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Bioengineering

मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50532
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Division of Regenerative Medicine, Stem Cells and Gene Therapy, San Raffaele Hospital
* These authors contributed equally

Summary

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न मायोजेनिक जनकों मांसपेशियों के डिस्ट्रोफी के इलाज के लिए सेल थेरेपी रणनीतियों के लिए आशाजनक उंमीदवार हैं । यह प्रोटोकॉल तीव्र और पुरानी मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में आईपीएससी-व्युत्पन्न मेसोपियोब्लास्ट (मांसपेशियों के जनकों का एक प्रकार) के एनग्रफ्टमेंट और भेदभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक प्रत्यारोपण और कार्यात्मक माप का वर्णन करता है।

Abstract

रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी भविष्य के ऑटोलॉगस सेल थेरेपी प्रोटोकॉल के लिए कोशिकाओं का एक अमूल्य स्रोत हो सकता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न मायोजेनिक स्टेम/जनक कोशिकाएं पेरिसाइट-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट (आईपीएससी-व्युत्पन्न मेसोपियोब्लास्ट-जैसे स्टेम/जनक कोशिकाएं: आईडीईएम) को मस्कुलर डिस्ट्रॉफी के विभिन्न रूपों से प्रभावित रोगियों से उत्पन्न आईपीएससी से स्थापित किया जा सकता है । रोगी-विशिष्ट आईडीईएम को आनुवंशिक रूप से विभिन्न रणनीतियों(जैसे लेंटीवायरल वैक्टर, मानव कृत्रिम गुणसूत्रों) के साथ ठीक किया जा सकता है और मायोजेनेसिस नियामक मायोडी के अतिव्यक्तीकरण पर उनकी मायोजेनिक भेदभाव क्षमता में वृद्धि की जा सकती है। इस मायोजेनिक क्षमता को विशिष्ट विभेदन परख के साथ विट्रो में मूल्यांकन किया जाता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा विश्लेषण किया जाता है। तीव्र और पुरानी मांसपेशियों के उत्थान को प्रदर्शित करने वाले दो प्रतिनिधि माउस मॉडलों में इंट्रामस्कुलर और इंट्रा-धमनी प्रत्यारोपण पर, वीएईएमएसकी पुनर्योजी क्षमता का मूल्यांकन किया जाता है। मेजबान कंकाल की मांसपेशी के लिए IDEMs के योगदान तो प्रत्यारोपित चूहों में विभिन्न कार्यात्मक परीक्षणों द्वारा पुष्टि की है। विशेष रूप से, ट्रेडमिल परीक्षणों के साथ जानवरों की मोटर क्षमता के सुधार का अध्ययन किया जाता है। सेल एनग्रेक्शन और भेदभाव तब प्रत्यारोपित मांसपेशियों पर कई हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। कुल मिलाकर, यह पत्र वर्तमान में आईडीईएम की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले परख और उपकरणों का वर्णन करता है, जो प्रत्यारोपण विधियों और बाद के परिणाम उपायों पर ध्यान केंद्रित करता है ताकि सेल प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता का विश्लेषण किया जा सके।

Introduction

मेसोपियोब्लास्ट (एमएबी) पेरिसाइट्स1-3के सबसेट से प्राप्त पोत-संबद्ध मांसपेशी जनक हैं। उपग्रह कोशिकाओं 4 जैसे विहित मांसपेशी जनकों पर एमएबी का मुख्य लाभअंतर-धमनी वितरित होने पर पोत की दीवार को पार करने की क्षमता में रहता है और इसलिए सेल थेरेपी प्रोटोकॉल में कंकाल मांसपेशी उत्थान में योगदान देता है। मस्कुलर डिस्ट्रॉफी1,5,6के मुरीन और कैनाइन दोनों मॉडलों में इस सुविधा का मूल्यांकन और पुष्टि की गई है। इन प्रीक्लीनिकल अध्ययनों ने ड्यूचेर्न मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (यूड्रैक्ट नंबर 2011-000176-33) के साथ बच्चों में दाता एचएलए-समान एमएबी के अंतर-धमनी प्रत्यारोपण के आधार पर प्रथम-इन-मैन चरण I/II नैदानिक परीक्षण के लिए नींव का निर्माण किया है; वर्तमान में मिलान, इटली के सैन रफले अस्पताल में जा रहा है । सेल थेरेपी दृष्टिकोण की मुख्य बाधाओं में से एक, जहां पूरे शरीर की मांसपेशियों के इलाज के लिए अरबों कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, "औषधीय उत्पाद" (कोशिकाओं) की सीमित प्रसार क्षमता है। इसके अलावा यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि मांसपेशियों के डिस्स्ट्रोफी के कुछ रूपों से प्रभावित रोगियों से एमएबी प्राप्त करना संभव नहीं है, क्योंकि यह अंग-करधनी मस्कुलर डिस्ट्रॉफी 2D (एलजीएमडी2डी) में होता है; OMIM #608099)7।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, मानव और मुरीन आईपीएससी से MAB की तरह स्टेम/जनक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल हाल ही में7 स्थापितकिया गया है । यह प्रक्रिया वयस्क मांसपेशी-व्युत्पन्न एमएबी के समान एक संवहनी जीन हस्ताक्षर और इम्यूनोफेनोटाइप के साथ आसानी से विस्तारयोग्य कोशिका आबादी उत्पन्न करती है। मायोजेनिक नियामक कारक मायोड की अभिव्यक्ति पर, मुरीन और मानव आईडीईएम (क्रमशः एमआईईएम और एडीईएम) दोनों टर्मिनल कंकाल मांसपेशियों के भेदभाव से गुजरते हैं। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए आईडीईएम को मायोडी अभिव्यक्ति को चलाने में सक्षम वैक्टर के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है, या तो संविलियन या एक प्रेरक फैशन8-10में। एस्ट्रोजन रिसेप्टर (मायोडी-ईआर) के साथ जुड़े मायोडी सीडीएनए युक्त एक लेंटीवायरल वेक्टर का उपयोग किया जाता है, इस प्रकार टैमोक्सिफेन (एक एस्ट्रोजन एनालॉग) प्रशासन11पर इसके परमाणु स्थानांतरण की अनुमति देता है। इस रणनीति के परिणामस्वरूप उच्च दक्षता 7 के साथ हाइपरट्रोफिक मल्टीन्यूक्लिटेड मायोट्यूब कागठनहोता है। विशेष रूप से, आईडीईएम गैर-सामान्य हैं, प्रत्यारोपण पर मेजबान मांसपेशियों के अंदर एनग्रेफ्ट और अंतर कर सकते हैं और विभिन्न वैक्टर(जैसे लेंटीवायरस या मानव कृत्रिम गुणसूत्रों) का उपयोग करके आनुवंशिक रूप से ठीक किया जा सकता है, जिससे भविष्य की ऑटोलॉगस चिकित्सीय रणनीतियों का मार्ग प्रशस्त होता है। आईडीईएम के व्युत्पन्न, लक्षण वर्णन और प्रत्यारोपण का वर्णन उपरोक्त प्रकाशन7में किया गया है । यह प्रोटोकॉल पेपर मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में उनके प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए आईडीईएम के इन विट्रो मायोजेनिक भेदभाव और बाद के परिणाम मापों का मूल्यांकन करने के लिए किए गए परख का विवरण देता है।

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Protocol

1. मायोजेनिक और एनग्रफ्टमेंट क्षमता का आकलन

  1. इन विट्रो:मायोड-प्रेरित भेदभाव
    1. टैमोक्सिफेन-अशिक्षित मायोड-ईआर लेंटीविराल वेक्टर के साथ स्थानांतरित आईडीईएम की एक स्थिर सेल लाइन उत्पन्न करें, जो संक्रमण की बहुलता (एमओआई; जैसे 1, 5 और 50) प्रक्रिया की दक्षता के परिणाम के रूप में 1.1.9 (MyHC) में वर्णित धुंधला का उपयोग कर।
    2. कोट एक 3.5 सेमी डिश जिसमें 1 मिलीलीटर 1% मैट्रिगेल और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. प्लेट को मीडियम, सीड 1 x 105 मायओडी-ईआर ट्रांसड्यूड आईईएडीएम के साथ 3.5 सेमी टिश्यू कल्चर डिश में धोएं और ग्रोथ मीडियम में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. उम्मीद है कि कोशिकाएं एक या दो दिनों में संगम तक पहुंचें और फिर विकास माध्यम (1सेंट खुराक) में 1 μM 4OH-टैमोक्सिफेन जोड़ें।
    5. 24 घंटे के बाद, विकास माध्यम को 1 माइक्रोन 4OH-टैमोक्सिफेन(2 और अंतिम खुराक) के साथ पूरक विभेदन माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें।
    6. हर दूसरे दिन नए भेदभाव माध्यम के साथ माध्यम के आधे की जगह ।
    7. मायोट्यूब गठन के लिए दैनिक संस्कृतियों की जांच करें।
    8. एक सप्ताह (विभेदन माध्यम में 5 दिन) के बाद, प्लेटों को पीबीएस के साथ धीरे से धोएं और आरटी में 5 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें।
    9. मायोट्यूब की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन करें। एक परमाणु डाई के साथ काउंटरटाइन(जैसे Hoechst) ।

विभेदन की दक्षता का मूल्यांकन MyHC-सकारात्मक कोशिकाओं के अंदर नाभिक के प्रतिशत के रूप में किया जाता है: यदि दक्षता >50% है तो अगले कदम पर आगे बढ़ें।

  1. वीवो में:तीव्र मांसपेशियों के उत्थान के मॉडल में एनग्रेफ्टमेंट
    मांसपेशियों के उत्थान के लिए मायओडी-ईआर आईडीईएम के वीवो योगदान का मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं को पहले हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए वेक्टर एन्कोडिंग के साथ लेबल किया जाता है जो उन्हें ऊतक के अंदर ट्रेस करने में सक्षम बनाएगा। मायोडी-ईआर जीएफपी आईडीईएम को वयस्क मुरीन मांसपेशियों में इंजेक्ट किया जाता है, जो पहले एक मायोटॉक्सिन (जैसे कार्डियोटॉक्सिन) के साथ घायल होजाते हैं। ज़ेनोजेनिक (जैसे हिदेम्स) या आनुवंशिक रूप से हेरफेर/सही कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिरक्षा अस्वीकृति से बचने के लिए या तो इम्यूनोडिरु कमी या इम्यूनोसप्रेस्ड चूहों का उपयोग करना आवश्यक है।
    1. प्रत्यारोपण और प्रीट्रीट कोशिकाओं को प्रत्यारोपण से पहले 1 माइक्रोन 4 ओएच-टैमोक्सिफेन (जलीय रूप) को प्रत्यारोपण दिवस से पहले रात भर विकास माध्यम में जोड़ने से पहले 3.5 माइक्रोन/ग्राम के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ जानवरों का प्रीट्रीट करें।
    2. जानवरों की सुविधा में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को विनियमित करने वाले विशिष्ट दिशानिर्देशों का पालन करते हुए माउस को संज्ञाहरण और एनाल्जेसिया का प्रशासन करें।
    3. 100 माइक्रोन कार्डियोटॉक्सिन (सीटीएक्स; नाजा मोसम्बिका मोसम्बिकासे 25 माइक्रोन इंजेक्ट करें; सावधानी: टिबिलिस पूर्ववर्ती (टीए) मांसपेशियों में संभावित रूप से हानिकारक पदार्थ।
    4. टैमोक्सिफेन और सीटीएक्स के साथ जानवरों के इलाज के बाद 24 घंटे, ट्राइपसिनाइजेशन और गिनती द्वारा कोशिकाओं को अलग करें।
    5. 5 मिनट के लिए 232 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
    6. सीए2 +में सेल पेलेट को धोएं - और एमजी2 +-मुक्त पीबीएस, अपकेंद्रित्र और फिर धीरे से सीए2 +में सेल पेलेट को फिर से बढ़ाएं - और एमजी2 +-मुक्त पीबीएस को 106 कोशिकाओं/30 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए, जो प्रत्येक इंजेक्शन की अंतिम मात्रा होगी।
    7. 29 या 30 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर पहले से घायल मांसपेशियों में सेल निलंबन के 30 माइक्रोन इंजेक्ट करें। पेशी से सुई निकालते समय विशेष ध्यान दें। यह धीरे-धीरे करें, सुई के ट्रैक के माध्यम से सेल निलंबन को गिराने से बचें। कॉन्ट्रालेट्रल टीए प्रत्यारोपण न करें और इसे नियंत्रण के रूप में उपयोग करें, प्रत्यारोपित की शर्तों को दोहराने के लिए सीए2 +के 30 माइक्रोन इंजेक्शन - और   एमजी2 +-मुक्त पीबीएस।
    8. छह अतिरिक्त दिनों के लिए टैमोक्सिफेन के साथ जानवरों का इलाज करें और दो अतिरिक्त दिनों के लिए एनाल्जेसिया (जैसे कारप्रोफेन) का प्रशासनकरें।
    9. प्रत्यारोपण के बाद 14 दिनों से मांसपेशियों को हटाएं। प्रोटोकॉल 4 और 5 में विस्तृत नमूनों की प्रक्रिया और विश्लेषण करें।

2. मस्कुलर डिस्ट्रॉफी के माउस मॉडल में प्रत्यारोपण

यह प्रत्यारोपण परख मांसपेशियों डिस्ट्रॉफी के माउस मॉडल में आईडीईएम के एनग्रफ्टमेंट की सीमा का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। इस प्रकार के रूप में इलाज किए गए जानवरों को फेनोटाइप रोग के कार्यात्मक सुधार के लिए भी मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रत्यारोपण के दो सप्ताह बाद से कार्यात्मक परीक्षण किए जा सकते हैं। एनग्रेक्शन को बढ़ाने के लिए प्रीट्रांज्लांटेशन ट्रेडमिल एक्सरसाइज (जैसा कि प्रोटोकॉल 3 में वर्णित है) और/या सीरियल सेल इंजेक्शन हर तीन हफ्ते में 3x(यानी कुल 3 इंजेक्शन/मांसपेशी के लिए) करने पर विचार करें ।

  1. इंट्रामस्कुलर प्रत्यारोपण
    1. प्रत्यारोपण और प्रीट्रीट कोशिकाओं को प्रत्यारोपण से पहले 1 माइक्रोन-टैमोक्सिफेन (लिमोबल फॉर्मूलेशन) 24 घंटे के 3.5 माइक्रोन/जी के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ जानवरों का प्रीट्रीट करें, जो प्रत्यारोपण दिवस से पहले रात भर विकास माध्यम में 1 μM 4OH-टैमोक्सिफेन (जलीय निर्माण) जोड़ते हैं।
    2. ट्रिपसिनाइजेशन, काउंट और अपकेंद्रित्र द्वारा अलग 5 मिनट के लिए 232 x ग्राम पर कोशिकाओं को अलग करें।
    3. सीए2 +में सेल पेलेट को धोएं - और एमजी2 +-मुक्त पीबीएस, सेंट्रलाइज और फिर सीए2 +में गोली को फिर से खर्च करें - और एमजी2 +-मुक्त पीबीएस 106 कोशिकाओं/
    4. एनाल्जेसिया को प्रशासित करें और पोविडोन आयोडीन या क्लोरेक्सिडीन आधारित कीटाणुनाशक के साथ जानवर (वैकल्पिक) की त्वचा को कीटाणुरहित करें। यह टिबियालिस पूर्ववर्ती (टीए), गैस्ट्रोकनेमियस (जीसी), और क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस (क्यूसी; विशेष रूप से वास्तु मध्यस्थ) मांसपेशियोंको स्थानीयकृत करने में भी मदद करेगा।
    5. 29 या 30 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर मांसपेशियों में सेल निलंबन के 30 माइक्रोन इंजेक्ट। टीए के लिए, टिबिया के सापेक्ष 15 डिग्री झुकाव के साथ समीपस्थ कण्डरा (क्रैनोकौडल दिशा) के सम्मिलन के नीचे सुई 2 मिमी के 5 मिमी डालें और सुई को वापस लेते समय धीरे-धीरे कोशिका निलंबन इंजेक्ट करें (मांसपेशियों के अंदर अभी भी सुई के 2 मिमी के साथ सिरिंज खाली)। जीसी और क्यूसी के लिए, टीए के लिए विस्तृत के रूप में एक ही प्रक्रिया दोहराएं, मुख्य अंतर जीसी के लिए दुखती कण्डरा के मायोटेन्डीनस जंक्शन के ऊपर सुई 2 मिमी का कौकार्य सम्मिलन और क्यूसी के लिए डिस्टल टेंडन से ऊपर 2 मिमी (फीमर के संबंध में 15 डिग्री झुकाव)। सुई के ट्रैक के माध्यम से कोशिका निलंबन को गिराने से बचने के लिए मांसपेशियों से सुई को हटाते समय ध्यान दें।
      समस्या निवारण: कम engraftment के मामले में किशोर इंजेक्शन पर विचार (1-2 सप्ताह पुराने) चूहों7 3 x 105 कोशिकाओं के साथ/10 μl (ध्यान दें कि इस मामले में टैमोक्सिफेन को चमड़े के साथ प्रशासित करने की जरूरत है) ।
  2. अंतर-धमनी प्रत्यारोपण
    प्रोटोकॉल का यह हिस्सा मिडेम्स और हिदेम्स की क्षमता के मूल्यांकन को धमनी परिसंचरण में वितरित करने, पोत की दीवार को पार करने और इंजेक्शन साइट के डाउनस्ट्रीम मांसपेशियों में कंकाल मांसपेशियों के उत्थान में योगदान करने की अनुमति देता है।
    1. चरण 2.1.1 में ऊपर वर्णित जानवरों और कोशिकाओं का प्रीट्रीट करें।
    2. एक 40 माइक्रोन सेल छलनी के साथ ट्रिपसिनाइजेशन और फिल्टर द्वारा अलग (संभावना नहीं घटना में सेल निलंबन से समूहों को हटाने के लिए कि टैमोक्सिफेन के लिए रात भर जोखिम संलयन और आसन्न कोशिकाओं से मायोट्यूब के गठन ड्राइव कर सकता है) गिनती और 5 मिनट के लिए 232 x g पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र
    3. सीए2 +में सेल पेलेट को धोएं - और एमजी2 +-मुक्त पीबीएस, अपकेंद्रित्र और फिर सीए2 +में गोली को फिर से खर्च करें - और एमजी2 +- मुक्त पीबीएस 0.2 अंतर्राष्ट्रीय के साथ
      सोडियम हेपरिन (वैकल्पिक) की इकाइयां 106 कोशिकाओं/50 माइक्रोन की अंतिम कोशिका एकाग्रता के लिए। सेल निलंबन के वितरण की कल्पना करने के लिए समाधान में 10% पेटेंट ब्लू डाई (अंतिम एकाग्रता: सामान्य नमकीन या सीए 2 + में1.25मिलीग्राम/मिलीलीटर - और एमजी2 +-मुक्त पीबीएस) जोड़ें।
    4. विशिष्ट संस्थागत पशु सुविधा में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को विनियमित करने वाले दिशा-निर्देशों के अनुसार माउस को संज्ञाहरण और एनाल्जेसिया का प्रशासन करें।
    5. इंगिनल क्षेत्र को शेव करें (इसे फीमोरल या स्कार्पा के त्रिकोण के रूप में भी जानते हैं) और त्वचा को पोविडोन आयोडीन या क्लोरहेक्सीडीन आधारित कीटाणुनाशक के साथ कीटाणुरहित करें।
    6. 5-7 मिमी चीरा बनाएं और फेमोरल बंडल को स्थानीयकृत करें: नस, धमनी और तंत्रिका (तंत्रिका धमनी और नस को मध्यः देती है)।
    7. धीरे-धीरे संयोजीय प्रावरणी को हटा दें जो बंडल को संदंश के साथ कवर करता है।
    8. धमनी से फीमोरल नस और तंत्रिका को धीरे-धीरे उन दोनों के बीच में एक संदंश (या 30 ग्राम सुई) की नोक शुरू करके और छेद को उत्तरोत्तर विस्तार देकर अलग करें।
      समस्या निवारण: फीमोरल नस नाजुक है: नारीधमनी से अपनी टुकड़ी के दौरान संदंश के साथ चुटकी नहीं करने के लिए ध्यान देना। रक्तस्राव के मामले में, बाँझ धुंध के साथ रक्त को छानलें और हेमोसेसिस की सुविधा के लिए माइक्रो कॉटराइजर का उपयोग करें।
    9. धमनी को संदंश के एक टिप के साथ उठाएं और दूसरे टिप के साथ धमनी को दबाएं।
    10. 30 जी सुई से लैस सिरिंज से धमनी को पंचर करें। लगभग 5 माइक्रोन/सेकंड की जलसेक गति पर, क्लैंप किए गए क्षेत्र के सेल निलंबन डाउनस्ट्रीम के 50 माइक्रोन इंजेक्ट करें।
      समस्या निवारण: इंजेक्शन से पहले सिरिंज में कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक रीसस्ट करें: सिरिंज के अंदर कोशिकाओं और हवा के बुलबुले के गठन की वर्षा से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है। फेमोरल धमनी का व्यास 30 जी सुई से थोड़ा छोटा है: सावधान रहें कि सुई डालने के दौरान धमनी को छोटा न करें। पेटेंट ब्लू डाई इंजेक्शन की प्रभावशीलता को पहचानने की अनुमति देता है: यदि सही ढंग से इंजेक्शन दिया जाता है, तो पूरा अंग तेजी से हल्के नीले रंग की बारी होगी।
    11. धीरे-धीरे अंग में खून को बहाल करने के लिए धमनी से सुई और संदंश को हटा दें।
    12. रक्तस्राव से बचने के लिए बाँझ धुंध के साथ दबाव लागू करें और/या आवश्यकतानुसार cauterize ।
    13. घाव को सीवन करें और संज्ञाहरण से वसूली तक जानवरों की निगरानी करें।
    14. 3 दिनों के लिए एनाल्जेसिया का प्रशासन करें और घाव का दैनिक निरीक्षण करें (घाव संक्रमण के मामले में पशु सुविधा कर्मियों के साथ इस पर चर्चा करें और आवश्यकतानुसार एंटीबायोटिक दवाओं का प्रशासन करें)।

3. प्रत्यारोपित डिस्ट्रोफिक जानवरों पर परिणाम उपाय: ट्रेडमिल टेस्ट

सेल प्रत्यारोपण के बाद दो सप्ताह से शुरू, ट्रेडमिल परीक्षणों के साथ इलाज चूहों की मोटर क्षमता के कार्यात्मक सुधार का मूल्यांकन करना संभव है। यह परीक्षण इलाज चूहों के व्यायाम सहिष्णुता/धीरज के मूल्यांकन की अनुमति देता है । एक माउस थका हुआ माना जाता है जब 5 सेकंड से अधिक के लिए आराम क्षेत्र में देता है, लगातार 3 यांत्रिक उत्तेजनाओं (एक हर 5 सेकंड) की एक श्रृंखला के बाद ट्रेडमिल को फिर से शामिल करने के प्रयास के बिना। बेसलाइन माप उपचार से लगभग एक महीने पहले शुरू होते हैं और प्रत्येक एक परीक्षण किए गए जानवर के सुधार का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। इस परीक्षण के अतिरिक्त परख के बाद फाइबर कमजोरी, बल सुधार, engraftment, प्रत्यारोपित कोशिकाओं के भेदभाव, और प्रत्यारोपित मांसपेशियों के रूपात्मक सुधार की निगरानी के लिए किया जा सकता है (चर्चा देखें) ।

  1. जानवरों को अनुकूलित करें (आमतौर पर तीन समूह: उपचारित, अनुपचारित, और जंगली प्रकार/गैर डिस्ट्रोफिक नियंत्रण) पहले माप से पहले व्यायाम करने के लिए: ट्रेडमिल को 10 मिनट के लिए 6 मीटर/मिनट की गति से सेट करें । एक सप्ताह के लिए हर दूसरे दिन प्रक्रिया दोहराएं।
    समस्या निवारण: सर्कैडियन चक्रों के कारण पूर्वाग्रहों से बचने के लिए दिन के एक ही समय में सभी मापों को रिकॉर्ड करें।
  2. जानवरों को ट्रेडमिल में रखें, जिसे पहले 10 डिग्री के झुकाव के साथ स्थापित किया गया है।
  3. ट्रेडमिल चालू करें, 6 मीटर/मिनट की शुरुआती गति के साथ (जानवरों के व्यायाम शुरू करने के लिए तैयार नहीं होने की स्थिति में एक सौम्य यांत्रिक उत्तेजना प्रदान करें)।
  4. टाइमर शुरू करें और हर 2 मिनट में स्पीड 2 मीटर/मिनट बढ़ाएं ।
  5. जैसे ही एक जानवर ट्रेडमिल को फिर से शामिल करने के प्रयास के बिना 5 सेकंड से अधिक के लिए आराम क्षेत्र में स्थित है, धीरे-धीरे अभ्यास के पुनः आरंभ को प्रोत्साहित करने के लिए इसे छड़ी से स्पर्श करें (ऊपर देखें)।
  6. प्रत्येक जानवर के प्रदर्शन (समय और या दूरी) को रिकॉर्ड करें।
  7. माप साप्ताहिक या हर 10 दिनों में कम से कम 3x के लिए दोहराएं।
  8. प्रत्यारोपण के बाद एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
  9. प्रत्येक जानवर के माप की तुलना उसके बेसलाइन प्रदर्शन से करने वाले प्रदर्शन डेटा का विश्लेषण करें। हम बेसलाइन के सापेक्ष औसत मोटर क्षमता के प्रतिशत के रूप में एक ग्राफ में मूल्यों को प्लॉट करने और समूहों की तुलना करने के लिए उपयुक्त पोस्ट-टेस्ट के बाद एक या दो तरह के ANOVA परीक्षण द्वारा उनका विश्लेषण करने का सुझाव देते हैं।

समस्या निवारण: कम से कम 5 आयु-, जीनोटाइप-और सेक्स-मिलान वाले जानवरों/समूह का उपयोग करें और प्रत्यारोपण के बाद कम से कम 3x के लिए माप दोहराएं।

4. प्रत्यारोपित मांसपेशियों में सेल एनग्रफ्टमेंट और भेदभाव का मूल्यांकन

प्रत्यारोपित और नियंत्रण मांसपेशियों को उचित समय बिंदु पर काटा जाता है (अल्पकालिक एनग्रफ्टमेंट विश्लेषण के लिए <2 दिन, मध्यावधि के लिए 2-3 सप्ताह और दीर्घकालिक विश्लेषण के लिए >1 महीने)। यदि प्रत्यारोपित कोशिकाओं को जीएफपी के साथ लेबल किया जाता है, तो ताजा अलग मांसपेशियों में एनग्रेफ्टमेंट का आकलन यूवी-लैस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सीधे फ्लोरेसेंस द्वारा किया जा सकता है।

  1. ट्रागाचेंथ गम में ऊर्ध्वाधर धुरी हौसले से अलग मांसपेशियों के साथ रखना और उन्मुख (6% w/v)
  2. नमूनों को एक मिनट के लिए प्रीचिल्ड आइसोपेनटेन में निर्जलित करें, उन्हें कम से कम 2 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और उन्हें भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत रखें।
  3. ध्रुवीकृत स्लाइड पर 7 माइक्रोन मोटी धाराओं को प्राप्त करने के लिए क्रायोस्टेट के साथ नमूनों की प्रक्रिया करें। स्लाइड पर पेशी के बहुमत का नमूना, 30-40 वर्गों के साथ लगभग 8-10 स्लाइड इकट्ठा/ आणविक जीव विज्ञान/बायोकेमिस्ट्री परख करने के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में वर्गों की एक श्रृंखला एकत्र करने की सलाह दी जाती है।
  4. प्रायोगिक सेटअप के आधार पर विभिन्न इम्यूनोफ्लोरेटेंट स्टेनिंग के साथ सेल एनग्रेफ्टमेंट का मूल्यांकन करें। उदाहरण के लिए, Sgca-null/scid/bg चूहों में HIDEM प्रत्यारोपण के मामले में, दाग वर्गों के साथ: एक) लामिन ए/सी के खिलाफ एक एंटीबॉडी ग्राफ्ट मानव कोशिका नाभिक का पता लगाने के लिए; ख) मांसपेशियों की समग्र संरचना की कल्पना करने के लिए लैमिनिन के खिलाफ एक एंटीबॉडी; और ग) डिस्ट्रोफिक जानवर में अनुपस्थित प्रोटीन की दाता-व्युत्पन्न बहाली का पता लगाने के लिए एसजीसीए के खिलाफ एक एंटीबॉडी ।
  5. मात्रा, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, मांसपेशियों के तंतुओं के अंदर और बाहर प्रति मांसपेशी अनुभाग दाता नाभिक की संख्या और प्रति अनुभाग दाता-व्युत्पन्न कंकाल मायोफिबर की संख्या।

5. मांसपेशी हिस्टोपैथोलॉजी

हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण प्रत्यारोपित मांसपेशियों की रूपात्मक संरचना के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। ऊतक संरचना में वास्तु सुधार सेल थेरेपी दृष्टिकोण के परिणाम के रूप में होने की उम्मीद है।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ताजा अलग मांसपेशियों को ठीक करें।
  2. एक आरोही सुक्रोज ढाल के साथ नमूनों को निर्जलित(उदाहरण के लिए 7.5-15-30% w/v) ।
  3. मांसपेशियों को उच्चतम सुक्रोज समाधान में रात भर छोड़ दें।
  4. ऊतक टेक OCT में नमूनों को एम्बेड करें, उन्हें पहले के अक्टूबर ठोस होने तक पहले से ही पहले केसोपेंटेन में रखें (नमूनों के पूर्ण विसर्जन से बचें), उन्हें कम से कम 2 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में फ्रीज करें और उन्हें भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत रखें।
  5. ऊपर वर्णित 7 माइक्रोन मोटी धाराओं को प्राप्त करने के लिए क्रायोस्टेट के साथ नमूनों को संसाधित करें।
  6. मानक निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन या मैसन के ट्राइक्रोम के साथ वर्गों को दाग दें।

हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग मांसपेशियों को पुनर्जीवित करने की पहचान की गणना करने में सक्षम बनाता है, जैसे: क) मायोफिबर की संख्या; ख) क्रॉस सेक्शनल एरिया; ग) एक केंद्रीय नाभिक युक्त मायोफिबर की संख्या। मैसन के ट्राइक्रोम का उपयोग फाइब्रोटिक इंडेक्स की गणना करने के लिए किया जाता है, जो छवि के कुल क्षेत्र से कंकाल मायोफिबर द्वारा कब्जा किए गए कुल क्षेत्र को घटाकर किया जाता है: परिणामी क्षेत्र मुख्य रूप से मांसपेशियों के संयोजी और वसा घुसपैठ को दर्शाता है। छवियों पर सभी विश्लेषण माप उपकरण और सेल काउंटर प्लगइन के साथ ImageJ सॉफ्टवेयर (NIH) का उपयोग करके किया जा सकता है।

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Representative Results

रिपोर्ट किए गए प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में वर्कफ्लो में दर्शाए गए विट्रो/इन वीवो परख का अनुसरण करते हैं । 48 घंटे के बाद 4OH-टैमोक्सिफेन प्रशासन MyoD-सकारात्मक नाभिक संस्कृति में MyoD-ER transduced IDEMs(चित्रा 2A)के भीतर पहचाने जाते हैं । इसके बाद कोशिकाएं मल्टीन्यूक्लिटेड मायोट्यूब(चित्रा 2B)में फ्यूज और अंतर करती हैं । जब तीव्र मांसपेशियों की चोट के एक मुरीन मॉडल में इंट्रामस्कुलर रूप से प्रत्यारोपित किया जाता है, तो आईडीईएम ऊतक उत्थान(चित्र 3)में योगदान देते हैं। मस्कुलर डिस्ट्रॉफी के मुरीन मॉडल के लिए जीन और सेल-थेरेपी सेटिंग में आईडीईएम की प्रभावकारिता का मूल्यांकन ट्रेडमिल व्यायाम सहिष्णुता परीक्षण द्वारा किया गया था: चित्रा 4 एसजीसीए-नल/विज्ञान/बेज चूहों में जंगली प्रकार के मिडेम्स के प्रत्यारोपण के बाद प्राप्त परिणामों को दर्शाता है, जो इलाज चूहों में मोटर क्षमता के सुधार को प्रदर्शित करता है7। प्रत्यारोपित मांसपेशियों के पूर्व वीवो विश्लेषण मेजबान ऊतक(आंकड़े 5A-C)में आईडीईएम के उपनिवेशीकरण की सीमा का प्रतिनिधित्व करने वाले GFP-सकारात्मक क्षेत्रों को दिखाते हैं, इस प्रकार यह प्रदर्शित होते हैं कि दाता कोशिकाएं डिस्ट्रोफिक मांसपेशियों में एंग्राफ्ट होती हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्यारोपित कोशिकाएं वीवो मेंअंतर करने में सक्षम हैं, जो नए कंकाल मायोफबर बनाते हैं। वास्तव में चित्रा 5 Sgca-null/scid/बेज चूहों(आंकड़े 5D और 5E)में आनुवंशिक रूप से सही HIDEMs से Sgca अभिव्यक्ति से पता चलता है । प्रत्यारोपित मांसपेशियों की वास्तुकला में संरचनात्मक सुधार का आकलन मैसन के ट्राइक्रोम स्टेनिंग के माध्यम से किया जा सकता है: चित्रा 5F इलाज मांसपेशियों में फाइब्रोटिक ऊतक की मात्रा में कमी दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट। यह योजना आईडेम-आधारित रणनीति का अवलोकन प्रदान करती है, प्रारंभिक इन विट्रो विभेदन परख (बाएं) से लेकर वीवो और एक्स वीवो (दाएं) में एनग्रेक्शन, मायोजेनिक क्षमता और कार्यात्मक सुधार का आकलन करने के लिए आवश्यक विभिन्न कदमों तक। डार्क ग्रे बॉक्स में प्रोटोकॉल में वर्णित विभिन्न कदम होते हैं; हल्के ग्रे बक्से विधि के कुछ हिस्सों इस लेख में विस्तृत नहीं होते हैं। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। विट्रो मेंमायोजेनिक क्षमता का आकलन । (क) इम्यूनोफ्लोरेसेंस 7 में से 4 में परमाणु मायोड अभिव्यक्ति दिखा रहा है-ईआर 4OH-टैमोक्सिफेन के संपर्क में ४८ घंटे के बाद मिडेम नाभिक को स्थानांतरित कर रहा है । (ख) 4OH-टैमोक्सिफेन-प्रेरित हिडेम-व्युत्पन्न मायोट्यूब पर मायोसिन हैवी चेन (MyHC) के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग एक सप्ताह के बाद विभेदन माध्यम (स्केल बार, २०० माइक्रोन) में । बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3

चित्र 3। तीव्र मांसपेशी उत्थान के मॉडल में सेल एनग्रफ्टमेंट के वीवो मूल्यांकन में। (क) स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक जीएफपी फ्लोरेसेंस छवियां हौसले से अलग कार्डियोटॉक्सिन-घायल टिबिलिस पूर्ववर्ती मांसपेशियों की 10 6 GFP-हिदेम्स (बाएं) और जीएफपी-मिडेम्स (केंद्र) के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के2 सप्ताह बाद की गई । स्केल बार, 2 मिमी (बी) कम (ऊपर) और उच्च (नीचे) में दिखाए गए मिडेम्स के साथ प्रत्यारोपित मांसपेशियों के आवर्धन चित्र (ए) GFP-सकारात्मक myofibers प्रदर्शित । स्केल बार, 200 माइक्रोन। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. ट्रेडमिल सहनशीलता परीक्षण का प्रयोग करें। प्रत्यारोपित के लिए प्रतिनिधि ट्रेडमिल परीक्षण (आईएम = इंट्रामस्क्युलर; आईए = इंट्रा-धमनी) । एसजीसीए-अशक्त/विज्ञानी/बेज चूहों (१०६ सेल/इंजेक्शन) बनाम गैर-प्रत्यारोपित डिस्ट्रोफिक और नॉनडाइस्ट्रोफिक कंट्रोल इम्यूनोडिफिशिक चूहों । यह साजिश मिडेम्स (प्रत्यारोपण के 35 दिनों के बाद गैर-प्रत्यारोपित जानवरों की तुलना में 12-22% अधिक) के साथ प्रत्यारोपित डिस्ट्रोफिक चूहों के कार्यात्मक सुधार को दर्शाती है। डेटा को बेसलाइन प्रदर्शन के सापेक्ष औसत मोटर क्षमता के रूप में दिखाया जाताहै (यानी 100% प्रत्येक समूह के आधारभूत प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है और केवल चूहों का इलाज किया जाता है जो दोहराए गए माप पर इसे काफी सुधारता है)। * पी < 0.05; * * पी < 0.005, एक तरह से ANOVA. लेखकों के पहले प्रकाशित काम से7। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5

चित्रा 5। मस्कुलर डिस्ट्रॉफी के माउस मॉडल में एनग्रेफ्टमेंट और मायोजेनिक क्षमता के वीवो मूल्यांकन में। (क) स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक जीएफपी फ्लोरेसेंस एसजीसीए-अशक्त/सिड/बेज चूहों की ताजा इक्का-दुक्का टिबियालिस पूर्ववर्ती मांसपेशियों की स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक जीएफपी फ्लोरेसेंस छवियां 106 मानव (हिदेम्स, बाएं; किशोर चूहों में प्रत्यारोपण) और मुरीन (एमआईईएम; राइट) जीएफपी-आईडीईएम के इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के 3-4 सप्ताह बाद 3-4 सप्ताह का पता लगाया गया । स्केल बार, 2 मिमी (बी) स्टीरियोमाइक्रोस्कोपिक जीएफपी फ्लोरेसेंस छवि एक ताजा अलग गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी 10 6 GFP-मिडेम्स के अंतर-धमनी इंजेक्शन के3 सप्ताह बाद लगाया गया। स्केल बार, 1 मिमी (सी) मांसपेशी के ताजा जमे हुए ट्रांसवर्स अनुभाग में दिखाए गए मिडेम्स के साथ प्रत्यारोपित (ए) GFP-सकारात्मक myofibers के एक क्लस्टर प्रदर्शित । स्केल बार, 200 माइक्रोन। (घ) इम्यूनोफ्लोरेसेंस अंतर-मस्कुलर प्रत्यारोपित मांसपेशियों के वर्गों पर धुंधला (जैसाकि एक में) आनुवंशिक रूप से सही फाइबर के समूहों को दिखाना, ग्राफ्टेड आईडीईएम से उत्पन्न हुआ । स्केल बार, 150 माइक्रोन। (ङ) एसजीसीए-अशक्त/स्किड/बेज चूहों में आनुवंशिक रूप से सही आईडीईएम के इंट्रामस्कुलर प्रत्यारोपण के एक महीने बाद α-सारकोग्लिकन (एसजीसीए) -पॉजिटिव मायोफिबरर्स का मात्राकरण । (च) मैसन ट्राइक्रोम प्रत्यारोपित से टिबियालिस पूर्ववर्ती मांसपेशियों का धुंधला और एसजीसीए-नल/scid/बेज चूहों (लाल: मांसपेशी फाइबर; नीला: फाइब्रोसिस) इलाज मांसपेशियों में फाइब्रोटिक घुसपैठ की कमी को उजागर करने से । स्केल बार, 200 माइक्रोन। बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आईपीएससी को अनिश्चित काल तक विस्तारित किया जा सकता है, जबकि उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता को संरक्षित किया जा सकता है और इस प्रकार सेल वंश12की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर करने के लिए निर्देशित किया जा सकता है । इसके और अन्य कारणों से आईपीएससी-व्युत्पन्न स्टेम/जनक कोशिकाओं को ऑटोलॉगस जीन के लिए एक आशाजनक स्रोत माना जाता है और सेल थेरेपी13तक पहुंचती है । लेखकों से पहले प्रकाशित एक काम ने आईपीएससी से माउस और मानव मायोजेनिक जनकों की पीढ़ी को पेरिसाइट-व्युत्पन्न एमएबी (आईडीईएम) के समान फेनोटाइप के साथ रिपोर्ट किया और मांसपेशियों के डिस्ट्रॉफी7के माउस मॉडल में मांसपेशियों के उत्थान में उनके कुशल योगदान की सूचना दी।

आईडीईएम मायोजेनिक क्षमता को अधिकतम करने के लिए एक शर्त कोशिकाओं में मायोजेनिक कारक मायोड की अभिव्यक्ति है। टैमोक्सिफेन-अक्षुण्ण मायोड-ईआर कैसेट के साथ ट्रांसडक्शन ने पूरी संस्कृति में और बाद में वीवो में अपनी सक्रियता को सिंक्रोनाइज़ करने के लाभ के साथ अपनी अभिव्यक्ति पर सटीक लौकिक नियंत्रण करने में सक्षम बनाया। इस लेख में प्रति मांसपेशी (या प्रति फीमोरल धमनी) कोशिकाओं के एकल प्रशासन के आधार पर एक प्रत्यारोपण रणनीति का वर्णन किया गया है। हालांकि, विभिन्न सेल थेरेपी प्रोटोकॉल8में एमएबी एनग्रेफ्टमेंट बढ़ाने में बार-बार सेल इंजेक्शन को प्रभावोत्पादक दिखाया गया है। इसलिए, आईडीईएम के साथ उप-सूक्ष्म परिणामों के मामले में, सेल खुराक बढ़ाने के लिए बार-बार प्रत्यारोपण करना और इसलिए, मांसपेशियों की मेजबानी में योगदान करना लायक है।

परिणाम माप उपचारित जानवरों के फेनोटाइप के कार्यात्मक सुधार में दाता कोशिकाओं के योगदान के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। ट्रेडमिल के साथ किए गए व्यायाम सहिष्णुता/धीरज परीक्षण के अलावा, स्वैच्छिक मोटर क्षमता(जैसे फ्रीव्हील परीक्षण), फाइबर कमजोरी(जैसे इवांस ब्लू डाई तेज परख) और विशिष्ट बल(जैसे एकल फाइबर या पूरे मांसपेशी यांत्रिकी) का विश्लेषण करने के लिए आगे परीक्षण8माना जा सकता है । कार्यात्मक फेनोटाइप सुधार का परीक्षण करने के लिए अतिरिक्त तरीके ट्रीट-एनएमडी वेबसाइट(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/)में मानक परिचालन प्रक्रियाओं के रूप में उपलब्ध हैं।

प्रत्यारोपित जानवरों से महत्वपूर्ण जानकारी इकट्ठा करने के लिए, कार्यात्मक सुधार का पालन किया जाना चाहिए और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा मान्य किया जाना चाहिए, सेल एनग्रफ्टमेंट और ऊतक वास्तुकला/रिमॉडलिंग का मूल्यांकन करने के लिए । विशेष रूप से, पुनर्जनन और फाइब्रोसिस की पहचान के लिए ग्राफ्ट की मांसपेशियों की मॉर्फोमेट्रिक संरचना का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि केंद्रीय नाभिक के साथ फाइबर की संख्या का आकलन करना, मायोफिबर अनुभागीय क्षेत्र और फाइब्रोटिक इंडेक्स को पार करते हैं। बाद का विश्लेषण, कार्यात्मक परिणामों के साथ रणनीति की प्रभावशीलता पर एक व्यापक सिंहावलोकन देते हैं। इसके अलावा, ऊतक(यानी myofibers) में योगदान के संदर्भ में प्रत्यारोपित कोशिकाओं द्वारा अपनाई गई वंश की निगरानी और स्टेम सेल डिब्बे के रखरखाव सभी सेल थेरेपी रणनीतियों की दीर्घकालिक प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण है । इस मामले में, यह पहले से ही पेसिसाइट डिब्बे में वीवो में दाता-व्युत्पन्न योगदान की सूचना दी गई है जिसमें से मेसोपियानोब्लास्ट7प्राप्त होते हैं; इसके अतिरिक्त, प्रारंभिक परिणाम ईईईएम से उपग्रह सेल पूल (गेरली और टेडेस्को, अप्रकाशित परिणाम) में कार्यात्मक योगदान का संकेत देते हैं। आणविक विश्लेषण सही जीन(यानी मात्रात्मक पीसीआर और पश्चिमी दाग) की engraftment और अभिव्यक्ति प्रदर्शित करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं, लेकिन इस कागज के दायरे से बाहर है और एक समर्पित लेख की आवश्यकता होगी ।

हालांकि इस प्रोटोकॉल मुख्य रूप से Sgca-null/scid/बेज चूहों7 (LGMD2D के एक हाल ही में प्रकाशित इम्यूनोडिफिशिएंसी मॉडल) का उपयोग विकसित किया गया है, यह उंमीद है कि यह आसानी से मांसपेशियों की बीमारी के अंय मॉडलों के लिए लागू हो सकता है । Sgca-null/scid/beige के मामले में, चूहों हम कार्डियोटॉक्सिन का उपयोग नहीं किया, के बाद से इन जानवरों की मांसपेशियों को गंभीर रूप से समझौता कर रहे है और लंबे समय से पतन और उत्थान चक्र के अधीन (इस प्रकार कार्डियोटॉक्सिन से एक अतिरिक्त नुकसान आवश्यक नहीं है) । हालांकि, हम इस बात को बाहर नहीं कर सके कि कार्डियोटॉक्सिन के साथ एक प्रीट्रीटमेंट मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (जैसे एमडीएक्स चूहों) के मामूली मॉडलों में एनग्रेफ्टमेंट की सुविधा प्रदान कर सकताहै। हमारी रणनीति के सुधार में माउस होस्ट की इम्यूनोडेफिशिएंसी को बढ़ाने के तरीके शामिल हो सकते हैं (जो वर्तमान मॉडल में अभी भी उप-अनुकूल है) और विशेष रूप से ज़ेनोजेनिक कोशिकाओं के अंतर-धमनी वितरण पर दाता सेल एनग्रेफ्टमेंट की प्रभावकारिता। हालांकि कई सेल प्रत्यारोपण और किशोर चूहों के उपयोग सेल engraftment७,८में वृद्धि करने के लिए योगदान, माउस आसंजन अणुओं अतिव्यावस्करण के दौरान मानव कोशिकाओं द्वारा सामना करना पड़ा और/ नैदानिक सेटिंग में इस जीन और सेल थेरेपी दृष्टिकोण के अनुवाद के लिए भविष्य के निर्देशों में कोशिका अपव्यय को बढ़ाने के लिए औषधीय रणनीतियां और गैर-युक्त वैक्टर(जैसे प्लाज्मिड्स, एमआरएएनए, मानव कृत्रिम गुणसूत्र, या गैर-संक्रमित वायरल वैक्टर) के उपयोग को पुनर्प्रोग्राम और आनुवंशिक रूप से कोशिकाओं को सही करने के लिए शामिल हो सकते हैं, इस प्रकार डालने के जोखिम से बचा जा सकता है।

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Disclosures

F.S.T. एक अंतरराष्ट्रीय पेटेंट आवेदन दायर किया है (नहीं । पीसीटी/GB2013/050112) इस लेख में वर्णित रणनीति का हिस्सा भी शामिल है । उन्हें अपने शोध के लिए प्रोमेटिक और डीडब्ल्यूसी लिमिटेड द्वारा फंडिंग मिली ।

Acknowledgments

लेखक Giulio Cossu, मार्टिना Ragazzi और उपयोगी चर्चा और समर्थन के लिए पूरी प्रयोगशाला का शुक्र है, और कृपया MyoD-ईआर वेक्टर प्रदान करने के लिए जेफ चेम्बरलाइन । जीवित पशुओं से जुड़े सभी प्रयोगों को सभी प्रासंगिक नियामक और संस्थागत एजेंसियों, विनियमों और दिशा-निर्देशों के अनुसार और अनुपालन के अनुसार पूरा किया गया । लेखक प्रयोगशाला में काम यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल, यूरोपीय समुदाय 7वें फ्रेमवर्क प्रोजेक्ट्स ऑप्टिस्टम एंड बायोडिजाइन और इतालवी ड्यूचेर्न पैरेंट प्रोजेक्ट द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
MegaCell DMEM Sigma M3942  
DMEM Sigma D5671  
IMDM Sigma I3390  
Horse serum Euroclone ECS0090L  
Foetal Bovine Serum Lonza DE14801F  
PBS Calcium/Magnesium free Lonza BE17-516F  
L-Glutammine Sigma G7513  
Penicilline/Streptomicin Sigma P0781  
2-Mercaptoethanol Gibco 31350-010  
ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) Gibco 51500-056  
Nonessential amino acid solution Sigma M7145  
Fer-In-Sol Mead Johnson  
Ferlixit Aventis  
Oleic Acid Sigma 01257-10 mg  
Linoleic Acid Sigma L5900-10 mg  
Human bFGF Gibco AA 10-155  
Grow factors-reduced Matrigel Becton Dickinson 356230  
Trypsin Sigma T3924  
Sodium heparin Mayne Pharma  
Trypan blue solution Sigma T8154 HARMFUL
Patent blue dye Sigma 19, 821-8  
EDTA Sigma E-4884  
Paraformaldehyde TAAB P001 HARMFUL
Tamoxifen Sigma T5648  
4-OH Tamoxifen Sigma H7904  
pLv-CMV-MyoD-ER(T) Addgene 26809  
Cardiotoxin Sigma C9759 HARMFUL
Povidone iodine  
Tragachant gum MP Biomedicals 104792  
Isopenthane VWR 24,872,323  
Tissue-tek OCT Sakura 4583  
Sucrose VWR 27,480,294  
Polarized glass slides Thermo J1800AMNZ  
Eosin Y Sigma E4382  
Hematoxylin Sigma HHS32  
Masson's trichrome Bio-Optica 04-010802  
Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody DSHB MF20  
Mouse anti Lamin A/C antibody Novocastra NLC-LAM-A/C  
Hoechst 33342 Sigma Fluka B2261  
Rabbit anti Laminin antibody Sigma L9393  
MATERIALS AND EQUIPMENT
Adsorbable antibacterial suture 4-0 Ethicon vcp310h  
30 G Needle syringe BD 324826  
Treadmill Columbus instrument  
Steromicroscope Nikon SMZ800  
Inverted microscope Leica DMIL LED  
Isoflurane unit Harvad Apparatus  
Fiber optics Euromecs (Holland) EK1  
Heating pad Vet Tech C17A1  
Scalpels Swann-Morton 11REF050  
Surgical forceps Fine Scientific Tools 5/45
High temperature cauteriser Bovie Medical AA01  
MEDIA COMPOSITION
Media composition is detailed below.
HIDEMs growth medium:
  • MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)
  • 5% fetal bovine serum (FBS)
  • 2 mM glutamine
  • 0.1 mM β-mercaptoethanol
  • 1% nonessential amino acids
  • 5 ng/ml human basic fibroblast growth factor (bFGF)
  • 100 IU ml penicillin
  • 100 mg/ml streptomycin
Alternatively, if some of the above reagents are not available, HIDEMs can be grown in:
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)
  • 10% FBS
  • 2 mM glutamine
  • 0.1 mM β-mercaptoethanol
  • 1% Nonessential amino acids (NEAA)
  • 1% ITS (insulin/transferrin/selenium)
  • 5 ng/ml human bFGF
  • 100 IU ml penicillin
  • 100 mg / ml streptomycin
  • 0.5 μM oleic and linoleic acids
  • 1.5 μM Fe2+ (Fer-In-Sol)
  • 0.12 μM Fe3+ (Ferlixit)
MIDEMs growth medium:
  • DMEM
  • 20% FBS
  • 2 mM glutamine
  • 5 ng/ml human bFGF
  • 100 IU ml penicillin
  • 100 mg/ml streptomycin
Differentiation medium:
  • DMEM
  • 2% Horse Serum (HS)
  • 100 IU ml penicillin
  • 100 mg/ml streptomycin
  • 2 mM glutamine

Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media.

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 83 कंकाल मांसपेशी मांसपेशी कोशिकाएं मांसपेशी फाइबर कंकाल पेरिसाइट्स स्टेम सेल प्रेरित प्लूपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) मस्कुलर डिस्ट्रोफीज सेल भेदभाव पशु मॉडल मांसपेशी स्टेम/जनक कोशिकाएं मेसोंगियोब्लास्ट मांसपेशी उत्थान आईपीएससी-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट्स (IDE)
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Gerli, M. F. M., Maffioletti, S. M., Millet, Q., Tedesco, F. S. Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration. J. Vis. Exp. (83), e50532, doi:10.3791/50532 (2014).

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