Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

ترتبط البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) بطائرات معينة من الجليد لمنع أو إبطاء نمو الجليد. تحليل تقارب الطائرة الجليدية القائمة على الفلورسينس (FIPA) هو تعديل للطريقة الأصلية لحفر الجليد لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس. يتم تسمية AFPs بفلورسنت ، ودمجها في بلورات الجليد الفردية العيانية ، وتصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

Abstract

يتم التعبير عن البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) في مجموعة متنوعة من الكائنات الباردة هاردي لمنع أو إبطاء نمو الجليد الداخلي. ترتبط AFPs بطائرات معينة من الجليد من خلال أسطحها الملزمة للجليد. تحليل تقارب الطائرة الجليدية القائمة على الفلورسينس (FIPA) هو تقنية معدلة تستخدم لتحديد الطائرات الجليدية التي ترتبط بها AFPs. ويستند الاتحاد الدولي للطائرات إلى الطريقة الأصلية لحفر الجليد لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس. وتنتج صورا أوضح في وقت تجريبي مختصر. في تحليل FIPA ، يتم تسمية AFPs بعلامة ثلاثية الفلورسنت أو صبغة تساهمية ثم يتم دمجها ببطء في بلورة جليدية واحدة مجهرية ، والتي تم تشكيلها مسبقا في نصف الكرة الأرضية وموجهة لتحديد المحاور a- و c. يتم تصوير نصف الكرة الجليدي المتجه إلى وكالة فرانس برس تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور الطائرات المتجهة إلى وكالة فرانس برس باستخدام مرشحات لمنع الضوء غير المحدد. يسمح وضع العلامات الفلورية ل AFPs بمراقبة امتصاص AFP في الوقت الفعلي في الجليد. وقد تبين أن التسميات لا تؤثر على الطائرات التي ترتبط بها ال AFPs. يقدم تحليل FIPA أيضا خيار ربط أكثر من وكالة فرانس برس الموسومة بشكل مختلف على نفس بلورة الجليد الواحدة للمساعدة في التمييز بين طائراتها الملزمة. وتساعد هذه التطبيقات من FIPA على تعزيز فهمنا لكيفية ربط AFPs بالجليد لوقف نموه ولماذا تعبر العديد من الكائنات الحية المنتجة لوكالة فرانس برس عن أشكال متساوية متعددة من ال AFP.

Introduction

إنتاج البروتينات المضادة للتجمد (AFPs) هو آلية هامة للبقاء على قيد الحياة لبعض الكائنات الحية التي تعيش في بيئات محملة بالجليد. حتى وقت قريب، كان يعتقد أن الوظيفة الوحيدة لAFPs هو منع أو إبطاء نمو بلورات الجليد الداخلية التي من شأنها منع الدورة الدموية، وتسبب تلف الأنسجة، والإجهاد التناضحي. الكائنات الحية التي لا يمكن أن تتسامح مع أي درجة من التجمد، مثل الأسماك، والتعبير عن AFPs لمنع نمو الكريستال الجليديتماما 1. البعض الآخر، مثل العشب، وتجميد متسامحة والتعبير عن AFPs لمنع التبلور الجليد الذي يقلل من تشكيل بلورات الجليد الكبيرة في أنسجة2. استقرار الأغشية في درجة حرارة منخفضة هو وظيفة أخرى التي اقترحت لAFPs3. في الآونة الأخيرة, واقترح دور جديد لوكالة فرانس برس من بكتيريا القطب الجنوبي, Marinomonas primoryensis, من البحيرات المالحة المغطاة بالجليد4. هذا القوات المسلحة الفلبينية هو جزء من بروتين الالتصاق أكبر بكثير5 التي يعتقد أن نعلق البكتيريا إلى الجليد للحصول على أفضل الوصول إلى الأكسجين والمواد المغذية6. ومن المعروف أن الميكروبات الأخرى تفرز AFPs ، والتي قد تغير بنية الجليد الذي يعيشون فيه7.

تم العثور على AFPs في بعض الأسماك والحشرات والنباتات والطحالب والبكتيريا والدياتومات والفطريات. لديهم تسلسلات وهياكل متباينة بشكل ملحوظ بما يتفق مع تطورها من أسلاف مختلفين في مناسبات مختلفة؛ وحتى الآن أنها ترتبط كل الجليد وتمنع نموه من قبل آلية الامتزاز تثبيط8. ولكل من هذه الأنظمة سطح محدد يعمل كموقع ملزم للجليد. وقد تم تحديد هذه عادة عن طريق تولد موقع موجهة من بقايا السطح9-11. ويفترض أن IBS لترتيب جزيئات الماء في نمط يشبه الجليد الذي يطابق طائرات محددة من الجليد. لذلك يشكل القوات المسلحة الفلبينية ليغاند قبل ملزمة لها5, 12. يمكن تعريف طائرات الجليد من خلال مؤشرات ميلر الخاصة بها ، ويمكن أن ترتبط AFPs المختلفة بطائرات مختلفة. وهكذا، نوع I AFP من الشتاء يتخبط يربط إلى 20-21 طائرات هرمية13، نوع III AFP يربط كل من المنشور الأولي والطائرات الهرمية باستخدام سطح مجمع الجليد ملزمة11،14، في حين أن شجرة التنوب budworm AFP، وكالة فرانس برس مفرط النشاط، يربط في وقت واحد إلى كل من الطائرات الأولية والبازلية15،16. أخرى AFPs مفرط، مثل النائبوكالة الصحافة الفرنسية، ربط طائرات الجليد متعددة كما هو مبين من خلال تغطيتها الكاملة لنصف الكرة الأرضية الكريستال الجليد واحد5،17. ومن المفترض، أن قدرة AFPs مفرط لربط الطائرة القاعدية، فضلا عن طائرات أخرى، قد تمثل نشاطهم أعلى 10 أضعاف على AFPs نشطةمعتدلة 18. على الرغم من أن كفاءة AFPs مفرط موثقة بشكل جيد ، إلا أن قدرتها على الارتباط بطائرات جليدية متعددة لا تزال غير مفهومة.

تم تطوير الطريقة الأصلية لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس من قبل تشارلز نايت13،19. في هذه الطريقة ، يتم تركيب بلورة جليدية واحدة مجهرية على قضيب معدني مجوف (الإصبع البارد) وتشكلت في نصف الكرة الأرضية عن طريق غمرها في كوب نصف كروي مملوء بالماء غير المغص. ثم، يتم غمر نصف الكرة الأرضية في محلول مخفف من AFPs وتزرع طبقة من الجليد من محلول AFP على نصف الكرة الأرضية الكريستالي الجليدي على مدى عدة ساعات تسيطر عليها درجة حرارة جلايكول الإيثيلين المتداولة من خلال الإصبع البارد. تتم إزالة الكريستال الجليد من الحل، منفصلة عن الإصبع البارد، ووضعها في غرفة التجميد -10 إلى -15 درجة مئوية. يتم كشط السطح بشفرة حادة لإزالة الفيلم السطحي المجمد لمحلول البروتين المضاد للتجمد ويسمح لكريستال الجليد بالتسامي لمدة 3 ساعات على الأقل. بعد التسامي، يمكن النظر إلى الطائرات الجليدية المقيدة ب AFPs على أنها أنماط محفورة بيضاء مشتقة من البروتين المتبقي. يمكن توجيه نصف الكرة الجليدي إلى محوره cوفؤوسه ، لتحديد موقع الطائرات القاعدية والمنشور من الجليد ، وتحديد مؤشرات ميلر للبقع المحفورة.

هنا نصف تعديل الطريقة الأصلية لتحديد الطائرات المتجهة إلى وكالة فرانس برس من الجليد ، وهي طريقة نشير إليها باسم تقارب الطائرة الجليدية القائمة على الفلور (FIPA)11. وصفت AFPs الفلورسنت مع إما علامة الشميريك، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)11،16،17،20، أو مع صبغة الفلورسنت ملزمة بشكل متناقض إلى وكالة فرانس برس5،21. يتم تسمية الفلورسنت AFPs ممتزة ببلورة جليدية واحدة ومتضخمة باستخدام نفس الإجراء التجريبي مثل تجارب حفر الجليد الأصلية. ويمكن رصد مدى ارتباط وكالة فرانس برس لنصف الكرة الجليدي المتنامي طوال التجربة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية. بعد اكتمال التجربة ، يمكن أن يؤخذ نصف الكرة الأرضية مباشرة من الإصبع البارد وصوره ، دون تسامي. ومع ذلك ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن ترك نصف الكرة الأرضية لتتسامي لتصور حفر الجليد التقليدي. وتقلل التعديلات التي أدخلت على منهجية الاتحاد الدولي للجليد من البروتوكول التقليدي لحفر الجليد بعدة ساعات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك إمكانية لتصوير عدة AFPs في وقت واحد ، كل منها مع تسمية فلورية مختلفة ، لتصور الأنماط المتداخلة للطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. زراعة بلورات الجليد واحد

  1. خذ مقلاة معدنية نظيفة (قطرها 15 سم، وارتفاعها 4.5 سم) تناسب حمام تبريد جلايكول الإيثيلين ويمكن أن تطفو عليه.
  2. إعداد قوالب أسطوانية كلوريد متعدد الفينيل (PVC)، (قطرها 4.5 سم، 3-4 سم، 4 مم سميكة)، عن طريق أقسام منشار من أنبوب.
    1. قطع درجة، (1 ملم واسعة، 2 مم عالية) على جانب واحد (الشكل 1A).
    2. إعداد العديد من القوالب التي يمكن أن تناسب بشكل مريح في المقلاة (الشكل 1B).
      ملاحظة: أظهرت دراسة أن الكحول البوليفينيل (PVA) يمكن أن تؤثر على نواة الجليد22. ومع ذلك، في نظامنا البلاستيكية العفن مفتوحة لم نواجه مشاكل تكوين الجليد غير نمطية.
  3. تطبيق فيلم خفيف من الشحوم فراغ إلى حلقة السطح السفلي من كل قالب، وهو السطح مع قطع الشق. ختم هذا مدهون، سطح الشق على مقلاة معدنية مع الشقوق الموجهة بعيدا عن وسط المقلاة. يجب الحرص على عدم ملء أو عرقلة الشقوق مع الشحوم.
  4. إضافة 0.22 ميكرومتر تصفية وإزالة الغاز / deionized المياه إلى وسط المقلاة، ولكن خارج القوالب، والسماح للماء للدخول ببطء في قوالب من خلال الشقوق. كن حذرا من إدخال أي فقاعات. يجب أن تكون طبقة الماء حوالي 5 مم عميقة.
  5. ضع المقلاة في حمام جلايكول الإيثيلين الذي يتم التحكم في درجة حرارته ويبرد إلى -0.5 درجة مئوية. المقلاة يجب أن تكون مستوية تماما. إضافة أوزان الصابورة إلى جانبي المقلاة إذا لزم الأمر.
  6. بعد أن تصل المقلاة والماء إلى -0.5 درجة مئوية، أضف قطعة صغيرة من الثلج إلى منتصف المقلاة، خارج القوالب.
    1. وهذا سوف نواة نمو الجليد في المياه فائقة التبريد عبر المقلاة وإلى قوالب. الشق الصغير في الجزء السفلي من كل قالب يسمح بلورة الجليد واحد فقط لنشر من خلال، مما أدى إلى بلورة الجليد واحد في كل قالب.
    2. احتضان بين عشية وضحاها لتشكيل طبقة من الجليد.
  7. على مدى الأيام الثلاثة المقبلة إضافة 13 مل من 4 °C degassed / deionized المياه إلى كل قالب مرة واحدة في اليوم وانخفاض درجة حرارة حمام غليكول الإيثيلين بعد كل إضافة إلى -0.8 درجة مئوية في اليوم الأول، إلى -1.1 درجة مئوية في اليوم الثاني، وإلى -1.5 درجة مئوية في اليوم الثالث.
    1. احتضان في تلك درجات الحرارة بين عشية وضحاها.
    2. بحلول اليوم الرابع، يجب أن تكون القوالب مليئة تماما بالجليد.
  8. سحب قوالب قبالة المقلاة، ودفع بلورات الجليد من قوالب، وتخزينها على سطح نظيف، مثل قارب وزنها، في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تقريبا قبل التعامل معها.
  9. بدلا من إعداد العديد من بلورات الثلج الصغيرة واحدة، يمكن إعداد بلورة الجليد واحدة كبيرة عدة لترات في الحجم في حاضنة درجة حرارة ثابتة كما وصفها فارس23. يمكن تخزين الكريستال الجليدي الكبير لمدة عام أو أكثر إذا تم الاحتفاظ به مغطى في ثلاجة -15 إلى -20 درجة مئوية. يمكن قطع أجزاء من الكريستال واحد من كتلة الجليد مع منشار على النحو المطلوب.

2. تحديد التفرد والتوجه من كريستال الجليد

  1. تحديد ما إذا كان الثلج طرد من القالب هو بلورة واحدة من خلال مراقبة في غرفة التجميد، بين اثنين من بولارويد عبرت (الشكل 1D).
    1. إذا كان الكريستال الجليد هو واحد، ثم لا ينبغي أن ينظر إلى الشقوق أو الانقطاعات، واتجاه الضوء لا ينبغي أن تتغير داخل الكريستال الجليد.
      ملاحظة: إذا كانت غرفة التجميد غير متوفرة، يمكن استخدام غرفة باردة بدلا من ذلك في جميع الخطوات المطلوبة، مع توخي الحذر للعمل بسرعة والتعامل مع الجليد لماما.
  2. بسبب ثنائية الاستخلاص الجليدي، يمكن للمرء أن يحدد اتجاه المحور cفي نفس الوقت. استخدم المعلومات التالية لتحديد الاتجاه:
    1. عندما يكونالمحور c موازيا تماما لضوء الحادث ، من الناحية النظرية ، لن يمر أي ضوء عبر بولارويدس المتقاطعة. إذا كان عنوان ضوء الحادث قليلا من موازية مع جالمحور، يتم نقل طيف موحد متعدد الألوان من الضوء من خلال الكريستال عندما يتم تدويرها بين بولارويدس عبرت. هذا الإرسال موحدة تنشأ من الخمول البصري للجليد أناح على طول جالمحور24. المستوى القاعدي من بلورة الجليد طبيعي للمحور c.
    2. عندما يكونالمحور c أبعد من موازاة ضوء الحادث ويتم تدوير بلورة الجليد بين بولارويدس المتقاطعة ، فإن الضوء المرسل سيتناوب بين الإرسال بنسبة 0-100٪ مع كل 90 درجة من دوران الكريستال.
    3. الأكثر شيوعا، فإن جالمحور يكون طبيعيا إلى المستوى الدائري من الكريستال الجليد أسطواني.
  3. تحديد اتجاه -axesبواسطة الجليد تأليب25 الذي يتم عن طريق التفاف الكريستال الجليد بإحكام في رقائق الألومنيوم، بدس ثقب صغير مع إبرة من خلال احباط في الجليد على الطائرة القاعدية (طبيعية إلى جالمحور)، ووضعه تحت فراغ لمدة 20 دقيقة.
    1. هذا العلاج سوف تنتج حفر مع التماثل سداسية على المستوى القاعدي، حيث الفؤوس -تشغيلمن خلال القمم من النجم سداسية الجوانب (الشكل 2A).
    2. إذا رغبت في ذلك، يمكن قطع بلورة الجليد مع منشار إما موازية أو عمودية على جانب واحد من السداسي لتركيبه مع الطائرة المنشور الابتدائي أو الثانوي عمودي على الإصبع البارد، على التوالي (الشكل 3).

3. الامتزاز من Fluorescently المسمى بروتينات مضاد للتجمد إلى كريستال الجليد واحد

  1. جبل بلورة الجليد واحد على الاصبع البارد (الشكل 1C) من قبل مملة أولا تجويف في الجزء العلوي من الكريستال. للقيام بذلك، بالتناوب ذوبان الجليد مع اثنين من قضبان الألومنيوم من قطر مختلف قليلا، ولكن على غرار قطر الإصبع البارد، لتشكيل تجويف الذي يمكن أن يصلح الاصبع البارد.
  2. يبرد الإصبع البارد إلى -0.5 درجة مئوية، ويوضع في تجويف الجليد، ويمسك بلورة الثلج في مكانها حتى تتجمد إلى المعدن (الشكل 2B). تجنب فقاعات الهواء عند إرفاق الكريستال إلى الإصبع لأنها تعيق نقل كفاءة الحرارة من الإصبع إلى قضيب.
  3. ملء كوب نصف كروي الذي هو تقريبا ضعف قطر الكريستال الجليد مع المياه المصفاة deionized أو العازلة، وتبريدها إلى ما يقرب من 4 درجة مئوية. غمر الكريستال الجليد الباردة الاصبع ملزمة في الكأس وإزالة المياه الزائدة أو العازلة بحيث الجزء العلوي من الكريستال الجليد هو مستوى تقريبا مع طبقة السائل والجليد لا تلمس جدران الكأس.
    1. تغطية الكأس مع العزل وخفض درجة الحرارة إلى -5 درجة مئوية.
    2. انتظر ما يقرب من 1 ساعة لكريستال الجليد لتشكيل في نصف الكرة الأرضية، والتحقق من حالتها تقريبا كل 20 دقيقة (الشكل 2C).
    3. سوف يأخذ الجليد شكل الكأس نصف الكروية عن طريق ذوبان وزراعة بلورة الجليد ، ولكن لا ينبغي أبدا أن ينمو أكثر من أن يلمس جدران الكأس. يجب أن يكون هناك على الأقل فجوة 1 سم بين الجدار ونصف الكرة الأرضية والإصبع البارد لا ينبغي أن تبرز من الجليد.
  4. إزالة الكأس من الكريستال الجليد وإضافة محلول البروتين الفلوري إلى حجم النهائي من 25-30 مل والتركيز التحليل المطلوب، مع الحرص على الحفاظ على إجمالي حجم السائل في الكأس دون تغيير. تركيز وكالة فرانس برس نموذجي هو 0.1 ملغ / مل.
    1. إعادة دمج الكريستال الجليد في الكأس بحيث الجزء العلوي من الكريستال الجليد هو في مستوى مع السائل والكريستال الجليد لا تلمس جدران الكأس (الشكل 2D).
    2. انخفاض درجة حرارة الإصبع البارد إلى -8 درجة مئوية والسماح للمحلول البروتين تجميد في الكريستال الجليد لمدة 2-3 ساعة، واثارة الحل في كثير من الأحيان. يجب أن يكون الجليد المشكل من محلول البروتين 5 ملم على الأقل قبل وقف نمو الجليد.
  5. إزالة الكريستال الجليد من الكأس في حين لا تزال تعلق على الاصبع البارد. فصل الجليد من هذا الأخير عن طريق تسخين المبرد من خلال الإصبع البارد إلى ما يزيد قليلا على 0 درجة مئوية والانتظار حتى يذوب الكريستال الجليد قبالة.
  6. ضع الجانب المسطح البلوري على سطح نظيف ، مثل طبق الوزن ، مع الحرص على عدم لمس الجليد الذي تم تشكيله حديثا وتخزينه عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل تسليمه.

4. تصور الطائرات المضادة للتجمد البروتين ملزمة من الجليد

  1. يتم تصور الفلورسينس في ثلاجة مظلمة أو غرفة باردة ، عن طريق وضع الجانب المسطح من الكريستال الجليدي أسفل تحت المصابيح مع مرشحات إثارة محددة الطول الموجي لإثارة تسمية الفلورسنت ومرشحات انبعاثات الكاميرا لمنع أي ضوء آخر غير محدد. واستنادا إلى النمط، يمكن تقدير الطائرات الجليدية التي تربطها الطائرات ذات المستويات المتوسطة (الشكل 4).
  2. إذا لم تتوفر أضواء محددة الطول الموجي يمكن استخدام مربع ضوء الأشعة فوق البنفسجية بدلا من ذلك.
  3. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ الشقوق الجليدية التقليدية ببساطة عن طريق السماح لنصف الكرة الأرضية الجليدية لتمييز في -20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات على الأقل، وبعد ذلك مسحوق البروتين المتبقية قد تصبح مرئية على سطح الجليد (الشكل 5).
  4. يمكن تكرار الخطوة 2.3 من أجل تحديد اتجاه -محاورنصف الكرة الجليدي المكتمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إعداد وتركيب بلورة الجليد واحد هي خطوتين من الإجراء FIPA حيث يتم إجراء الأخطاء الأكثر شيوعا. يتم تحديد ما إذا كان يتم إعداد الكريستال الجليد واحد عن طريق فحصه من خلال بولارويدس عبرت (الشكل 1D)، كما هو موضح في الخطوة 2.1 من قسم البروتوكول. إذا تم استخدام بلورة الجليد متعددة البلورات لتحليل FIPA، فإن النتيجة ستكون ملزمة متقطعة من AFPs على نصف الكرة الأرضية دون نمط ملزم متماسك (الشكل 6B). إذا كانت واجهات الكريستال الجليدي موجودة حول الطائرات الجليدية التي تربط وكالة الصحافة الفرنسية النتيجة النهائية قد لا تكون قابلة للتفسير. لهذا السبب، يجب فحص الكريستال الجليدي بعناية للتأكد من التفرد قبل الانتقال إلى الخطوات التالية. لزيادة احتمال وجود بلورات الجليد واحد لتحليل FIPA عدة ينبغي أن يتم في نفس الوقت.

خطأ شائع آخر هو محاذاة الوجوه الكريستالية بشكل غير صحيح مع الإصبع البارد أثناء التركيب. لتركيب المنشور الأساسي أو الثانوي يواجه عمودي على الإصبع البارد، يجب أن تكون بلورة الجليد واحدة موجهة أولا عن طريق تأليب الجليد، ثم قطع على أساس اتجاه الحفر على شكل نجمة (الشكلين 2A و 3)،كما هو موضح في الخطوة 2.3 من قسم البروتوكول. إذا تم تركيب الكريستال الجليدي المنحرفة النتيجة النهائية سوف تنتج نصف الكرة الأرضية حيث خط الاستواء في نصف الكرة الأرضية لا تتماشى مع التماثل من الطائرات الجليد (الشكل 6C). على الرغم من أن هذه نتيجة قابلة للتفسير ، إلا أنها ستكون أقل إفادة من بلورة الجليد المنحازة بشكل صحيح لأن أكبر محيط لنصف الكرة الأرضية هو عند خط الاستواء (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 معدات لزراعة وتركيب بلورات الجليد واحد. أ) قوالب PVC. ب)عموم في حمام غليكول الإيثيلين مع قوالب PVC. ج)الإصبع البارد مع تدفق غليكول الإيثيلين التي تظهر من قبل السهم الأبيض. يشير الخط الأبيض المتقطع إلى الجدار الداخلي للاصبع البارد. د)رسم تخطيطي من بولارويدس عبرت لتوجيه بلورة الجليد واحد. مصدر الضوء أصفر، بولارويدات متقاطعة رمادية وكريستال الجليد واحد أبيض. يشار إلى اتجاه بولارويدس (السهام الرمادية) واتجاه الكريستال الجليدي (السهام الحمراء). من اليسار إلى اليمين يتم توجيه الكريستال الجليد بحيث c-محورعمودي على بولارويد السفلي، 45° إلى بولارويد السفلي، وبالتوازي مع ضوء الحادث. الضوء يمر على الرغم من بولارويد عبرت والجليد سوف تظهر مظلمة، والضوء، أو متعددة الألوان باهتة من خلال بولارويد أعلى اعتمادا على اتجاه الكريستال الجليد. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم إعداد الكريستال الجليد لFIPA. أ)تحديد محاور التوجهات بواسطة حفر الجليد مع التماثل سداسية. plane القاعدية من الكريستال موازية إلى مستوى الصفحة. ب)تركيب الكريستال الجليد واحد على الاصبع البارد. ج)الجليد بعد تشكيل في نصف الكرة الأرضية. د)نصف الكرة الأرضية الجليدية المغمورة في كوب نصف كروي مليئة محلول البروتين. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تصاعد الكريستال الجليد على أساس التوجه. أ)رسم تخطيطي للجليد المتصاعد مع (1) الطائرة القاعدية ، (2) طائرة المنشور الأساسي ، و (3) طائرة المنشور الثانوي عمودي على الإصبع البارد. بالنسبة للتوجيهين (2) و (3) يجب قطع الكريستال الجليدي إلى نصفين، كما هو موضح في الشكل. ب)نتائج FIPA من المحيط الهادئ الأزرق المسمى نوع III nfeAFP8 بعد تصاعد بلورات الجليد مع (1) الطائرة القاعدية و (2) طائرة المنشور الأولي عمودي على الإصبع البارد. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تفسير الطائرات المتجهة إلى وكالة فرانس برس من نتائج تحليل FIPA. أ)تمثيل الطائرات ملزمة منالجليد ح أنا؛ و B) نتيجة تحليل FIPA المقابلة عندما يتم تركيب بلورة الجليد واحدة مع الطائرة المنشور الأساسي عمودي على الإصبع البارد. تمثل الألواح (1) المستوى القاعدي، و(2) مستوى المنشور الأساسي، و(3) مستوى المنشور الثانوي، و(4) الطائرة الهرمية المنحازةإلى المحاور - و(5) الإزاحة الهرميةإلى -axes. ج)مورفولوجيا بلورة الجليد واحد عندما نمت في حل AFPs التي تربط الطائرات الهرمية 1) محاذاةإلى -axes و2) تعويض من -محاور. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 5
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم مقارنة بين شقوق الجليد التقليدية مقابل FIPA. أ)(1) يظهر النقش التقليدي من النوع الأول AFP (HPLC6 isoform) الذي ينتجه التخبط الشتوي(Pseudopleuronectes americanus)كما أنتج في الأصل من قبل نايت وآخرون.، (1991). '2' تحليل FIPA المقابل لنفس البروتين المسمى مع TRITC. ب)(1) النقش التقليدي من متحولة IBS رباعية (V9Q/V19L/G20V/I41V) من النوع الثالث nfeAFP11 (من العبوس ثعبان البحر الياباني Zoarces elongatuskner)21. '2' تحليل FIPA المقابل لنفس البروتين المسمى مع TRITC. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 6
الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 نصفي الكرة الأرضية الناتجة عن أخطاء تحليل FIPA الشائعة. وأجريت تحليلات على النوع الثالث HPLC12-A16H الموسوم ب GFP. أ) نتيجة FIPA الأمثل للمقارنة. تم تركيب الكريستال الجليدي بطائرة المنشور الأساسية عموديا على الإصبع البارد. ب)تحليل FIPA الذي أجري عن غير قصد باستخدام نصف الكرة الأرضية الجليدية تتألف من أكثر من بلورة واحدة. ج)تحليل FIPA الذي أجري على بلورة الجليد واحد المنحرفة. لم يتم تركيب الطائرة المنشور الثانوي عمودي بالضبط على الإصبع البارد. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 7
الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم استخدام تحليل FIPA لمقارنة أنماط ربط الجليد من AFPs المختلفة. تم الجمع بين نوع المحيط الهادئ المسمى الأزرق III nfeAFP8 مع النوع I AFP المسمى TRITC وأجري تحليل واحد ل FIPA. أ)التصور من النوع الثالث nfeAFP8 فقط. ب)تصور من النوع الأول وكالة الصحافة الفرنسية فقط. ج)تصور من النوع الثالث nfeAFP8 ونوع I وكالة الصحافة الفرنسية معا. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 8
الشكل 8 - الأرقام 8- الأرقام التي تم FIPA من AFPs نشطة بشكل معتدل وفرط النشاط. أ) تحليل FIPA لثلاثة مختلف AFPs الأسماك النشطة باعتدال؛ (1) TRITC المسمى نوع I AFP (HPLC6 isoform، Pseudopleuronectes americanus)،(2) TRITC المسمى نوع II AFP (Ca2+- isoform مستقلة، Longsnout الصياد)، (3) المحيط الهادئ الأزرق المسمى نوع الثالث وكالة فرانس برس (nfeAFP8 isoform، Zoarces elongatuskner). ب) تحليل FIPA لثلاثة AFPs مفرط النشاط مختلفة؛ (ط) GFP الموسومة النائبAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (2) TRITC المسمى sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (3) GFP الموسومة TMAFP (Tenebrio موليتور). في جميع الصور، يكون محور cعموديا على مستوى الصفحة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Figure 9
الشكل 9 - الأرقام 10-199 علاقة نمط الفلورسنت التي تنتجها تحليل FIPA إلى مورفولوجيا الكريستال الجليدي من نوع مختلف III AFP isoforms والمسوخ11,21. أ)'1' تحليل وكالة الاستخبارات المالية ل QAE-A16H الموسومة ب GFP. '2' مورفولوجيا بلورية جليدية تنتجها QAE-A16H. ب)'1' تحليل وكالة الاستخبارات المالية لهيئة مكافحة العلامات التجارية الدولية (TRITC) nfeAFP11-V9Q. '2' مورفولوجيا بلورية جليدية تنتجها nfeAFP11-V9Q. ج) '1' تحليل وكالة الاستخبارات المالية ل "تريتك" المسمى "nfeAFP11" البرية. '2' مورفولوجيا بلورية جليدية تنتجها منظمة nfeAFP11 البرية. د) '1' تحليل وكالة الاستخبارات المالية ل NfeAFP6 المسمى ب TRITC. '2' مورفولوجيا بلورية الجليد تنتجها nfeAFP6 البرية. يتمتوجيهات المحور C وأشرطة المقياس كما هو موضح. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تطوير طريقة حفر الجليد من قبل تشارلز نايت لتحديد الطائرات الجليدية المتجهة إلى وكالة فرانس برس دراسات متقدمة إلى حد كبير حول آلية ربط الجليد من قبل AFPs. وفي حين يمكن حل هياكل الملوثات المضادة للتسرب عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية26,27، لم تكن هناك طريقة واضحة لتطوير السطح التكميلي على الجليد الذي ربطته وكالة الصحافة الفرنسية. عندما كان النوع الأول وكالة الصحافة الفرنسية من تخبط الشتاء تميزت في البداية، كان من المفترض أن ربط إلى الطائرات المنشور الأساسي من الجليد28. ومع ذلك ، أظهرت تجارب نايت الرائدة في حفر الجليد من النوع الأول AFP أنها ترتبط بطائرات هرمية من الجليد13. حفزت هذه النتيجة مجتمع أبحاث وكالة فرانس برس على إعادة النظر في آلية ربط الجليد لوكالة فرانس برس وتحديد الوجه الملزم للجليد بدقة أكبر ل AFPs9. تم إجراء تجارب نايت الأصلية لحفر الجليد باستخدام AFPs الأصلية التي تم تنقيتها من الكائنات المنتجة لوكالة فرانس برس. مع تطوير AFPs المؤتلف والاستخدام المتزايد لعلامات GFP ، كانت هناك فرصة لتوسيع نطاق هذه الدراسات لتشمل العديد من AFPs29.

جاءت فكرة دمج الأصباغ البروتينية الفلورية التساهمية ، مثل رباعي ميثيل هودامين -5 -(و 6) - ايزوثيوسيانات (TRITC) ، في التحليل فقط بعد نجاح تحليلات وكالة فرانس برس التي تنصهر في وكالة فرانس برس11. وقد لوحظت علامات البروتين الفلورية الشميرية والتعديلات الكيميائية من الأصباغ التساهمية لا تؤثر على أنماط ربط الجليد من AFPs (الشكل 5). مع الأول ، يتم دمج GFP إما في طرفي N - أو C - من AFPs ، والتي غالبا ما تكون بعيدة بشكل جيد عن IBS. كما يمكن إدخال رابط مرن بين GFP و AFP مما يسمح بدفع العلامة بعيدا عن سطح الجليد. مع استراتيجية وضع العلامات الأخيرة ، عادة ما تكون السلاسل الجانبية المشحونة التي تتفاعل مع الأصباغ التساهمية على أسطح بعيدة عن IBS. إذا كانت الاستراتيجيات المقدمة هنا لوضع العلامات FLUORESCENTLY AFPs لا تعمل، وإدخال السيستين بعيدا عن IBS لرد الفعل مع الأصباغ ثيول التفاعلية هو خيار آخر30. من خلال اتخاذ تدابير لضمان التسميات الفلورية لا تؤثر على ربط الجليد وكالة فرانس برس، كما حكم عليها من خلال نشاط التنويم المغناطيسي الحراري ومورفولوجيا الكريستال الجليد، ونحن واثقون من أن تحليل FIPA يظهر التمثيل الحقيقي للأنماط ربط الجليد وكالة فرانس برس، كما فعلت في طريقة حفر الجليد الأصلي.

هناك العديد من الفوائد لوضع العلامات الفلورية AFPs لتحليل FIPA. ويلزم وقت أقل لإجراء ذلك لأن لا حاجة إلى تسامي الجليد لتصور الطائرات المتجهة إلى وكالة فرانس برس. ويمكن رصد إدراج البروتين المسمى في نصف الكرة الأرضية أثناء نمو الجليد لتقييم الإنجاز التجريبي ويمكن تسجيل النمط الملزم لوكالة فرانس برس في أي وقت. وهذا يمنع التجارب الطويلة دون داع، أو الانتهاء المبكر من نمو الجليد. يسمح وضع العلامات الفلورية بتصور أوضح لنمط ربط AFP مما كان ممكنا من قبل مع النقش ، كما يتضح في مقارنة النتائج من كلا الأسلوبين المطبقين على النوع الأول والنوع الثالث AFPs (الشكل 5). ومع ذلك، يمكن إجراء حفر الجليد بعد FIPA بسهولة عن طريق وضع نصف الكرة الأرضية في الثلاجة لعدة ساعات، مما يعني أنه يمكن إجراء كلا التحليلين على نفس العينة لأن هناك حاجة إلى تركيزات مماثلة من القوات المسلحة الفلبينية لكلا الطريقتين. ميزة قيمة من FIPA هو القدرة على تصور أكثر من واحد وكالة فرانس برس وصفت بشكل مختلف على نصف الكرة الأرضية الجليدي نفسه (الشكل 7). وهذا مفيد لتوضيح الاختلافات في طائرات وكالة فرانس برس ملزمة الجليد ينظر مع أنواع مختلفة من وكالة فرانس برس، isoforms، والمسوخ النشاط.

وقد استخدم تحليل وكالة الاستخبارات المالية بالفعل في العديد من دراسات وكالة الصحافة الفرنسية. وقد تم استخدامه لدعم فرضية أن ربط الطائرة القاعدية هي فريدة من نوعها لAFPs مفرط وضروري لنشاطها العالي18. تم العثور على AFPs نشطة بشكل معتدل لا لربط الطائرة القاعدية (الشكل 8A) ولكن العديد من AFPs مفرط تغطي تماما نصف الكرة الجليدي، بما في ذلك الطائرة القاعدية من الجليد (الشكل 8B)5،20،31. كما استخدم تحليل وكالة الاستخبارات المالية لدراسة وظيفة بقايا محددة ملزمة للجليد. فعلى سبيل المثال، أجري تحليل ل FIPA على عدة أشكال من النوع الثالث ومسوخ، بعضها يمنع نمو الجليد، وبعضها وجد أنه لا يشكل سوى الجليد11,21,32. من الدراسات، وجد أن بقايا معينة مهمة في دمج AFPs في الجليد وغيرها مهمة في خصوصية الطائرة الجليدية (الشكل 9).

وتشمل الأساليب الأخرى لدراسة أنماط الربط وكالة فرانس برس على بلورات الجليد واحد المراقبة المباشرة عن طريق المجهر الفلوري16333 وmicrofluidics34. هذه الأساليب لديها ميزة الحساسية لدينامية تعلق وكالة فرانس برس على الجليد ورصد الجليد تشكيل simultaneity مع تقارب وكالة فرانس برس على الجليد ، ولكن أقل قوة مقارنة لطريقة FIPA في تحديد تقارب لطائرات الجليد. كما يتم استخدام الديناميات الجزيئية للتنبؤ خصوصية ربط الطائرة الجليدية من AFPs12,20,21,30,35. باستخدام تحليل FIPA ، جنبا إلى جنب مع التقنيات الأخرى المتاحة ، ونحن نتعلم أنماط ربط الطائرة الجليدية من كل AFPs ، وأهمية تكوين IBS في اختيار الطائرات الجليدية ، وكيف يرتبط ربط طائرات محددة لنشاط وكالة فرانس برس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يحمل PLD كرسي البحوث الكندية في هندسة البروتين. وقد مول هذا العمل بمنحة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية إلى وزارة الصحة. كما تم دعم هذا العمل بمنحة في المعونة للبحث العلمي من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (رقم 23310171) ومن المؤسسة اليابانية لتقدم بحوث التكنولوجيا ذات التوجه الحيوي (BRAIN). ونحن ممتنون للدكتورين كريس مارشال ومايك كويبر على العمل الرائد الذي أدى إلى الاتحاد الدولي للقوات المالية. كما أننا ممتنون للدكتور ساكاي تسودا على توفير المرافق لبعض من هذا العمل والدكتور لوري غراهام لإعداده فلاتر الإثارة الضوئية الفلورية والانبعاثات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Tags

الكيمياء، العدد 83، المواد، علوم الحياة، البصريات، البروتينات المضادة للتجمد، الامتزاز الجليدي، وضع العلامات الفلورية، طائرات شعرية الجليد، البروتينات الملزمة للجليد، بلورة الجليد المفردة
تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter