Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Bestemmelse af isbindende fly af frostvæskeproteiner ved fluorescens-baserede Ice Plane Affinitet

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Frostvæskeproteiner (AFP'er) binder sig til specifikke isplaner for at forhindre eller bremse isvækst. Fluorescens-baserede isplan affinitet (FIPA) analyse er en ændring af den oprindelige is-ætsning metode til bestemmelse af AFP-bundet is planer. AFP'er er fluorescerende mærket, indarbejdet i makroskopiske enkeltiskrystaller og visualiseret under UV-lys.

Abstract

Frostvæskeproteiner udtrykkes i en række koldhårde organismer for at forhindre eller bremse indre isvækst. AFP'er binder sig til specifikke isplaner gennem deres isbindende overflader. Fluorescensbaseret isplansaffinitetsanalyse (FIPA) er en modificeret teknik, der bruges til at bestemme de isplaner, som AFP'erne binder sig til. FIPA er baseret på den oprindelige is-ætsning metode til bestemmelse af AFP-bundet is-fly. Det giver klarere billeder i en forkortet eksperimentel tid. I FIPA-analyse er AFP'er fluorescerende mærket med et kimært mærke eller et kovalent farvestof, der derefter langsomt indarbejdes i en makroskopisk enkelt iskrystal, som er blevet præformeret til en halvkugle og orienteret til at bestemme a- og c-akserne. Den AFP-bundet is halvkugle er afbildet under UV-lys til at visualisere AFP-bundet fly ved hjælp af filtre til at blokere uspecifikke lys. Fluorescerende mærkning af AFP'er giver mulighed for real-time overvågning af AFP adsorption i is. Etiketterne har vist sig ikke at påvirke de fly, som AFP'er binder sig til. FIPA analyse introducerer også mulighed for at binde mere end én forskelligt mærket AFP på samme enkelt is krystal til at hjælpe differentiere deres bindende fly. Disse anvendelser af FIPA er med til at fremme vores forståelse af, hvordan AFP'er binder sig til is for at standse dens vækst, og hvorfor mange AFP-producerende organismer udtrykker flere AFP-isoformer.

Introduction

Produktionen af frostvæskeproteiner (AFP'er) er en vigtig overlevelsesmekanisme for nogle organismer, der lever i isbelastede miljøer. Indtil for nylig blev det antaget, at den eneste funktion af AFP'er var at forhindre eller bremse væksten af interne iskrystaller, der ville blokere omsætning, forårsage vævsskader og osmotisk stress. Organismer, der ikke kan tolerere nogen grad af frysning, såsom fisk, udtrykker AFP'er for helt at hæmme iskrystalvækst1. Andre, såsom græs, er fryse tolerante og udtrykke AFPs at hæmme is recrystallization som reducerer dannelsen af store iskrystaller i deres væv2. Stabilisering af membraner ved lav temperatur er endnu en funktion, der blev foreslået for AFP'erne3. For nylig blev en ny rolle foreslået for AFP af en antarktisk bakterie, Marinomonas primoryensis, fra isdækkede brakvandssøer4. Denne AFP er en del af en meget større adhesin protein5, der menes at knytte bakterien til is for bedre adgang til ilt og næringsstoffer6. Andre mikrober er kendt for at udskille AFP'er, som kan ændre strukturen af isen, hvor de bor7.

AFP'er er fundet i nogle fisk, insekter, planter, alger, bakterier, diatomer og svampe. De har bemærkelsesværdigt forskellige sekvenser og strukturer i overensstemmelse med deres udvikling fra forskellige forfædre ved forskellige lejligheder; og alligevel binder de sig alle til is og hæmmer dens vækst ved adsorptionshæmmende mekanisme8. AFP'erne har hver især en specifik overflade, der fungerer som det isbindende sted (IBS). Disse er typisk blevet identificeret ved stedsstyret mutagenese af overfladerester9-11. IBS er hypotese at arrangere vandmolekyler i en is-lignende mønster, der matcher specifikke planer af is. Således AFP danner sin ligand før bindende for det5, 12. Isplaner kan defineres af deres Miller-indekser, og forskellige AFP'er kan binde sig til forskellige planer. Således type I AFP fra vinter skrubbe binder sig til 20-21 pyramideformede planer13, type III AFP binder både primære prisme og pyramideformede planer ved hjælp af en sammensat is-bindende overflade11,14, mens gran budworm AFP, en hyperaktiv AFP, binder samtidig til både den primære og basale fly15,16. Andre hyperaktive AFP'er, såsom MpAFP, binder sig til flere isplaner som vist ved deres komplette dækning af enkelt iskrystallerhalvdele5,17. Det er hypotese, at evnen til hyperaktive AFP'er til at binde basalplanet såvel som andre planer kan tegne sig for deres 10 gange højere aktivitet over moderat aktive AFP'er18. Selv om effektiviteten af hyperaktive AFP'er er veldokumenteret, er deres evne til at binde sig til flere isplaner stadig ikke forstået.

Den oprindelige metode til bestemmelse af AFP-bundet is fly blev udviklet af Charles Knight13,19. I denne metode monteres en makroskopisk enkelt iskrystal på en hul metalstang (kold finger) og dannes til en halvkugle ved at nedsænke den i en halvkugleformet kop fyldt med afgasset vand. Derefter nedsænkes halvkuglen i en fortyndet opløsning af AFP'er, og et lag is dyrkes fra AFP-opløsningen på iskrystalhalvlen over flere timer kontrolleret af temperaturen på ethylenglycolen, der cirkulerer gennem den kolde finger. Iskrystallerne fjernes fra opløsningen, løsnes fra den kolde finger og placeres i et fryserum på -10 til -15 °C. Overfladen skrabes med et skarpt blad for at fjerne den frosne overfladefilm af frostvæskeproteinopløsning, og iskrystallerne får lov til at sublimere i mindst 3 timer. Efter sublimering kan isplanerne bundet af AFP'er ses som hvide ætsede mønstre afledt af restprotein. Ishalvkuglen kan orienteres mod sin c-akse og en-akser for at finde de basale og prisme planer af is, og bestemme Miller indekser af ætset patches.

Her beskriver vi en ændring af den oprindelige metode til bestemmelse af AFP-bundne isplaner, en metode, vi kalder fluorescensbaseret isplantilfinitet (FIPA)11. AFP'erne er fluorescerende mærket med enten et kimært mærke, såsom grønt fluorescerende protein (GFP)11,16,17,20, eller med et fluorescerende farvestof, der er kovalent bundet til AFP5,21. De fluorescerende mærkede AFP'er adsorberes til en enkelt iskrystal og tilgroes ved hjælp af den samme eksperimentelle procedure som de oprindelige is-ætsning eksperimenter. Omfanget af AFP binding til den voksende is halvkugle kan overvåges i hele forsøget ved hjælp af en ultraviolet (UV) lampe. Når eksperimentet er afsluttet, kan halvkuglen tages direkte af den kolde finger og afbildes uden sublimering. Men hvis det ønskes, kan halvkuglen overlades til sublimere for at visualisere en traditionel is etch. Ændringer, der indføres i FIPA-metoden, forkorter den traditionelle isætsningsprotokol med flere timer. Derudover er der potentiale for samtidig billeddannelse flere AFPs, hver med en anden fluorescerende etiket, at visualisere overlappende mønstre AF-bundet is planer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voksende enkelt iskrystaller

  1. Tag en ren metalpande (15 cm diameter, 4,5 cm høj), der passer ind i og kan flyde på et ethylenglycolkølebad.
  2. Forbered polyvinylchlorid (PVC) cylindriske forme (4,5 cm diameter, 3-4 cm høj, 4 mm tyk), ved savning sektioner fra et rør.
    1. Skær et hak , (1 mm bredt, 2 mm højt) på den ene side (figur 1A).
    2. Forbered så mange forme, der kan passe komfortabelt ind i gryden (Figur 1B).
      Bemærk: En undersøgelse viste, at polyvinylalkohol (PVA) kan påvirke iskerner22. Men i vores åbne skimmel PVC-system har vi ikke stødt på problemer med atypisk isdannelse.
  3. Påfør en lys film af vakuumfedt på bundoverfladeringen af hver form, som er overfladen med hakket skåret ud. Forsegl denne smurt, hak overflade på en metal gryde med hak orienteret væk fra midten af gryden. Pas på ikke at fylde eller blokere hak med fedt.
  4. Tilsæt 0,22 μm filtreret og afgasset / deioniseret vand til midten af panden, men uden for forme, og lad vandet langsomt komme ind i forme gennem hak. Pas på ikke at introducere bobler. Vandlaget skal være ca. 5 mm dybt.
  5. Gryden anbringes i et temperaturreguleret ethylenglycolbad, der afkøles til -0,5 °C. Panden skal være helt plan. Tilsæt ballastvægte til siderne af panden, hvis det er nødvendigt.
  6. Når gryden og vandet har nået -0,5 °C, tilsæt et lille stykke is til midten af panden uden for formene.
    1. Dette vil nukleate isvækst i supercooled vand på tværs af gryden og ind i forme. Den lille hak i bunden af hver form tillader kun en is krystal til at formere sig igennem, hvilket resulterer i en enkelt is krystal i hver form.
    2. Inkuber natten over for at danne et lag is.
  7. I løbet af de næste tre dage tilsættes 13 ml afgasset/deioniseret vand til hver form en gang om dagen og sænker temperaturen i ethylenglycolbadet efter hver tilsætning til -0,8 °C på dag ét, til -1,1 °C på dag to og til -1,5 °C på dag tre.
    1. Inkuber ved disse temperaturer natten over.
    2. Ved dag fire skal formene være helt fyldt med is.
  8. Træk formene af panden, skub iskrystallerne ud af formene, og opbevar på en ren overflade, såsom en vejebåd, i en -20 °C fryser i ca. 1 time før håndtering.
  9. I stedet for at forberede mange små enkeltiskrystaller, kan en stor enkelt iskrystal flere liter i volumen fremstilles i en konstant temperaturinkubator som beskrevet af Ridder23. Den store iskrystal kan opbevares i et år eller mere, hvis den holdes dækket af en fryser på -15 til -20 °C. Dele af enkelt krystal kan skæres fra isblokken med en sav efter behov.

2. Bestemmelse singularitet og orientering af Ice Crystal

  1. Find ud af, om isen, der udvises fra formen, er en enkelt krystal ved at observere i et fryserum mellem to krydsede polaroider (Figur 1D).
    1. Hvis iskrystallerne er enkelt, skal der ikke ses revner eller diskontinuiteter, og lysretningen bør ikke ændres i iskrystallen.
      Bemærk: Hvis et fryserum ikke er tilgængeligt, kan et kølerum i stedet bruges i alle nødvendige trin, idet det er forsigtigt at arbejde hurtigt og håndtere isen sparsomt.
  2. På grund af isen birefringence, kan man bestemme orienteringen af c-aksen på samme tid. Brug følgende oplysninger til at bestemme retningen:
    1. Når c-aksen er nøjagtigt parallel med hændelseslyset, vil intet lys i teorien passere gennem de krydsede polaroider. Hvis indfaldende lys er titlen lidt fra parallelt med c-aksen, overføres et ensartet flerfarvet spektrum af lys gennem krystallen, når den roteres mellem de krydsede polaroider. Denne ensartede transmission skyldes isens optiske inaktivitet ih langs dens c-akse24. Iskrystallernes basale plan er normalt for c-aksen.
    2. Når c-aksen er længere fra parallelt med det indfaldende lys, og iskrystallen roteres mellem de krydsede polaroider, vil det transmitterede lys skifte mellem 0-100% transmission med hver 90° rotation af krystallen.
    3. Oftest vil c-aksen være normal for det cirkulære plan af den cylindriske iskrystal.
  3. Bestem retningen af a-akserne ved is grubetæring25, som gøres ved indpakning af iskrystaller tæt i aluminiumsfolie, stikke et lille hul med en nål gennem folien ind i isen på basal plan (normal til c-aksen), og placere den under vakuum i 20 min.
    1. Denne behandling vil producere en æts med sekskantet symmetri på det basale plan, hvor a-akserne løber gennem knudepunkterne i den sekssidede stjerne (Figur 2A).
    2. Hvis det ønskes, kan iskrystallen skæres med en sav enten parallelt eller vinkelret på den ene side af sekskanten for at montere den med henholdsvis et primært eller sekundært prismeplan vinkelret på den kolde finger (figur 3).

3. Adsorption af fluorescerende mærket frostvæske proteiner til en enkelt is krystal

  1. Monter en enkelt iskrystal på den kolde finger (Figur 1C) ved først at bore et hulrum ind i toppen af krystallen. For at gøre dette skal du skifte til at smelte isen med to aluminiumsstænger med lidt anden diameter, men svarende til diameteren af den kolde finger, for at danne det hulrum, som den kolde finger kan passe ind i.
  2. Den kolde finger afkøles til -0,5 °C, anbringes i ishulen, og iskrystallerne holdes på plads, indtil den fryser til metallet (Figur 2B). Undgå luftbobler, når du fastgør krystallen til fingeren, da de hindrer effektiv overførsel af varme fra fingeren til stangen.
  3. Fyld en halvkugleformet kop, der er ca. dobbelt så stor som iskrystallernes diameter med filtreret deioniseret vand eller buffer, afkølet til ca. 4 °C. Nedsænk den kolde fingerbundne iskrystal i koppen og fjern overskydende vand eller buffer, således at toppen af iskrystallern er omtrent plan med det flydende lag, og isen rører ikke kopvæggene.
    1. Dæk koppen med isolering og sænk temperaturen til -5 °C.
    2. Vent ca. 1 time, for at iskrystallerne dannes til en halvkugle, og kontroller dens status ca. hvert 20. minut (figur 2C).
    3. Isen vil tage form af den halvkugleformede kop ved at smelte og dyrke iskrystallerne, men den må aldrig vokse for at røre ved koppens vægge. Der skal være mindst 1 cm mellemrum mellem væggen og halvkuglen, og den kolde finger må ikke stikke ud af isen.
  4. Koppen tages ud af iskrystallen, og fluorescerende proteinopløsning til et slutvolumen på 25-30 ml og den ønskede analysekoncentration tilsættes, idet den samlede væskemængde i koppen holdes uændret. En typisk AFP-koncentration er 0,1 mg/ml.
    1. Resubmerge iskrystallerne i koppen, så toppen af iskrystallen er på niveau med væsken, og iskrystallerne ikke rører koppens vægge (Figur 2D).
    2. Smid den kolde fingertemperatur til -8 °C og lad proteinopløsningen fryse ind i iskrystallen i 2-3 timer under omrøring af opløsningen ofte. Isen dannet af proteinopløsningen skal være mindst 5 mm, før isvæksten stoppes.
  5. Fjern iskrystallerne fra koppen, mens du stadig er fastgjort til den kolde finger. Fjern isen fra sidstnævnte ved at opvarme kølevæsken gennem den kolde finger til lige over 0 °C og vent, indtil iskrystallen smelter af.
  6. Placer den krystalbestændede side ned på en ren overflade, f.eks. en vejeskål, pas på ikke at røre ved den nyformede is og opbevares ved -20 °C i mindst 20 minutter inden aflevering.

4. Visualisering af Frostvæske-protein-bundet Planes of Ice

  1. Visualisering af fluorescens sker i en formørket fryser eller kølerum ved at placere iskrystallernes flade side ned under lamper med bølgelængdespecifikke excitationsfiltre for at ophidse fluorescerende etiket- og kameraemissionsfiltre for at blokere ethvert andet uspecifikt lys. Baseret på mønsteret kan isplaner, der er bundet af AFP'er, estimeres (figur 4).
  2. Hvis bølgelængde specifikke lys ikke er tilgængelige en UV-lys boks kan bruges i stedet.
  3. Traditionelle ise ætser kan også udføres blot ved at lade ishalvkuglen sublimere ved -20 °C i mindst 3 timer, hvorefter restproteinpulver kan blive synligt på isoverfladen (figur 5).
  4. Trin 2.3 kan gentages for at bestemme retningen af a-akserne på den færdige ishalvdel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forberedelse og montering af enkeltiskrystallen er de to trin i FIPA-proceduren, hvor der oftest begås fejl. Det afgøres, om den forberedte iskrystal er enkelt, ved at undersøge den gennem krydsede polaroider (figur 1D)som beskrevet i protokolafsnittets trin 2.1. Hvis der anvendes en flerkrystallinsk iskrystalel til FIPA-analysen, vil resultatet være diskontinuerlig binding af AFP'erne på halvkuglen uden et sammenhængende bindende mønster (figur 6B). Hvis iskrystallerne er placeret omkring isflyene, som AFP binder det endelige resultat til, kan det muligvis ikke fortolkes. Derfor skal iskrystallen omhyggeligt kontrolleres for singularitet, før den går videre til de næste trin. For at øge sandsynligheden for at have enkeltiskrystaller til FIPA-analysen bør der foretages flere på samme tid.

En anden almindelig fejl er forkert at justere krystalfladerne med den kolde finger under montering. For at montere de primære eller sekundære prismeflader vinkelret på den kolde finger skal den enkelte iskrystal først orienteres ved isudstening og derefter skæres ud fra retningen af den stjerneformede ætsning (Figur 2A og 3), som skitseret i trin 2.3 i protokolafsnittet. Hvis iskrystallerne er monteret forkert justeret, vil det endelige resultat producere en halvkugle, hvor halvkuglens ækvator ikke flugter med isens symmetri (Figur 6C). Selv om dette er et fortolkeligt resultat, vil det være mindre informativt end en korrekt justeret iskrystal, da halvkuglens største omkreds er ved ækvator (Figur 4).

Figure 1
Figur 1. Udstyr til dyrkning og montering af enkeltiskrystaller. A)PVC-forme. B)Panorer i ethylenglycolbad med PVC-forme. C)Kold finger med ethylenglycolstrøm vist med den hvide pil. Den hvide stiplede linje angiver den kolde finger' indervæg. D) Diagram over krydsede polaroider til orientering af en enkelt iskrystal. Lyskilden er gul, krydsede polaroider er grå og den enkelte is krystal er hvid. Retningen af polaroiderne (grå pile) og iskrystalretningen (røde pile) er angivet. Fra venstre mod højre er iskrystallern orienteret således, at c-aksen er vinkelret på den nederste polaroid, 45° til den nederste polaroid og parallelt med indfaldende lys. Lyset passerer gennem krydsede polaroider og is vil fremstå mørkt, lys, eller svagt flerfarvet gennem toppen polaroid afhængigt af orienteringen af iskrystaller. Klik her for at se større billede.

Figure 2
Figur 2. Forberedelse af iskrystaller til FIPA. A)Bestemmelse af akseretninger ved is etch med sekskantet symmetri. Krystallens basale plan er parallelt med sidens plan. B)Montering af enkeltiskrystallen på den kolde finger. C)Is efter dannelse i halvkugle. D) Ishalvdel nedsænket i halvkugleformet kop fyldt med proteinopløsning. Klik her for at se større billede.

Figure 3
Figur 3. Montering af iskrystal baseret på orientering. A)Diagram over montering af is med i) basalplanet, ii) et primært prismeplan og iii) et sekundært prismeplan vinkelret på den kolde finger. For orienteringer (ii) og iii) skal iskrystallen skæres i halve, som vist i figuren. B)FIPA-resultater af den blåmærkede type III nfeAFP8 i Stillehavet efter montering af iskrystaller med i) basalplanet og ii) et primært prismeplan vinkelret på den kolde finger. Klik her for at se større billede.

Figure 4
Figur 4. Fortolkning af AFP-bundne planer fra FIPA-analyseresultater. A)Repræsentation af de bundne planer fordet fælles stal; og B) det tilsvarende FIPA-analyseresultat, når enkeltiskrystallen er monteret med et primært prismeplan vinkelret på den kolde finger. Paneler repræsenterer (i) basalplan, (ii) primært prismeplan, (iii) sekundært prismeplan, (iv) pyramideplan justeret med a-akserne og (v) pyramideplan forskudt til a-akserne. C) Morfologi af en enkelt is krystal, når de dyrkes i opløsning af AFPs, der binder pyramideformede planer i) tilpasset a-akser og ii) forskudt fra a-akser. Klik her for at se større billede.

Figure 5
Figur 5. Sammenligning af traditionelle is etches versus FIPA. A)(i) Den traditionelle etch af type I AFP (HPLC6 isoform) produceret af vinterflounder (Pseudopleuronectes americanus) er vist som oprindeligt produceret af Knight et al.,(1991). ii) Den tilsvarende FIPA-analyse af det samme protein mærket med TRITC. B)i) Traditionel etch af en firdobbelt IBS-mutant (V9Q/V19L/G20V/I41V) af type III nfeAFP11 (fra den japanske åleudspout Zoarces elongatuskner)21. ii) Den tilsvarende FIPA-analyse af det samme protein mærket med TRITC. Klik her for at se større billede.

Figure 6
Figur 6. halvkugler som følge af almindelige FIPA-analysefejl. Der blev udført analyser af GFP-mærket type III HPLC12-A16H. A)Et optimalt FIPA-resultat til sammenligning. Iskrystallen blev monteret med sit primære prismeplan vinkelret på den kolde finger. B) FIPA-analyse, der uforvarende blev udført ved hjælp af en ishalvdel bestående af mere end én krystal. C) FIPA-analyse, der blev udført på en forkert justeret enkeltiskrystal. Det sekundære prismefly var ikke monteret nøjagtigt vinkelret på den kolde finger. Klik her for at se større billede.

Figure 7
Figur 7. Brug af FIPA-analyse til at sammenligne isbindende mønstre i forskellige AFP'er. Pacific blå-mærket type III nfeAFP8 blev kombineret med TRITC-mærket type I AFP og en enkelt FIPA analyse blev udført. A) Kun visualisering af type III nfeAFP8. B) Visualisering af type I AFP alene. C) Visualisering af type III nfeAFP8 og type I AFP sammen. Klik her for at se større billede.

Figure 8
Figur 8. FIPA af moderat aktive og hyperaktive AFP'er. A)FIPA-analyse af tre forskellige moderat aktive afd'er for fisk; i) TRITC-mærket type I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus), (ii) TRITC-mærket type II AFP(Ca2+uafhængig isoform, Longsnout-krybskytte),(iii) Pacific-blue-labeled type III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B)FIPA-analyse af tre forskellige hyperaktive AFP'er; i) GFP-mærket MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), ii) TRITC-mærket sbwAFP (Choristoneura fumiferana), iii) GFP-mærket TmAFP (Tenebrio molitor). I alle billeder er c-aksenvinkelret på sidens plan. Klik her for at se større billede.

Figure 9
Figur 9. Forholdet mellem fluorescerende mønster, der frembringes ved FIPA-analyse, med iskrystalmorfologi af forskellig type III AFP-isoforme og mutanter11,21. A)(i) FIPA-analyse af GFP-mærket QAE-A16H. ii) Iskrystalmorfologi fremstillet af QAE-A16H. B)i) FIPA-analyse af TRITC-mærket nfeAFP11-V9Q. ii) Iskrystalmorfologi fremstillet af nfeAFP11-V9Q. C)i) FIPA-analyse af TRITC-mærket wild-type nfeAFP11. ii) Is-krystal morfologi fremstillet af vildtype nfeAFP11. D) i) FIPA-analyse af TRITC-mærket wild-type nfeAFP6. ii) Iskrystalmorfologi fremstillet af vildtype nfeAFP6. C-akseretninger og skaleringslinjer er som angivet. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udvikling af is-ætsning metode af Charles Knight til bestemmelse af AFP-bundet is fly meget avancerede undersøgelser af mekanismen for isbinding af AFPs. Mens strukturer af AFP'er kunne løses ved røntgenkrystallografi26,27, var der ingen indlysende metode til at udlede den komplementære overflade på is, som AFP bundet til. Når type I AFP fra vinter skrubbe oprindeligt blev karakteriseret, blev det hypotese at binde sig til de primære prisme fly af is28. Men Knight's banebrydende is-ætsning eksperimenter af type I AFP viste, at de binder sig til pyramideformede planer af is13. Dette resultat stimulerede AFP forskersamfund til at genoverveje mekanismen i AFP is bindende og mere præcist bestemme is-bindende ansigt AFPs9. Knight's oprindelige is-ætsning eksperimenter blev udført ved hjælp af indfødte AFPs renset fra AFP-producerende organismer. Med udviklingen af rekombinante AFP'er og den stigende brug af GFP-tags var der mulighed for at udvide disse undersøgelser til mange andre AFP'er29.

Ideen om at inkorporere kovalent fluorescerende proteinfarvning, såsom tetramethylrhodamin-5-(og 6)-isothiocyanat (TRITC), i analysen kom først efter succesen med de GFP-fusionerede AFP FIPA-analyser11. De kimære fluorescerende proteintags og de kemiske modifikationer ved hjælp af kovalente farvestoffer er blevet observeret for ikke at påvirke afp'ernes isbindende mønstre (figur 5). Med førstnævnte er GFP smeltet sammen til enten N- eller C-terminalenderne af AFP'erne, som ofte er godt fjernet fra IBS. Der kan også indsættes en fleksibel linker mellem GFP og AFP, så mærket kan skubbes væk fra isoverfladen. Med sidstnævnte mærkningsstrategi er de ladede sidekæder, der reagerer med de kovalente farvestoffer, normalt på overflader væk fra IBS. Hvis de strategier, der præsenteres her for fluorescerende mærkning af AFP'er, ikke virker, er indførelsen af en cystein væk fra IBS for reaktion med thiolreaktive farvestoffer en anden mulighed30. Ved at træffe foranstaltninger til at sikre, at fluorescerende etiketter ikke påvirker AFP isbinding, som bedømt af termisk hysterese aktivitet og is krystal morfologi, er vi overbeviste om, at FIPA analyse viser ægte repræsentation af AFP isbindende mønstre, som det gjorde i den oprindelige is-ætsning metode.

Der er flere fordele ved fluorescerende mærkning af AFP'er til FIPA-analysen. Der kræves mindre tid til proceduren, da sublimering af is til visualisering af AFP-bundne fly ikke er nødvendig. Inkorporeringen af mærket protein på halvkuglen kan overvåges under isens vækst for at vurdere eksperimentel færdiggørelse, og AFP-bindingsmønsteret kan registreres på ethvert tidspunkt. Dette forhindrer unødigt lange eksperimenter eller for tidlig afslutning af isvækst. Den fluorescerende mærkning giver mulighed for klarere AFP-bindende mønstervisualisering end tidligere muligt med ætsning, som det ses i sammenligningen af resultaterne fra begge metoder, der anvendes på type I og type III AFP'er (Figur 5). En post-FIPA-isæts kan dog let udføres ved at placere halvkuglen i en fryser i flere timer, hvilket betyder, at begge analyser kan udføres på den samme prøve, da der er behov for lignende AFP-koncentrationer for begge metoder. En værdifuld fordel ved FIPA er evnen til at visualisere mere end én forskelligt mærket AFP på samme ishalvdel (Figur 7). Dette er nyttigt til at illustrere forskelle i AFP isbindende planer set med forskellige AFP typer, isoformer, og aktivitet mutanter.

FIPA-analyse er allerede blevet anvendt i flere AFP-undersøgelser. Det er blevet brugt til at understøtte hypotesen om, at basalplanbinding er unik for hyperaktive AFP'er og nødvendig for deres høje aktivitet18. Moderat aktive AFP'er blev fundet ikke at binde det basale plan (Figur 8A), men mange hyperaktive AFP'er dækker helt ishalvhalvdelene, herunder det basale isplan (Figur 8B)5,20,31. FIPA-analyse er også blevet anvendt til at undersøge funktionen af specifikke isbindende restkoncentrationer. For eksempel blev FIPA-analyse udført på flere type III isoformer og mutanter, hvoraf nogle forhindrer isvækst, og hvoraf nogle har vist sig kun at forme is11,21,32. Af undersøgelserne blev det konstateret, at særlige restkoncentrationer er vigtige for inkorporeringen af AFP'erne i isen, og andre er vigtige i isplanspecifikitet (figur 9).

Andre metoder til undersøgelse af AFP-bindingsmønstre på enkeltiskrystaller omfatter direkte observation ved fluorescensmikroskopi16,33 og mikrofluidics34. Disse metoder har den fordel, at de er følsomme over for dynamikken i AFP's tilknytning til is og overvågning af isformningssimulatori med AFP's affinitet over for isen, men er mindre robuste sammenlignet med FIPA-metoden ved fastsættelsen af affiniteten til isflyene. Molekylær dynamik bruges også til at forudsige isplan bindende specificitet af AFPs12,20,21,30,35. Ved hjælp af FIPA analyse, sammen med de andre tilgængelige teknikker, er vi ved at lære is-plan bindende mønstre af hver AFPs, betydningen af sammensætningen af IBS i udvælgelsen af is planer, og hvordan binding af specifikke fly er relateret til AFP aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

PLD har Canada Research Chair i Protein Engineering. Dette arbejde blev finansieret af et tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research til PLD. Dette arbejde blev også støttet af en Grant-in-Aid til videnskabelig forskning fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr. 23310171) og fra Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Vi er taknemmelige for Drs. Chris Marshall og Mike Kuiper for banebrydende arbejde, der førte til FIPA. Vi er også taknemmelige for Dr. Sakae Tsuda for at give faciliteter til noget af dette arbejde og til Dr. Laurie Graham for at oprette fluorescerende lys excitation og emissionsfiltre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Tags

Kemi Materialer Life Sciences Optik frostvæske proteiner Ice adsorption Fluorescerende mærkning Ice gitter fly isbindende proteiner Enkelt is krystal
Bestemmelse af isbindende fly af frostvæskeproteiner ved fluorescens-baserede Ice Plane Affinitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter