Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Koli Basu; Christopher P. Garnham; Yoshiyuki Nishimiya; Sakae Tsuda; Ido Braslavsky; Peter Davies

doi:10.3791/51185

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Methodenartikel

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

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DOI:

10.3791/51185

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15. Januar 2014

Koli Basu¹ , Christopher P. Garnham² , Yoshiyuki Nishimiya³ , Sakae Tsuda³ , Ido Braslavsky⁴ , Peter Davies¹

¹Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, ²National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, ³Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, ⁴The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Zusammenfassung

Frostschutzproteine (AFPs) werden in einer Vielzahl von kalt-harten Organismen exprimiert, um das interne Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. AFPs binden sich durch ihre Eisbindungsflächen an bestimmte Eisebenen. Die FiPA-Analyse (Fluoreszenzbasierte Eisebene)ist eine modifizierte Technik zur Bestimmung der Eisebenen, an die die AFPs binden. FIPA basiert auf der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. Es erzeugt klarere Bilder in einer verkürzten experimentellen Zeit. In der FIPA-Analyse werden AFPs fluoreszierend mit einem chimären Tag oder einem kovalenten Farbstoff beschriftet und dann langsam in einen makroskopischen Einzeleiskristall eingearbeitet, der zu einer Hemisphäre vorgeformt und zur Bestimmung der A- und C-Achsenausgerichtet ist. Die AFP-gebundene Eishalbkugel wird unter UV-Licht dargestellt, um AFP-gebundene Ebenen mithilfe von Filtern zu visualisieren, um unspezifisches Licht zu blockieren. Die fluoreszierende Kennzeichnung der AFPs ermöglicht die Echtzeitüberwachung der AFP-Adsorption in Eis. Es wurde festgestellt, dass die Beschriftungen die Ebenen, an die AFPs gebunden sind, nicht beeinflussen. Die FIPA-Analyse führt auch die Möglichkeit ein, mehr als einen unterschiedlich markierten AFP auf demselben einzigen Eiskristall zu binden, um ihre Bindungsebenen zu differenzieren. Diese Anwendungen der FIPA tragen dazu bei, unser Verständnis dafür zu fördern, wie AFPs an Eis binden, um ihr Wachstum zu stoppen, und warum viele AFP-produzierende Organismen mehrere AFP-Isoformen ausdrücken.

Einleitung

Die Produktion von Frostschutzproteinen (AFPs) ist ein wichtiger Überlebensmechanismus einiger Organismen, die in eisbeladenen Umgebungen leben. Bis vor kurzem dachte man, dass die einzige Funktion von AFPs darin bestand, das Wachstum von inneren Eiskristallen zu verhindern oder zu verlangsamen, die die Durchblutung blockieren, Gewebeschäden verursachen und osmotischen Stress verursachen würden. Organismen, die kein Einfrieren vertragen, wie Fische, drücken AFPs aus, um das Eiskristallwachstum vollständig zu hemmen¹. Andere, wie Gras, sind frosttolerant und drücken AFPs aus, um die Eisrekristallisation zu hemmen, die die Bildung großer Eiskristalle in ihren....