Summary
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) миогенные прародители являются перспективными кандидатами для стратегии клеточной терапии для лечения мышечной дистрофии. Этот протокол описывает трансплантацию и функциональные измерения, необходимые для оценки приписки и дифференциации мезоангиобластов, полученных iPSC (тип мышечных прародителей) в мышиных моделях острой и хронической регенерации мышц.
Abstract
Выведенные пациентом iPSCs смогли быть неоценимым источником клеток для будущих аутологичных протоколов терапии клетки. iPSC полученных миогенных стволовых / прародителя клетки похожи на перицита полученных мезоангиобластов (iPSC полученных мезоангиобласт-как стволовые / клетки-предшественники: IDEMs) могут быть созданы из iPSCs порожденных у пациентов, пострадавших от различных форм мышечной дистрофии. Пациент-специфические ИДЕМы могут быть генетически скорректированы с помощью различныхстратегий (например, лентивирусных векторов, искусственных хромосом человека) и усилены в их миогенном потенциале дифференциации при переэкспрессии регулятора миогенеза MyoD. Этот миогенный потенциал затем оценивается в пробирке с конкретными анализами дифференциации и анализируется иммунофлюоресценцией. Регенеративный потенциал IDEMs дополнительно оценивается in vivo, при внутримышечной и внутриартерикулярной трансплантации в двух репрезентативных моделях мыши, отображающих острую и хроническую регенерацию мышц. Вклад ИДЕМ в мышцы скелета хозяина подтверждается различными функциональными тестами на пересаженных мышах. В частности, с помощью беговой дорожки изучается вопрос о улучшении двигательной способности животных. Клеточный привещание и дифференциация затем оцениваются рядом гистологических и иммунофлюоресценции анализов на пересаженных мышцах. В целом, в настоящем документе описываются анализы и инструменты, используемые в настоящее время для оценки дифференциации потенциала ИДЕМ, с упором на методы трансплантации и последующие результаты мер по анализу эффективности трансплантации клеток.
Introduction
Мезоангиобласты (МАБы) являются сосудо-ассоциированных мышечных прародителей, полученных из подмножестваперицитов 1-3. Основное преимущество МАБ по сравнению с каноническими мышечными прародителями,такими как спутниковые клетки 4, заключается в их способности пересекать стенку сосуда при доставке внутритериальных и, следовательно, способствуют регенерации скелетных мышц в протоколах клеточной терапии. Эта функция была оценена и подтверждена в обоих мурин и собак модели мышечнойдистрофии 1,5,6. Эти доклинические исследования заложили основу для первого в человеке фазы I/II клинических испытаний, основанных на внутрипыльной трансплантации донорских HLA-идентичных МАБов у детей с мышечной дистрофией Дюшенна (EudraCT No 2011-000176-33; в настоящее время находится в больнице Сан-Раффаэле в Милане, Италия). Одним из основных препятствий подходов клеточной терапии, где миллиарды клеток необходимы для лечения мышц всего тела, является ограниченный пролиферативный потенциал "лекарственного продукта" (клетки). Кроме того, недавно было продемонстрировано, что это не возможно получить MABs от пациентов, пострадавших от некоторых форм мышечной дистрофии, как это происходит в конечности пояс мышечной дистрофии 2D (LGMD2D; ОМИМ #608099)7.
Чтобы преодолеть эти ограничения, протокол для получения MAB-как стволовые / прародителя клеток из человека и мурина iPSCs недавно былсоздан 7. Эта процедура генерирует легко расширяемые популяции клеток с подписью сосудистого гена и иммунофенотипом, очень похожим на взрослые мышечные МАБы. После выражения миогенного регулятивного фактора MyoD, как murine, так и человеческие IDEMs (соответственно MIDEMs и HIDEMs) проходят терминалетную дифференциацию скелетных мышц. Для достижения этой цели IDEMs могут быть трансдуцированы с векторами, способными управлять выражением MyoD, либо составной, либо неодобовасыжимоймодой 8-10. Лентивирусный вектор, содержащий миоД кДНА сливается с рецептором эстрогена (MyoD-ER) используется, что позволяет его ядерной транслокации на тамоксифен (аналог эстрогена)администрации 11. Эта стратегия приводит к образованию гипертрофических многоядерных миотрубов, с высокой эффективностью7. Примечательно, что ИДЕМ являются нетуморными, могут принимать энграфт и дифференцировать внутри мышц хозяина при трансплантации и могут быть генетически исправлены с использованием различных векторов(например, лентивирусов или искусственных хромосом человека), прокладывая путь для будущих аутологичных терапевтических стратегий. Вывод, характеристика и трансплантация ИДЕМ описаны в вышеупомянутой публикации7. В этом протокольном документе подробно из анализа, выполненного для оценки миогенной дифференциации ИДЕМ в пробирке и последующих измерений результатов для проверки эффективности их трансплантации в мышиных моделях регенерации мышц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оценка миогенного и engraftment потенциал
-
In vitro: Дифференциация, вызванная миоД
- Создание стабильной клеточной линии ИДЕМ, трансдуцированных с тамоксифен-неочеримым миоД-ER лентивирусным вектором, опоясывающим множественность инфекции (МВД; например, 1, 5 и 50) с использованием окрашивания, описанного в 1.1.9 (MyHC) в качестве результата эффективности процедуры.
- Пальто 3,5 см блюдо с 1 мл 1% Matrigel и инкубировать в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
- Вымойте пластину дважды со средним, семя 1 х10 5 MyoD-ER трансдуцированных ИДЕМов в 3,5 см ткани культуры блюдо и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в среде роста.
- Ожидайте, что клетки достигают слияния в один или два дня, а затем добавить 1 МК 4OH-тамоксифен в среде роста (1ст дозы).
- После 24 часов, заменить рост среды с дифференциацией среды дополняется 1 МК 4OH-тамоксифен(2-й и последней дозы).
- Замените половину среды свежей дифференциацией среды через день.
- Изучите ежедневно культур для формирования myotube.
- После одной недели (5 дней в дифференциации среды), мыть пластины осторожно с PBS и исправить с 4% параформальдегид в течение 5 минут на RT.
- Выполните иммунофлуоресценции окрашивания антителами против миозин тяжелой цепи (MyHC), чтобы подтвердить наличие миотрубов. Противоугон с ядернымкрасителем (например, Hoechst).
Эффективность дифференциации оценивается как процент ядер внутри MyHC-положительных клеток: переходите к следующему шагу, если эффективность >50%.
-
In vivo: приутязание в модели острой мышечной регенерации
Для оценки вклада ИноД-ЭР в регенерацию мышц клетки ранее помечены вектором, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), который позволит отследить их внутри ткани. Миод-ЭР GFP IDEMs затем вводят во взрослые мышцы мурина, ранее травмированных с миотоксином(например, кардиотоксин). Чтобы избежать иммунного отторжения от ксеногенных (таких как HIDEMs) или генетически манипулировать / исправленные клетки необходимо использовать либо иммунодефицита или иммунодепрессантов мышей.- Предварительно обработать животных с внутри перитонеальной инъекцией 3,5 л/г 10 мг/мл тамоксифена (липорастворимая форма) за 24 часа до трансплантации и предварительной обработки клеток, добавляющих 1 МК 4OH-тамоксифен (аквеозная форма) в среду роста на ночь до дня трансплантации.
- Администрирование анестезии и анальгезии к мыши в соответствии с конкретными руководящими принципами, которые регулируют хирургические процедуры в животном объекте.
- Ввись 25 мкл из 100 МК кардиотоксин (CTX; от Naja mossambica mossambica; ВНИМАНИЕ: потенциально вредное вещество) в мышцах голени передней (TA).
- 24 часа после лечения животных тамоксифеном и CTX, отделить клетки путем трипсинизации и рассчитывать.
- Центрифуга клеток при 232 x g в течение 5 мин.
- Вымойте клеточныегранулы вCa 2 "- и Mg2"-бесплатно PBS, центрифуга, а затем осторожно повторно клеточной гранулы в Ca2"- и Mg2"- бесплатно PBS до окончательной концентрации 106 клеток / 30 мкл, который будет окончательный объем каждой инъекции.
- Ввись 30 мкл клеточной суспензии в ранее травмированных мышц с помощью шприца с иглой 29 или 30 G. Обратите особое внимание при удалении иглы из мышцы. Делайте это медленно, избегая разлива клеточной подвески через след иглы. Не пересаживать контралатеральный TA и использовать его в качестве контроля, вводя 30 мкл Ca2"- и Mg2"-бесплатно PBS, чтобы повторить условия пересаженной один.
- Лечить животных тамоксифеном в течение шести дополнительных дней и вводить анальгезию(например, карпрофен) в течение двух дополнительных дней.
- Высаживать мышцы через 14 дней после трансплантации. Обработать и проанализировать образцы, подробно описанные в Протоколах 4 и 5.
2. Трансплантация в мышиных моделях мышечной дистрофии
Этот анализ трансплантации позволяет оценить степень присвещания ИДЕМ в мышиных моделях мышечной дистрофии. Зверей, обработанных следующим образом, также можно оценить для функционального улучшения фенотипа заболевания. Функциональные тесты могут быть выполнены, начиная с двух недель после трансплантации. Для того, чтобы усилить engraftment рассмотреть вопрос о выполнении претрансплантации беговой дорожке упражнения (как описано в Протоколе 3) и / или серийных инъекций клеток каждые три недели в течение 3x(т.е. в общей сложности 3 инъекции / мышцы).
- Внутримышечная трансплантация
- Предварительно обработать животных с внутри перитонеальной инъекцией 3,5 л/г 10 мг/мл тамоксифена (липорастворимая формула) за 24 часа до трансплантации и предварительной обработки клеток, добавляющих 1 МК 4OH-тамоксифен (аквостная формула) в среду роста на ночь до дня трансплантации.
- Отсоедините трипсинизацией, подсчитайте и центрифугировать клетки на 232 x g в течение 5 минут.
- Вымойте клеточныегранулы вCa 2 "- и Mg2"-бесплатно PBS, центрифуга, а затем повторно гранулы в Ca2"- и Mg2"-бесплатно PBS в концентрации 106 клеток / 30 мкл.
- Администрирование анальгезии и дезинфекции кожи животного (по желанию) с пувиденом йодом- или хлорексидином на основе дезинфицирующего средства. Это также поможет локализовать голени передней (TA), gastrocnemius (GC), и четырехглавой феморис (КК; в частности vastus intermedius) мышцы.
- Ввись 30 мкл клеточной суспензии в мышцы с помощью шприца с иглой 29 или 30 G. Для TA вставьте 5 мм иглы на 2 мм ниже вставки проксимального сухожилия (краниокодальное направление) с наклоном 15 градусов по отношению к голени и медленно ввишите клеточную подвеску при втягиванию иглы (пустой шприц с 2 мм иглы все еще внутри мышцы). Для GC и КК, повторить ту же процедуру, как подробные для TA, с основным отличием является caudocranial вставки иглы 2 мм выше миотендинового соединения ахиллова сухожилия для GC и 2 мм выше дистального сухожилия для КК (15 "наклон по отношению к бедренной кости). Обратите внимание при удалении иглы из мышцы, чтобы избежать разлива клеточной подвески через след иглы.
TROUBLESHOOTING: В случае низкого приразливания рассмотреть вопрос о введении несовершеннолетних (1-2 недель)мышей 7 с3 х 10 5 клеток / 10 мкл (обратите внимание, что в этом случае тамоксифен должен быть введен подкожно).
- Внутритериальная трансплантация
Эта часть протокола позволяет оценки способности MIDEMs и HIDEMs быть доставлены в артериальной циркуляции, пересечь стенку сосуда и способствовать регенерации скелетных мышц в мышцах вниз по течению к месту инъекции.- Предварительное лечение животных и клеток, как описано выше в шаге 2.1.1.
- Отсоедините путем трипсинизации и фильтра с 40 мкм ситечко клетки (для удаления кластеров из клеточной подвески в маловероятном случае, что ночь воздействия тамоксифена может привести к синтезу и образованию миотрубов из соседних клеток) рассчитывать и центрифуги клеток на 232 х г в течение 5 мин
- Вымойте гранулыклеток вCa 2 "- и Mg2"-бесплатно PBS, центрифуга, а затем повторно гранулы в Ca2"- и Mg2"-бесплатно PBS с 0,2 Международный
Единицы гепарина натрия (по желанию) до конечной концентрации клеток10 6 клеток/50 мкл. Добавьте 10% патентный синий краситель (окончательная концентрация: 1,25мг/мл в нормальном солевом растворе или Ca 2"- и Mg2"-free PBS) к раствору, чтобы визуализировать распределение клеточной подвески. - Администрирование анестезии и анальгезии к мыши в соответствии с руководящими принципами, регулирующими хирургические процедуры в конкретном учреждении животных объекта.
- Бритье паховой области (также известной как бедренной кости или треугольник Скарпа) и дезинфицировать кожу с povidone йода или хлоргексидина основе дезинфицирующего средства.
- Сделайте разрез диаметром 5-7 мм и локализуйте бедренную связку: вену, артерию и нерв (нерв лежит боково к артерии и вены medially).
- Аккуратно удалите соединительной фасции, которая покрывает расслоение с типсами.
- Отделите бедренную вену и нерв от артерии, мягко введя кончик типса (или 30 G иглы) между ними и постепенно увеличив отверстие.
TROUBLESHOOTING: Бедренная вена хрупкая: обратите внимание, чтобы не ущипнуть его щипся во время его отслоения от бедренной артерии. В случае кровоизлияния, слейте кровь стерильной марлей и использовать микро-прижигатель для облегчения гемостаз. - Поднимите артерию одним кончиком типса и зажимать артерию другим кончиком.
- Проколите артерию шприцем, оснащенным иглой 30 Г. Ввись 50 мкл клеточной подвески ниже по течению зажатой области, при скорости вливания около 5 мкл/сек.
TROUBLESHOOTING: Тщательно повторное использование клеток в шприце перед инъекцией: очень важно, чтобы избежать осадков клеток и образования пузырьков воздуха внутри шприца. Диаметр бедренной артерии немного меньше иглы 30 Г: будьте осторожны, чтобы не усечение артерии при вставке иглы. Патентный синий краситель позволяет распознать эффективность инъекции: при правильном введении вся конечность быстро станет светло-голубой. - Медленно удалить иглу и миппы из артерии, чтобы восстановить кровоток в конечности.
- Нанесите давление стерильной марлей, чтобы избежать кровотечения и/или при необходимости прижигать.
- Шов раны и контролировать животных до восстановления после анестезии.
- Администрирование анальгезии в течение 3 дней и осмотр раны ежедневно (в случае раневой инфекции обсудить это с персоналом животного объекта и вводить антибиотики по мере необходимости).
3. Результаты меры по трансплантации дистрофических животных: беговая дорожка испытаний
Начиная с двух недель после пересадки клеток, можно оценить функциональное смеся двигательной способности обработанных мышей с помощью тестов на беговую дорожку. Этот тест позволяет оценку толерантности к физическим упражнениям/выносливости обработанных мышей. Мышь считается усталым, когда лежит в зоне отдыха в течение более 5 сек, не пытаясь повторно использовать беговую дорожку после серии из 3 последовательных механических стимулов (один каждые 5 сек). Базовые измерения начинаются примерно за месяц до лечения и используются для оценки улучшения каждого из проверенных животных. За этим тестом могут последовать дополнительные анализы для мониторинга хрупкости волокон, улучшения силы, присвяжения, дифференциации пересаженных клеток и морфологического улучшения пересаженной мышцы (см. Обсуждение).
- Акклиматизировать животных (обычно три группы: обработанные, необработанные, и дикий тип / не дистрофический контроль) к упражнению до первого измерения: установить беговую дорожку на скорости 6 м / мин в течение 10 мин. Повторите процедуру через день в течение одной недели.
TROUBLESHOOTING: Замеская все измерения в один и тот же час дня, чтобы избежать предубеждений из-за циркадных циклов. - Поместите животных в беговую дорожку, которая ранее была создана с наклоном 10 ".
- Включите беговую дорожку со стартовой скоростью 6 м/мин (обеспечьте нежный механический стимул в случае, если животные не захотят начинать упражнение).
- Запустите таймер и увеличьте скорость 2 м/мин каждые 2 мин.
- Как только животное лежит в зоне отдыха более 5 сек, не пытаясь повторно поставить беговую дорожку, осторожно коснитесь ее палкой, чтобы стимулировать перезапуск упражнения (см. выше).
- Заместью производительность (время и или расстояние) каждого животного.
- Повторите измерения еженедельно или каждые 10 дней, по крайней мере 3x.
- Повторите ту же процедуру после трансплантации.
- Анализируйте данные о производительности, сравнивая измерение каждого животного с его базовой производительностью. Мы предлагаем совестить значения на графике в процентах от средней мощности двигателя по отношению к базовому уровню и проанализировать их с помощью одно- или двухготовного теста ANOVA с последующим соответствующим посттемпромом для сравнения групп.
TROUBLESHOOTING: используйте минимум 5 возрастных, генотип-, и секс-соответствует животных / группы и повторить измерения, по крайней мере 3x после трансплантации.
4. Оценка клеточного ретрансплантации и дифференциации пересаженных мышц
Пересаженные и контрольные мышцы собирают в соответствующую точку времени (<2 дня для краткосрочного анализа при пересадки, 2-3 недели для среднесрочного и >1 месяц для долгосрочного анализа). Если пересаженные клетки помечены GFP, прививка в свежеисплеженных мышцах может быть оценена путем прямой флуоресценции под ультрафиолетовым стереомикроскопом.
- Положите и ориентируйтесь вдоль вертикальной оси свежеиспленные мышцы в трагачантовой резинке (6% ж/в)
- Обезвоживаемые образцы в предварительно обезвретевших изопентанов в течение одной минуты, заморозить их в жидком азоте, по крайней мере 2 мин и поместить их сразу при -80 градусов по Цельсию для хранения.
- Обработать образцы с криостата, чтобы получить 7 мкм толщиной разделов на поляризованных слайдов. Пример большую часть мышц на слайдах, собирая около 8-10 слайдов с 30-40 разделов / слайд. Целесообразно собрать серию разделов в трубку 1.5 ml для того чтобы выполнить молекулярную биологию/биохимию анализы.
- Оцените клеточный привем с различным иммунофлуоресцентным окрашиванием, в зависимости от экспериментальной установки. Например, в случае трансплантации HIDEM у мышей Sgca-null/scid/bg, пятна с: a) антителом против Lamin A/C для обнаружения привитых ядер клеток человека; б) антитело против ламинина, чтобы визуализировать общую структуру мышц; и в) антитела против Sgca для обнаружения донорских полученных восстановления белка отсутствует в дистрофических животных.
- Количественная оценка с помощью флуоресцентного микроскопа, количество донорских ядер на мышечную секцию внутри и снаружи мышечных волокон и количество полученных донорами скелетных миофиберов на секцию.
5. Мышечная гистопатология
Гистопатологические анализы позволяют дать оценку морфологической структуре пересаженной мышцы. Архитектурное улучшение структуры тканей ожидается в результате подхода клеточной терапии.
- Исправить свежеиспленные мышцы с 4% параформальдегида в течение 1 часа при 4 градусов по Цельсию.
- Обезвоживаемые образцы восходящим градиентом сахарозы (например, 7,5-15-30% ж/в).
- Оставьте мышцы на ночь в самом высоком растворе сахарозы.
- Встраивание образцов в Tissue Tek OCT, поместите их в предварительно облицованный изопентан до тех пор, пока OCT не станет твердым (избегая полного погружения образцов), заморозьте их в жидком азоте, по крайней мере, на 2 мин и поместите их сразу на -80 градусов по Цельсию для хранения.
- Обработать образцы с криостата, чтобы получить 7 мкм толщиной разделов, как описано выше.
- Пятно разделов с гематоксилин и эозин или трихром Массона в соответствии с протоколами стандартного производителя.
Гематоксилин и эозин окрашивание позволяет рассчитать признаки регенерации мышц, такие как: а) количество миофиберов; б) поперечная секционная область; в) количество миофиберов, содержащих центральное ядро. Трихром Массона используется для расчета фиброзного индекса, что делается путем вычитания общей площади, занимаемой скелетными миофиберами, из общей площади изображения: полученная область в основном отражает соединительной и жировой инфильтрацией мышцы. Все анализы на изображениях могут быть выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH) с помощью инструмента измерения и плагина счетчика ячеек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сообщенные репрезентативные результаты следуют основным анализам in vitro/in vivo, изображенным в рабочем процессе на рисунке 1. 48 часов после 4OH-тамоксифен администрации МиоД-позитивные ядра идентифицируются в MyoD-ER трансдуцированных ИДЕМ в культуре(рисунок 2A). Клетки затем сливаются и дифференцируются в многоядерные миотрубы(рисунок 2B). При пересадке внутримышечно в муриновую модель острой мышечной травмы, ИДЕМ способствуют регенерации тканей(рисунок 3). Эффективность ИДЕМ в генно-клеточной терапии для муриновых моделей мышечной дистрофии была оценена тестом толерантности к бегу на беговой дорожке: Рисунок 4 показывает результаты, полученные после трансплантации МИДЕМ дикого типа в Sgca-null/scid/beige mice, показывая некоторое снижение двигательной способностиу обработанных мышей 7. Ex vivo анализ пересаженных мышц показывают GFP-положительные области, представляющие степень колонизации ИДЕМ в ткани хозяина(рисунки 5A-C), таким образом демонстрируя, что донорские клетки engraft в дистрофической мышцы. Важно отметить, что пересаженные клетки способны дифференцировать in vivo,образуя новые скелетные миофиберы. Действительно Рисунок 5 показывает Sgca выражение от генетически исправленных HIDEMs в Sgca-null/scid/beige мышей (Рисунки 5D и 5E). Структурное смекание в архитектуре пересаженных мышц можно оценить с помощью трихромного окрашивания Массона: рисунок 5F показывает уменьшение количества фиброзной ткани в обработанных мышцах.
Рисунок 1. Диаграмма потока протокола. Схема обеспечивает обзор стратегии, основанной на IDEM, от предварительных анализов дифференциации in vitro (слева) до различных шагов, необходимых для оценки привития, миогенного потенциала и функционального улучшения in vivo и ex vivo (справа). Темно-серые коробки содержат различные шаги, описанные в протоколе; светло-серые коробки содержат части метода, не описанные в данной статье. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 2. Оценка миогенного потенциала in vitro. (A) Иммунофлуоресценция, показывающая выражение ядерного миода в 4 из 7 миоД-ЭР, трансдированных ядрами MIDEM после 48 часов воздействия 4OH-тамоксифена. (B) Иммунофлуоресценция окрашивания для миозин тяжелой цепи (MyHC) на 4OH-тамоксифен-индуцированной HIDEM полученных миотрубов после одной недели в дифференциации среды (шкала бар, 200 мкм). Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 3. In vivo оценка клеточного притязания в модели острой мышечной регенерации. (A) Стереомикроскопические GFP флуоресценции изображения свежеиспеченного кардиотоксина травмированных tibialis передние мышцы explanted 2 недели после внутримышечной инъекции 106 GFP-HIDEMs (слева) и GFP-MIDEMs (в центре). Шкала бар, 2 мм. (B) Низкий (вверху) и высокий (внизу) увеличение фотографии мышцы пересажены с MIDEMs показано в (A) отображение GFP-положительных миофиберов. Шкала бар, 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 4. Тест на толерантность к бегу на беговой дорожке. Представитель беговой дорожки тест для трансплантации (IM и внутримышечной; ИА - внутритериальная). Sgca-null/scid/ бежевые мыши (106 клеток/инъекций) против нетрансплантированных дистрофических и недистрофических контрольных иммунодефицитных мышей. Сюжет показывает функциональное семека дистрофических мышей, пересаженных с помощью MIDEMs (на 12-22% больше, чем нетрансплантированных животных через 35 дней после трансплантации). Данные отображаются как средняя мощность двигателя по отношению к базовым показателям(т.е. 100% представляет собой базовую производительность каждой группы и только обработанные мыши значительно улучшают ее при повторных измерениях). ПЯ < 0,05; «P < 0.005, ANOVA в одну сторону. Из ранее опубликованных работ авторов7. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Рисунок 5. In vivo оценка энграфтирования и миогенного потенциала у мышиных моделей мышечной дистрофии. (A) Стереомикроскопические GFP флуоресценции изображения свежеиспленные голени передние мышцы Sgca-null/scid/beige мышей explanted 3-4 недели после внутримышечной инъекции 106 человека (HIDEMs, слева; трансплантация у несовершеннолетних мышей) и мурин (MIDEMs; справа) GFP-IDEMs. Шкала бар, 2 мм. (B) Стереомикрископический GFP флуоресценции изображение свежеисплешенной мышцы гастрочнемиуса explanted 3 недели после внутриартериальных инъекций 106 GFP-MIDEMs. Шкала бар, 1 мм. (C) Свежие замороженные поперечные части мышцы пересажены с MIDEMs показано в (A) отображения кластера GFP-положительных миофиберов. Шкала бар, 200 мкм. (D) Иммунофлуоресценция окрашивания на участках внутримышечных пересаженных мышц (как в A), показывающие кластеры генетически исправленных волокон, возникла из привитых ИДЕМов. Шкала бар, 150 мкм. (E) Количественная оценка α-саркогликан (Sgca)-положительных миофиберов через месяц после внутримышечной трансплантации генетически исправленных ИДЕМ в Sgca-null/scid/beige мышей. (F) Массон трихромное окрашивание передних мышц голени от пересаженных и контролировать Sgca-null/scid/beige мышей (красный: мышечные волокна; синий: фиброз), подчеркивая снижение фиброзного проникновения в обработанные мышцы. Шкала бар, 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую цифру.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
iPSCs могут быть расширены на неопределенный срок, сохраняя при этом свой потенциал самообувления и, таким образом, быть направлены на дифференцирование в широкий спектр клеточныхлиний 12. По этой и другим причинам iPSC полученных стволовых / прародителя клетки считаются перспективным источником аутологичной генной и клеточной терапииподходы 13. Ранее опубликованная работа авторов сообщила о генерации мыши и человеческих миогенных прародителей из iPSCs с фенотипом, похожим на фенотип перицита полученных MABs (IDEMs) и их эффективный вклад в регенерацию мышц в мышиной модели мышечнойдистрофии 7.
Предпосылкой для максимизации миогенного потенциала IDEM является выражение миогенного фактора миода в клетках. Трансдукция с тамоксифен-неприспособимой кассетой MyoD-ER позволила иметь точный временный контроль над его выражением с преимуществом синхронизации его активации во всей культуре, а затем in vivo. Стратегия трансплантации, основанная на одном введения клеток на мышцу (или на бедренную артерию), была описана в этой статье. Тем не менее, повторные инъекции клеток было показано, что эффективное увеличение MAB engraftment в различных протоколов клеточнойтерапии 8. Поэтому, в случае неоптимальных результатов с IDEMs, стоит выполнять повторные трансплантации для увеличения дозы клеток и, следовательно, вклад в принимающей мышцы.
Результаты измерений позволяют оценку вклада донорских клеток в функциональное семеять фенотипа обработанных животных. В дополнение к упражнению толерантности / выносливости тест, выполняемый с беговой дорожке, дальнейшие тестыдля анализа добровольной двигательной способности (например, тест на свободное колесо), хрупкость волокна (например, Эванс синий краситель поглощения анализа) и конкретные силы (например, одиночные волокна или всей механики мышц)можно считать 8. Дополнительные методы для проверки функционального улучшения фенотипа доступны в качестве стандартных операционных процедур на веб-сайте Treat-NMD(http://www.treat-nmd.eu/research/preclinical/dmd-sops/).
Для сбора значительной информации от пересаженных животных, функциональное смечение должно сопровождаться и проверено иммуногистохимических и гистологических анализов, для оценки клеточного притяжения и архитектуры тканей / реконструкции. В частности, важно оценить морфометрическую структуру привитых мышц на признаки регенерации и фиброза, такие как оценка количества волокон с центральным ядром, межотечной области миофиберов и фиброзного индекса. Последний анализ, а также функциональные результаты дают исчерпывающий обзор эффективности стратегии. Кроме того, мониторинг линии, принятой пересаженными клетками с точки зрения вклада в ткани(т.е. миофиберов) и поддержания отсека стволовых клеток имеет важное значение для долгосрочной эффективности всех стратегий клеточной терапии. В этом случае уже сообщалось о донорском вкладе in vivo в перицитный отсек, из которого получены мезоангиобласты7; кроме того, предварительные результаты свидетельствуют о функциональном вкладе ИДЕМ также в пул спутниковых ячеел (Gerli и Tedesco, неопубликованные результаты). Молекулярный анализ для демонстрации приразъемности и экспрессии исправленного гена(т.е. количественного ПЦР и западной помарки) также имеет решающее значение, но выходит за рамки настоящего документа и потребует специальной статьи.
Хотя этот протокол был в основном разработан с использованием Sgca-null/scid/beige mice7 (недавно опубликованная иммунодефицитная модель LGMD2D), ожидается, что он может быть легко применим к другим моделям мышечных заболеваний. В случае Sgca-null/scid/beige мы не использовали кардиотоксин, так как мышцы этих животных сильно скомпрометированы и хронически подвержены дегенерации и регенерации циклов (таким образом, дополнительный ущерб от кардиотоксина не является необходимым). Однако нельзя исключать, что предварительное лечение кардиотоксином может облегчить привитие у более мягких моделей мышечной дистрофии(например, у мышей mdx). Амелиорации нашей стратегии могут включать в себя методы повышения иммунодефицита мыши хозяина (который в нынешних моделях все еще неоптимальный) и эффективность ферментации донорских клеток, в частности, при внутриартериальной доставке ксеногенных клеток. Хотя многоклеточная трансплантация и использование несовершеннолетних мышей способствуют увеличениюклеточного присвечения 7,8,молекулы адгезии мыши, встречаемые клетками человека во время экстравазии и/или миграции, могут создавать дополнительные препятствия для ограниченного иммунодефицита нынешних моделей. Будущие направления перевода этого генного и клеточного подхода в клинических условиях могут включать фармакологические стратегии для повышения экстравазии клетоки использования неинтегрированных векторов (например, плазмиды, мРНК, искусственные хромосомы человека или неинтеграции вирусных векторов) для перепрограммирования и генетической коррекции клеток, что снижает риск вставки мутагенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
F.S.T. подала международную патентную заявку (нет. PCT/GB2013/050112) включая часть стратегии, описанной в данной статье. Он получил финансирование от Promimetic и DWC ltd. для своих исследований.
Acknowledgments
Авторы благодарят Джулио Коссу, Мартину Рагацци и всю лабораторию за полезное обсуждение и поддержку, а Джеффа Чемберлена за любезное предоставление вектора MyoD-ER. Все эксперименты с участием живых животных были завершены в соответствии со всеми соответствующими регулирующими и институциональными учреждениями, нормативными актами и руководящими принципами. Работа в лаборатории авторов поддерживается Британским советом медицинских исследований, 7-м рамочным проектом Европейского сообщества Optistem and Biodesign и итальянским родительским проектом Duchenne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | Sigma | M3942 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Horse serum | Euroclone | ECS0090L | |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14801F | |
| PBS Calcium/Magnesium free | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutammine | Sigma | G7513 | |
| Penicilline/Streptomicin | Sigma | P0781 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (Insulin-Transferrin-Selenium) | Gibco | 51500-056 | |
| Nonessential amino acid solution | Sigma | M7145 | |
| Fer-In-Sol | Mead Johnson | ||
| Ferlixit | Aventis | ||
| Oleic Acid | Sigma | 01257-10 mg | |
| Linoleic Acid | Sigma | L5900-10 mg | |
| Human bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| Grow factors-reduced Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Sodium heparin | Mayne Pharma | ||
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| Patent blue dye | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | Sigma | E-4884 | |
| Paraformaldehyde | TAAB | P001 | HARMFUL |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| 4-OH Tamoxifen | Sigma | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | Addgene | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | HARMFUL |
| Povidone iodine | |||
| Tragachant gum | MP Biomedicals | 104792 | |
| Isopenthane | VWR | 24,872,323 | |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | |
| Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
| Polarized glass slides | Thermo | J1800AMNZ | |
| Eosin Y | Sigma | E4382 | |
| Hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Masson's trichrome | Bio-Optica | 04-010802 | |
| Mouse anti Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF20 | |
| Mouse anti Lamin A/C antibody | Novocastra | NLC-LAM-A/C | |
| Hoechst 33342 | Sigma Fluka | B2261 | |
| Rabbit anti Laminin antibody | Sigma | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G Needle syringe | BD | 324826 | |
| Treadmill | Columbus instrument | ||
| Steromicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane unit | Harvad Apparatus | ||
| Fiber optics | Euromecs (Holland) | EK1 | |
| Heating pad | Vet Tech | C17A1 | |
| Scalpels | Swann-Morton | 11REF050 | |
| Surgical forceps | Fine Scientific Tools | 5/45 | |
| High temperature cauteriser | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| Media composition is detailed below. HIDEMs growth medium:
|
|||
Table 1. List of Reagents, Materials, Equipment, and Media. |
|||
References
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al. The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development. 129, 2773-2783 (2002).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat. Commun. 2, 499 (2011).
- Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. J. Clin. Invest. 120, 11-19 (2010).
- Sampaolesi, M., et al. Cell therapy of alpha-sarcoglycan null dystrophic mice through intra-arterial delivery of mesoangioblasts. Science. 301, 487-492 (2003).
- Sampaolesi, M., et al. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444, 574-579 (2006).
- Tedesco, F. S., et al. Transplantation of Genetically Corrected Human iPSC-Derived Progenitors in Mice with Limb-Girdle Muscular Dystrophy. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Tedesco, F. S., et al. Stem cell-mediated transfer of a human artificial chromosome ameliorates muscular dystrophy. Sci. Transl. Med. 3, (2011).
- Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J. Clin. Invest. 101, 2119-2128 (1998).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in Duchenne muscular dystrophy cells. Hum. Gene Ther. 20, 784-790 (2009).
- Kimura, E., et al. Cell-lineage regulated myogenesis for dystrophin replacement: a novel therapeutic approach for treatment of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 17, 2507-2517 (2008).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Wu, S. M., Hochedlinger, K. Harnessing the potential of induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Nat. Cell Biol. 13, 497-505 (2011).
