. In particolare, il miglioramento della capacità motoria degli animali viene studiato con prove sul tapis roulant. L'innesto e la differenziazione cellulare vengono quindi valutati da una serie di test istologici e immunofluorescenza sui muscoli trapiantati. Nel complesso, questo documento descrive i saggi e gli strumenti attualmente utilizzati per valutare la capacità di differenziazione degli IDEM, concentrandosi sui metodi di trapianto e sulle successive misure di risultato per analizzare l'efficacia del trapianto cellulare.
Introduction
I mesoangioblasti (MAB) sono progenitori muscolari associati ai vasi derivati da un sottoinsieme di periciti1-3. Il principale vantaggio dei MAB rispetto ai progenitori muscolari canonici come le cellule satellitari4 risiede nella loro capacità di attraversare la parete del vaso quando vengono consegnati intra-arteriosamente e quindi contribuire alla rigenerazione muscolare scheletrica nei protocolli di terapia cellulare. Questa caratteristica è stata valutata e confermata sia nei modelli murini che canini di distrofiamuscolare 1,5,6. Questi studi preclinici hanno gettato le basi per uno studio clinico di fase I/II del primo uomo basato sul trapianto intra-arterioso di MAB identici all'HLA del donatore nei bambini con distrofia muscolare di Duchenne (EudraCT n. 2011-000176-33; attualmente in corso all'Ospedale San Raffaele di Milano, Italia). Uno dei principali ostacoli degli approcci di terapia cellulare, in cui sono necessari miliardi di cellule per trattare il muscolo di un intero corpo, è il limitato potenziale proliferatore del "medicinale" (le cellule). Inoltre è stato recentemente dimostrato che non è possibile ottenere MAB da pazienti affetti da alcune forme di distrofia muscolare, come si verifica nella distrofia muscolare degli arti-cintura 2D (LGMD2D; OMIM #608099)7.
Per superare questi limiti, è stato recentemente istituito un protocollo per derivare cellule staminali/progenitrici simili a MAB da IPSC umani emurini 7. Questa procedura genera popolazioni cellulari facilmente espandibili con una firma genica vascolare e immunofenotipo altamente simile ai MAB derivati dai muscoli adulti. Dopo l'espressione del fattore regolatore miogenico MyoD, sia gli IDEM murini che umani (rispettivamente MIDEM e HIDEM) subiscono una differenziazione muscolare scheletrica terminale. Per raggiungere questo obiettivo gli IDEM possono essere trasdotti con vettori in grado di guidare l'espressione MyoD, in modo costitutivo o inducibile8-10. Viene utilizzato un vettore lentivirale contenente MyoD cDNA fuso con il recettore degli estrogeni (MyoD-ER), consentendo così la sua traslocazione nucleare su somministrazione di tamoxifene (un analogo estrogenico)11. Questa strategia si traduce nella formazione di miotubi ipertrofi multinucleati, ad alta efficienza7. In particolare, gli IDEM non sonotumorigeni, possono innestarsi e differenziare i muscoli ospiti al momento del trapianto e possono essere geneticamente corretti utilizzando diversi vettori(ad esempio lentivirus o cromosomi artificiali umani), aprendo la strada a future strategie terapeutiche autologhe. La derivazione, la caratterizzazione e il trapianto di IDEM sono stati descritti nella pubblicazione 7 di cuisopra. Questo documento di protocollo descrive in dettaglio i test eseguiti per valutare la differenziazione miogenica in vitro degli IDEM e le successive misurazioni dei risultati per testare l'efficacia del loro trapianto nei modelli di topo di rigenerazione muscolare.
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Protocol
1. Valutazione del potenziale miogenico e di innesto
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In vitro:differenziazione indotta da MyoD
- Generare una linea cellulare stabile di IDEM trasdotti con il vettore lentivirale MyoD-ER inducibile al tamoxifene, che titra la molteplicità dell'infezione (MOI; ad esempio 1, 5 e 50) utilizzando la colorazione descritta al punto 1.1.9 (MyHC) come risultato dell'efficienza della procedura.
- Ricoprire un piatto da 3,5 cm con 1 ml di 1% di Matrigel e incubare per 30 min a 37 °C.
- Lavare il piatto due volte con iDEM trasdotti medium, seme 1 x10 5 MyoD-ER nel piatto di coltura tissutale da 3,5 cm e incubare a 37 °C nel mezzo di crescita.
- Aspettatevi che le cellule raggiungano la confluenza in uno o due giorni e quindi aggiungete 1 μM 4OH-tamoxifene nel mezzo di crescita (1dose di st).
- Dopo 24 ore, sostituire il mezzo di crescita con un mezzo di differenziazione integrato con 1 μM 4OH-tamoxifene(2 nd e ultima dose).
- Sostituire metà del mezzo con un mezzo di differenziazione fresco a giorni diversi.
- Esamina quotidianamente le culture per la formazione di miotubi.
- Dopo una settimana (5 giorni in mezzo di differenziazione), lavare delicatamente le piastre con PBS e fissare con paraformaldeide al 4 % per 5 minuti a RT.
- Eseguire una colorazione immunofluorescenza con anticorpi contro la catena pesante della miosina (MyHC) per confermare la presenza di miotubi. Controsostenimento con uncolorante nucleare (ad esempio Hoechst).
L'efficienza della differenziazione viene valutata come percentuale di nuclei all'interno delle cellule positive myhc: procedere al passaggio successivo se l'efficienza è >50%.
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In vivo: innesto in un modello di rigenerazione muscolare acuta
Per valutare il contributo in vivo degli IDEM MyoD-ER alla rigenerazione muscolare, le cellule sono precedentemente etichettate con una codifica vettoriale per la proteina fluorescente verde (GFP) che consentirà di rintracciarle all'interno del tessuto. Gli IDEM MyoD-ER GFP vengono quindi iniettati nei muscoli murini adulti, precedentemente feriti con una miotoxina(ad esempio cardiotossina). Per evitare il rigetto immunitario contro cellule xenogeneiche (come HIDEM) o geneticamente manipolate / corrette è necessario utilizzare topi immunodifesa o immunosoppressi.- Pretrattare gli animali con un'iniezione intra-peritoneale di 3,5 μl/g di 10 mg/ml di tamoxifene (forma liposolubile) 24 ore prima del trapianto e delle cellule pretrattate aggiungendo 1 μM 4OH-tamoxifene (forma acquosa) nel mezzo di crescita durante la notte prima del giorno del trapianto.
- Somministrare anestesia e analgesia al topo seguendo le linee guida specifiche che regolano le procedure chirurgiche nella struttura animale.
- Iniettare 25 μl di cardiotossina 100 μM (CTX; da Naja mossambica mossambica; ATTENZIONE: sostanza potenzialmente dannosa) nei muscoli anteriori (TA) tibiali.
- 24 ore dopo aver trattato gli animali con tamoxifene e CTX, staccare le cellule per tripsicinazione e conteggio.
- Centrifugare le cellule a 232 x g per 5 min.
- Lavare il pellet cellulare in PBS privo di Ca2+e Mg2+,centrifugare e quindi rimosogliere delicatamente il pellet cellulare in CA2+- e Mg2+-free PBS a una concentrazione finale di 106 cellule / 30 μl, che sarà il volume finale di ogni iniezione.
- Iniettare 30 μl di sospensione cellulare nei muscoli precedentemente feriti usando una siringa con ago da 29 o 30 G. Prestare particolare attenzione durante la rimozione dell'ago dal muscolo. Fallo lentamente, evitando di versare la sospensione cellulare attraverso la pista dell'ago. Non trapiantare l'TA contralaterale e utilizzarlo come controllo, iniettando 30 μl di PBS privo di Ca2+ e Mg2+per replicare le condizioni di quello trapiantato.
- Trattare gli animali con tamoxifene per altri sei giorni e somministrare l'analgesia(ad esempio Carprofen) per altri due giorni.
- Espiantare i muscoli da 14 giorni dopo il trapianto in poi. Elaborare e analizzare i campioni come descritto nei protocolli 4 e 5.
2. Trapianto in modelli di topo di distrofia muscolare
Questo test di trapianto consente di valutare l'entità dell'innesto degli IDEM nei modelli di topo di distrofia muscolare. Gli animali, trattati come segue, possono anche essere valutati per il miglioramento funzionale del fenotipo della malattia. I test funzionali possono essere eseguiti a partire da due settimane dopo il trapianto. Al fine di migliorare l'innesto, prendere in considerazione l'esecuzione di esercizi di tapis roulant pretrapianto (come descritto nel protocollo 3)e/o iniezioni di cellule seriali ogni tre settimane per 3x (cioè per un totale di 3 iniezioni/muscoli).
- Trapianto intramuscolare
- Pretrattare gli animali con un'iniezione intra-peritoneale di 3,5 μl/g di 10 mg/ml di tamoxifene (formulazione liposolubile) 24 ore prima del trapianto e delle cellule pretrattate aggiungendo 1 μM 4OH-tamoxifene (formulazione acquosa) nel mezzo di crescita durante la notte prima del giorno del trapianto.
- Staccare per tripsicinazione, contare e centrifugare le cellule a 232 x g per 5 min.
- Lavare il pellet cellulare in PBS privo di CA2+e Mg2+,centrifugare e quindi rimosogliere il pellet in CA2+- e Mg2+-free PBS a una concentrazione di 106 cellule/30 μl.
- Somministrare analgesia e disinfettare la pelle dell'animale (facoltativo) con un disinfettante a base di iodio povidone o cloridodidina. Questo aiuterà anche a localizzare i muscoli tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) e quadriceps femoris (QC; in particolare il vastus intermedius).
- Iniettare 30 μl di sospensione cellulare nei muscoli usando una siringa con ago da 29 o 30 G. Per il TA, inserire 5 mm dell'ago 2 mm sotto l'inserimento del tendine prossimale (direzione craniocaudale) con un'inclinazione di 15° rispetto alla tibia e iniettare lentamente la sospensione cellulare mentre si ritrae l'ago (svuotare la siringa con 2 mm dell'ago ancora all'interno del muscolo). Per il GC e il QC, ripetere la stessa procedura dettagliata per il TA, con la differenza principale è l'inserimento caudocranica dell'ago 2 mm sopra la giunzione miotendinosa del tendine d'Achille per il GC e 2 mm sopra il tendine distale per il QC (inclinazione di 15° rispetto al femore). Prestare attenzione mentre si rimuove l'ago dal muscolo per evitare di versare la sospensione cellulare attraverso la pista dell'ago.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: In caso di basso innesto prendere in considerazione l'iniezione di topi giovani (1-2 settimane)7 con 3 x 105 cellule / 10 μl (si noti che in questo caso il tamoxifene deve essere somministrato per via sottocutanea).
- Trapianto intra-arterioso
Questa parte del protocollo consente la valutazione della capacità dei MIDEM e dei HIDEM di essere erogata nella circolazione arteriosa, attraversare la parete del vaso e contribuire alla rigenerazione muscolare scheletrica nei muscoli a valle del sito di iniezione.- Pretrattare animali e cellule come descritto sopra nella fase 2.1.1.
- Staccare per tripsicinazione e filtrare con un filtro cellulare da 40 μm (per rimuovere i cluster dalla sospensione cellulare nell'improbabile caso in cui l'esposizione notturna al tamoxifene possa guidare la fusione e la formazione di miotubi dalle cellule adiacenti) contare e centrifugare le cellule a 232 x g per 5 minuti
- Lavare il pellet cellulare in PBS privo di CA2+e Mg2+,centrifugare e quindi rimosogliere il pellet in CA2+- e Mg2+-free PBS con 0.2 International
Unità di eparina di sodio (facoltativa) ad una concentrazione cellulare finale di 106 cellule/50 μl. Aggiungere alla soluzione colorante blu brevettato al 10% (concentrazione finale: 1,25 mg/ml in soluzione salina normale o Ca2+- e Mg2+-free PBS) al fine di visualizzare la distribuzione della sospensione cellulare. - Somministrare anestesia e analgesia al topo secondo le linee guida che regolano le procedure chirurgiche nello specifico impianto animale istituzionale.
- Radere la regione inguinale ( conosciamo anche come femorale o triangolo di Scarpa) e disinfettare la pelle con un disinfettante a base di iodio povidone o clorexidina.
- Fai un'incisione di 5-7 mm e localizza il fascio femorale: vena, arteria e nervo (il nervo si sdraia lateralmente all'arteria e alla vena medialmente).
- Rimuovere delicatamente la fascia connettiva che copre il fascio con forcep.
- Separare la vena femorale e il nervo dall'arteria introducendo delicatamente la punta di una pinga (o un ago da 30 G) tra di loro e allargando progressivamente il foro.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: La vena femorale è fragile: prestare attenzione a non pizzicarla con le forcep durante il suo distacco dall'arteria femorale. In caso di emorragia, scolare il sangue con garza sterile e utilizzare un micro cauterizzatore per facilitare l'emostasi. - Sollevare l'arteria con una punta delle pinze e bloccare l'arteria con l'altra punta.
- Forare l'arteria con una siringa dotata di un ago da 30 G. Iniettare 50 μl di sospensione cellulare a valle dell'area bloccata, ad una velocità di infusione di circa 5 μl/sec.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: Risospendare con cura le cellule nella siringa prima dell'iniezione: è fondamentale evitare la precipitazione delle cellule e la formazione di bolle d'aria all'interno della siringa. Il diametro dell'arteria femorale è leggermente inferiore a un ago da 30 G: fare attenzione a non troncare l'arteria mentre si inserisce l'ago. La tintura blu brevettata consente di riconoscere l'efficacia dell'iniezione: se correttamente iniettata, l'intero arto diventerà rapidamente azzurro. - Rimuovere lentamente l'ago e le pinai dall'arteria per ripristinare il flusso sanguigno nell'arto.
- Applicare pressione con garza sterile per evitare sanguinamento e/o cauterizzare a richiesta.
- Suturare la ferita e monitorare gli animali fino al recupero dall'anestesia.
- Somministrare l'analgesia per 3 giorni e ispezionare la ferita ogni giorno (in caso di infezione da ferita discuterne con il personale della struttura animale e somministrare antibiotici come richiesto).
3. Misure di esito sugli animali distrofici trapiantati: test del tapis roulant
A partire da due settimane dopo il trapianto di cellule, è possibile valutare il miglioramento funzionale della capacità motoria dei topi trattati con i test del tapis roulant. Questo test consente la valutazione della tolleranza/resistenza all'esercizio fisico dei topi trattati. Un topo è considerato affaticato quando si trova nell'area di riposo per più di 5 secondi, senza tentare di riimpiegnare il tapis roulant dopo una serie di 3 stimoli meccanici consecutivi (uno ogni 5 secondi). Le misurazioni di base iniziano circa un mese prima del trattamento e vengono utilizzate per valutare il miglioramento di ogni singolo animale testato. Questo test può essere seguito da ulteriori test per monitorare la fragilità della fibra, il miglioramento della forza, l'innesto, la differenziazione delle cellule trapiantate e l'miglioramento morfologico dei muscoli trapiantati (vedi Discussione).
- Acclimatare gli animali (di solito tre gruppi: controlli di tipo trattato, non trattati e selvatici / non distrofici) all'esercizio prima della prima misurazione: impostare il tapis roulant a una velocità di 6 m / min per 10 minuti. Ripetere la procedura a giorni diversi per una settimana.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: Registrare tutte le misurazioni alla stessa ora del giorno per evitare distorsioni dovute ai cicli circadiani. - Posizionare gli animali nel tapis roulant, che è stato precedentemente impostato con un'inclinazione di 10°.
- Accendere il tapis roulant, con una velocità di partenza di 6 m/min (fornire un delicato stimolo meccanico nel caso in cui gli animali non siano disposti ad iniziare l'esercizio).
- Avviare il timer e aumentare la velocità 2 m / min ogni 2 minuti.
- Non appena un animale giace nell'area di riposo per più di 5 secondi senza tentare di riimpiecare il tapis roulant, toccarlo delicatamente con un bastone per stimolare il riavvio dell'esercizio (vedi sopra).
- Registrare le prestazioni (tempo e o distanza) di ogni animale.
- Ripetere le misurazioni settimanalmente o ogni 10 giorni per almeno 3 volte.
- Ripetere la stessa procedura dopo il trapianto.
- Analizza i dati sulle prestazioni confrontando la misurazione di ogni animale con le sue prestazioni di base. Si consiglia di tracciare i valori in un grafico come percentuale della capacità motoria media rispetto al basale e di analizzarli mediante un test ANOVA a uno o due modi seguito da un post-test appropriato per confrontare i gruppi.
RISOLUZIONE DEI PROBLEMI: utilizzare almeno 5 animali/gruppi di età, genotipo e sesso e ripetere le misurazioni per almeno 3 volte dopo il trapianto.
4. Valutazione dell'innesto cellulare e differenziazione nei muscoli trapiantati
I muscoli trapiantati e di controllo vengono raccolti nel momento appropriato (<2 giorni per l'analisi dell'innesto a breve termine, 2-3 settimane per il medio termine e >1 mese per l'analisi a lungo termine). Se le cellule trapiantate sono etichettate con GFP, l'innesto nei muscoli appena isolati può essere valutato mediante fluorescenza diretta sotto uno stereomicroscopio dotato di UV.
- Posare e orientare lungo l'asse verticale muscoli appena isolati nella gomma tragachanth (6% w/v)
- Disidratare i campioni in isopentane prechilled per un minuto, congelarli in azoto liquido per almeno 2 minuti e posizionarli immediatamente a -80 °C per la conservazione.
- Elaborare i campioni con un criostato per ottenere sezioni spesse 7 μm su diapositive polarizzate. Campionare la maggior parte del muscolo sulle diapositive, raccogliendo circa 8-10 diapositive con 30-40 sezioni / scivolo. Si consiglia di raccogliere una serie di sezioni in un tubo da 1,5 ml per eseguire test di biologia molecolare / biochimica.
- Valutare l'innesto cellulare con diverse colorazioni immunofluorescenti, a seconda della configurazione sperimentale. Ad esempio, in caso di trapianto HIDEM in topi Sgca-null/scid/bg, sezioni di macchia con: a) un anticorpo contro Lamin A/C per rilevare nuclei cellulari umani innestati; b) un anticorpo contro Laminin per visualizzare la struttura complessiva del muscolo; e c) un anticorpo contro Sgca per rilevare il ripristino della proteina assente nell'animale distrofo.
- Quantificare, utilizzando un microscopio a fluorescenza, il numero di nuclei donatori per sezione muscolare all'interno e all'esterno delle fibre muscolari e il numero di miofibre scheletriche derivate dal donatore per sezione.
5. Istopatologia muscolare
Le analisi istopatologiche consentono la valutazione della struttura morfologica del muscolo trapiantato. Il miglioramento architettonico della struttura tissutale è previsto come risultato dell'approccio di terapia cellulare.
- Fissare i muscoli appena isolati con paraformaldeide al 4% per 1 ora a 4 °C.
- Disidratare i campioni con un gradiente crescente di saccarosio(ad esempio 7,5-15-30% w/v).
- Lasciare i muscoli durante la notte nella soluzione di saccarosio più alta.
- Incorporare i campioni in Tissue Tek OCT, metterli in isopentane prechilled fino a quando lo OCT diventa solido (evitando l'immersione completa dei campioni), congelarli in azoto liquido per almeno 2 minuti e posizionarli immediatamente a -80 °C per la conservazione.
- Elaborare i campioni con un criostato per ottenere sezioni spesse 7 μm come descritto sopra.
- Macchiare le sezioni con ematossilina ed eosina o tricromo di Masson secondo i protocolli standard del produttore.
La colorazione di ematossilina ed eosina consente di calcolare i tratti distintivi del muscolo rigenerante, come: a) il numero di miofibre; b) area di sezione trasversale; e) il numero di miofibre contenenti un nucleo centrale. Il tricromo di Masson viene utilizzato per calcolare l'indice fibrotico, fatto sottraendo l'area totale occupata dalle miofibre scheletriche dall'area totale dell'immagine: l'area risultante riflette principalmente l'infiltrato connettivo e grasso del muscolo. Tutte le analisi sulle immagini potrebbero essere eseguite utilizzando il software ImageJ (NIH) con lo strumento di misurazione e il plug-in del contatore delle celle.
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Representative Results
I risultati rappresentativi riportati seguono i principali saggi in vitro/in vivo descritti nel flusso di lavoro nella figura 1. 48 ore dopo la somministrazione di 4OH-tamoxifene I nuclei mioD-positivi sono identificabili all'interno degli IDEM trasdotti MyoD-ER incoltura (Figura 2A). Le celle si fondono e si differenziano quindi in miotubi multinucleati (Figura 2B). Se trapiantati per via intramuscolare in un modello murino di lesione muscolare acuta, gli IDEM contribuiscono alla rigenerazione dei tessuti (Figura 3). L'efficacia degli IDEM in un ambiente gene-e-terapia cellulare per i modelli murini di distrofia muscolare è stata valutata dal test di tolleranza all'esercizio del tapis roulant: La figura 4 mostra i risultati ottenuti dopo il trapianto di MID OEM di tipo selvatico in topi Sgca-null/scid/beige, mostrando un miglioramento della capacità motoria nei topitrattati 7. Le analisi ex vivo dei muscoli trapiantati mostrano aree positive alla GFP che rappresentano l'estensione della colonizzazione degli IDEM nel tessuto ospite (Figure 5A-C), dimostrando così che le cellule donatrici si innesto nel muscolo distrofo. È importante sottolineare che le cellule trapiantate sono in grado di differenziarsi in vivo,formando nuove miofibre scheletriche. In effetti, la figura 5 mostra l'espressione Sgca da HIDEM geneticamente corretti in topi Sgca-null/scid/beige (figure 5D e 5E). L'miglioramento strutturale nell'architettura dei muscoli trapiantati può essere valutato attraverso la colorazione tricromatica di Masson: la figura 5F mostra una diminuzione della quantità di tessuto fibrotico nel muscolo trattato.
Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo. Lo schema fornisce una panoramica della strategia basata sull'IDEM, dai saggi preliminari di differenziazione in vitro (a sinistra) alle varie fasi necessarie per valutare l'innesto, il potenziale miogenico e l'miglioramento funzionale in vivo ed ex vivo (a destra). Le scatole grigio scuro contengono i vari passaggi descritti nel protocollo; le caselle grigio chiaro contengono parti del metodo non dettagliate in questo articolo. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
Figura 2. Valutazione del potenziale miogenico in vitro. (A) Immunofluorescenza che mostra l'espressione del MioD nucleare in 4 nuclei MIDEM trasdotti MyoD-ER su 7 dopo 48 ore di esposizione a 4OH-tamoxifene. (B) Colorazione ad immunofluorescenza per catena pesante di miosina (MyHC) su miotubi derivati hidem indotti da 4OH-tamoxifene dopo una settimana in mezzo di differenziazione (barra di scala, 200 μm). Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
Figura 3. Valutazione in vivo dell'innesto cellulare in un modello di rigenerazione muscolare acuta. (A) Immagini di fluorescenza stereomicroscopica della GFP di muscoli anteriori tibiali feriti da cardiotossine appena isolati esplantati 2 settimane dopo iniezione intramuscolare di 106 GFP-HIDEM (a sinistra) e GFP-MIDEM (al centro). Barra di scala, immagini di ingrandimento basse (in alto) e alte (in basso) del muscolo trapiantato con MIDEM mostrate in (A) che mostrano le miofibre positive alla GFP. Barra di scala, 200 μm. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
Figura 4. Test di tolleranza all'esercizio del tapis roulant. Test rappresentativo del tapis roulant per trapiantato (IM = intramuscolare; IA = intra-arteriosa). Topi Sgca-null/scid/ beige (106 cellule/iniezione) rispetto ai topi immunodifesa di controllo distrofici e non didistrofici non trasimpiantati. La trama mostra un miglioramento funzionale dei topi distrotrofi trapiantati con MIDEM (12-22% in più rispetto agli animali non trasimpiantati 35 giorni dopo il trapianto). I dati sono mostrati come capacità motoria media rispetto alle prestazioni di base (cioè il 100% rappresenta le prestazioni di base di ciascun gruppoe solo i topi trattati lo migliorano significativamente su misurazioni ripetute). *P < 0,05; **P < 0,005, ANOVA uni-way. Da lavori pubblicati in precedenza degli autori7. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
Figura 5. Valutazione in vivo dell'innesto e del potenziale miogenico nei modelli di topo di distrofia muscolare. (A) Immagini di fluorescenza stereomicroscopica della GFP di muscoli anteriori tibiali appena isolati di topi Sgca-null/scid/beige espiantati 3-4 settimane dopo iniezione intramuscolare di 106 cellule umane (HIDEM, a sinistra; trapianto in topi giovani) e murine (MIDEM; destra) GFP-IDEM. Barra di scala, 2 mm (B) Immagine di fluorescenza stereomicroscopica GFP di un muscolo gastrocnemio appena isolato espiantato 3 settimane dopo iniezione intra-arteriosa di 106 GFP-MIDEM. Barra di scala, 1 mm. (C) Sezione trasversale congelata fresca del muscolo trapiantato con MIDEM mostrata in (A) che mostra un gruppo di miofibre positive alla GFP. Barra di scala, 200 μm. (D) Colorazione immunofluorescenza su sezioni di muscoli trapiantati intramuscolari (come in A)che mostrano ammassi di fibre geneticamente corrette, originate da IDEM innestati. Barra di scala, 150 μm. (E) Quantificazione delle miofibre positive al α-sarcoglicano (Sgca) un mese dopo il trapianto intramuscolare di IDEM geneticamente corretti in topi Sgca-null/scid/beige. (F) Colorazione tricromatica masson dei muscoli anteriori della tibialis da topi Sgca-null/scid/beige trapiantati e di controllo (rosso: fibre muscolari; blu: fibrosi) evidenziando la riduzione dell'infiltrato fibrotico nel muscolo trattato. Barra di scala, 200 μm. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.
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Discussion
Gli iPSC possono essere espansi indefinitamente preservando il loro potenziale di auto-rinnovamento e quindi essere diretti a differenziarsi in un'ampia gamma di lignaggicellulari 12. Per questo e altri motivi le cellule staminali/progenitrici derivate da iPSC sono considerate una fonte promettente per gli approcci autologi di terapia genica e cellulare13. Un lavoro pubblicato in precedenza dagli Autori ha riportato la generazione di progenitori miogenici di topi e umani da iPSC con un fenotipo simile a quello dei MAB (IDEM) derivati dai periciti e il loro efficace contributo alla rigenerazione muscolare in un modello di topo di distrofiamuscolare 7.
Un prerequisito per massimizzare il potenziale miogenico IDEM è l'espressione del fattore miogenico MyoD nelle cellule. La trasduzione con una cassetta MyoD-ER induttiva tamoxifene ha permesso di avere un preciso controllo temporale sulla sua espressione con il vantaggio di sincronizzarne l'attivazione in tutta la coltura e successivamente in vivo. Una strategia di trapianto basata su una singola somministrazione di cellule per muscolo (o per arteria femorale) è stata descritta in questo articolo. Tuttavia, le iniezioni ripetute di cellule hanno dimostrato di essere efficaci nell'aumentare l'innesto di MAB nei diversi protocolli di terapiacellulare 8. Pertanto, in caso di risultati non ottimali con IDEM, vale la pena eseguire trapianti ripetuti per aumentare il dosaggio cellulare e quindi, contributo al muscolo ospite.
Le misurazioni dei risultati consentono di valutare il contributo delle cellule donatrici al miglioramento funzionale del fenotipo degli animali trattati. Oltre al test di tolleranza/resistenza all'esercizioeseguito con il tapis roulant, possono essere considerati 8 ulteriori test per analizzare la capacità motoria volontaria(ad esempio test a ruota libera), fragilità della fibra (ad esempio test di assorbimento del colorante blu Evans) e forza specifica(ad esempio fibre singole o meccanica muscolareintera). Ulteriori metodi per testare l'ameliorazione del fenotipo funzionale sono disponibili come procedure operative standard nel sito Web Treat-NMD (http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
Per raccogliere informazioni significative dagli animali trapiantati, l'ameliorazione funzionale deve essere seguita e convalidata da analisi immunoistochimiche e istologiche, per valutare l'innesto cellulare e l'architettura/rimodellamento dei tessuti. In particolare, è importante valutare la struttura morfometrica dei muscoli innestati per i segni distintivi di rigenerazione e fibrosi, come la valutazione del numero di fibre con un nucleo centrale, l'area della sezione trasversale delle miofibre e l'indice fibrotico. Queste ultime analisi, unitamente ai risultati funzionali, forniscono una panoramica esaustiva sull'efficacia della strategia. Inoltre, il monitoraggio della discendenza adottata dalle cellule trapiantate in termini di contributo al tessuto (cioè miofibre) e il mantenimento del compartimento delle cellule staminali è importanteper l'efficacia a lungo termine di tutte le strategie di terapia cellulare. In questo caso, è già stato segnalato il contributo derivato dal donatore in vivo al compartimento dei periciti da cui derivano i mesoangioblasti7; inoltre, i risultati preliminari indicano il contributo funzionale degli IDEM anche al pool di celle satellitari (Gerli e Tedesco, risultati inediti). Anche le analisi molecolari perdimostrare l'innesto e l'espressione del gene corretto (cioè PCR quantitativo e macchia occidentale) sono critiche, ma esulano dall'ambito di questo documento e richiederebbero un articolo dedicato.
Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato principalmente utilizzando topi Sgca-null/scid/beige7 (un modello immunodifeso recentemente pubblicato di LGMD2D), si prevede che potrebbe essere facilmente applicabile ad altri modelli di malattia muscolare. Nel caso di Sgca-null/scid/beige, i topi non abbiamo usato la cardiotossina, poiché i muscoli di questi animali sono gravemente compromessi e cronicamente soggetti a cicli di degenerazione e rigenerazione (quindi non è necessario un ulteriore danno da cardiotossina). Tuttavia, non possiamo escludere che un pretrattamento con cardiotossina possa facilitare l'innesto in modelli più lievi di distrofiamuscolare (ad esempio topi mdx). Le miglioriazioni della nostra strategia possono includere metodi per migliorare l'immunodeficienza dell'ospite del topo (che negli attuali modelli è ancora non ottimale) e l'efficacia dell'innesto delle cellule donatrici, in particolare sull'erogazione intra-arteriosa di cellule xenogeneiche. Sebbene il trapianto di cellule multiple e l'uso di topi giovani contribuiscano all'aumento dell'innestocellulare 7,8, le molecole di adesione del topo incontrate dalle cellule umane durante l'estravasazione e/o la migrazione potrebbero porre ulteriori ostacoli alla limitata immunodeficienza dei modelli attuali. Le direzioni future per la traduzione di questo approccio di terapia genica e cellulare in un contesto clinico possono includere strategie farmacologiche per migliorare l'estravasione cellularee l'uso di vettori non integrati (ad esempio plasmidi, mRNA, cromosomi artificiali umani o vettori virali non integrati) per riprogrammare e correggere geneticamente le cellule, evitando così il rischio di mutagenesi inserimento.
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Disclosures
F.S.T. ha presentato una domanda di brevetto internazionale (n. PCT/GB2013/050112) inclusa parte della strategia descritta in questo articolo. Ha ricevuto finanziamenti da Promimetic e DWC ltd. per la sua ricerca.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Giulio Cossu, Martina Ragazzi e tutto il laboratorio per utili discussioni e supporto, e Jeff Chamberlain per aver gentilmente fornito il vettore MyoD-ER. Tutti gli esperimenti che coinvolgono animali vivi sono stati completati in conformità e nel rispetto di tutte le agenzie, i regolamenti e le linee guida normative e istituzionali pertinenti. Il lavoro nel laboratorio degli autori è supportato dal Consiglio per la ricerca medica del Regno Unito, dai progetti quadro della Comunità europea Optistem e Biodesign e dal progetto madre italiano Duchenne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
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Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
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References
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