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Chemistry

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Frostschutzproteine (AFPs) binden an bestimmte Eisebenen, um das Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. Die Fluoreszenzbasierte Eisebene (FIPA)-Analyse ist eine Modifikation der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. AFPs werden fluoreszierend beschriftet, in makroskopische Einzeleiskristalle integriert und unter UV-Licht visualisiert.

Abstract

Frostschutzproteine (AFPs) werden in einer Vielzahl von kalt-harten Organismen exprimiert, um das interne Eiswachstum zu verhindern oder zu verlangsamen. AFPs binden sich durch ihre Eisbindungsflächen an bestimmte Eisebenen. Die FiPA-Analyse (Fluoreszenzbasierte Eisebene)ist eine modifizierte Technik zur Bestimmung der Eisebenen, an die die AFPs binden. FIPA basiert auf der ursprünglichen Eisätzmethode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen. Es erzeugt klarere Bilder in einer verkürzten experimentellen Zeit. In der FIPA-Analyse werden AFPs fluoreszierend mit einem chimären Tag oder einem kovalenten Farbstoff beschriftet und dann langsam in einen makroskopischen Einzeleiskristall eingearbeitet, der zu einer Hemisphäre vorgeformt und zur Bestimmung der A- und C-Achsenausgerichtet ist. Die AFP-gebundene Eishalbkugel wird unter UV-Licht dargestellt, um AFP-gebundene Ebenen mithilfe von Filtern zu visualisieren, um unspezifisches Licht zu blockieren. Die fluoreszierende Kennzeichnung der AFPs ermöglicht die Echtzeitüberwachung der AFP-Adsorption in Eis. Es wurde festgestellt, dass die Beschriftungen die Ebenen, an die AFPs gebunden sind, nicht beeinflussen. Die FIPA-Analyse führt auch die Möglichkeit ein, mehr als einen unterschiedlich markierten AFP auf demselben einzigen Eiskristall zu binden, um ihre Bindungsebenen zu differenzieren. Diese Anwendungen der FIPA tragen dazu bei, unser Verständnis dafür zu fördern, wie AFPs an Eis binden, um ihr Wachstum zu stoppen, und warum viele AFP-produzierende Organismen mehrere AFP-Isoformen ausdrücken.

Introduction

Die Produktion von Frostschutzproteinen (AFPs) ist ein wichtiger Überlebensmechanismus einiger Organismen, die in eisbeladenen Umgebungen leben. Bis vor kurzem dachte man, dass die einzige Funktion von AFPs darin bestand, das Wachstum von inneren Eiskristallen zu verhindern oder zu verlangsamen, die die Durchblutung blockieren, Gewebeschäden verursachen und osmotischen Stress verursachen würden. Organismen, die kein Einfrieren vertragen, wie Fische, drücken AFPs aus, um das Eiskristallwachstum vollständig zu hemmen1. Andere, wie Gras, sind frosttolerant und drücken AFPs aus, um die Eisrekristallisation zu hemmen, die die Bildung großer Eiskristalle in ihren Geweben reduziert2. Die Stabilisierung von Membranen bei niedriger Temperatur ist eine weitere Funktion, die für die AFPs vorgeschlagen wurde3. Kürzlich wurde eine neue Rolle für die AFP eines antarktischen Bakteriums, Marinomonas primoryensis, aus eisbedeckten Brackseenvorgeschlagen 4. Diese AFP ist Teil eines viel größeren Adhesin-Proteins5, von dem angenommen wird, dass es das Bakterium an Eis anheftet, um einen besseren Zugang zu Sauerstoff und Nährstoffen zu erhalten6. Andere Mikroben sind dafür bekannt, AFPs zu sezernieren, was die Struktur des Eises, in dem sie leben, verändern könnte7.

AfPs wurden in einigen Fischen, Insekten, Pflanzen, Algen, Bakterien, Diatomen und Pilzen gefunden. Sie haben bemerkenswert unterschiedliche Sequenzen und Strukturen, die mit ihrer Entwicklung von verschiedenen Vorläufern bei verschiedenen Gelegenheiten übereinstimmen; und doch binden sie alle an Eis und hemmen sein Wachstum durch den Adsorptionsinhibitionsmechanismus8. Die AFPs haben jeweils eine bestimmte Oberfläche, die als eisbindende Stelle (IBS) fungiert. Diese wurden typischerweise durch standortgesteuerte Mutagenese von Oberflächenrückständen9-11identifiziert. Die IBS wird vermutet, um Wassermoleküle in einem eisähnlichen Muster zu arrangieren, das bestimmten Eisebenen entspricht. So bildet die AFP ihren Liganden, bevor sie an sie bindet5, 12. Eisebenen können durch ihre Miller-Indizes definiert werden, und verschiedene AFPs können an verschiedene Ebenen binden. So bindet Typ I AFP von Winterflunder an die 20-21 Pyramidenebenen13, Typ III AFP bindet sowohl primäre Prisma als auch Pyramidenebenen mit einer zusammengesetzten Eisbindungsfläche11,14, während der Fichtenknospenwurm AFP, ein hyperaktiver AFP, gleichzeitig an die Primär- und Basalebene15,16bindet. Andere hyperaktive AFPs, wie MpAFP, binden an mehrere Eisebenen, wie ihre vollständige Abdeckung von einzelnen Eiskristallhemisphärenzeigt 5,17. Es wird vermutet, dass die Fähigkeit von hyperaktiven AFPs, die Basalebene zu binden, sowie andere Ebenen, für ihre 10-fache höhere Aktivität gegenüber mäßig aktiven AFPs18verantwortlich sein kann. Obwohl die Effizienz hyperaktiver AFPs gut dokumentiert ist, ist ihre Fähigkeit, sich an mehrere Eisebenen zu binden, immer noch nicht verstanden.

Die ursprüngliche Methode zur Bestimmung der AFP-gebundenen Eisflugzeuge wurde von Charles Knight13,19entwickelt. Bei dieser Methode wird ein makroskopischer Einzeleiskristall auf einen hohlen Metallstab (Kaltfinger) montiert und zu einer Hemisphäre geformt, indem er in einen halbkugelförmigen Becher mit entgastem Wasser getaucht wird. Dann wird die Hemisphäre in eine verdünnte Lösung von AFPs getaucht und eine Eisschicht wird von der AFP-Lösung auf die Eiskristall-Hemisphäre über mehrere Stunden angebaut, die durch die Temperatur des Ethylenglykols gesteuert wird, das durch den kalten Finger zirkuliert. Der Eiskristall wird aus der Lösung entfernt, vom kalten Finger gelöst und in einen Gefrierraum von -10 bis -15 °C gelegt. Die Oberfläche wird mit einer scharfen Klinge abgekratzt, um den gefrorenen Oberflächenfilm der Frostschutzproteinlösung zu entfernen, und der Eiskristall darf sich für mindestens 3 Stunden sublimieren. Nach der Sublimation können die eisebenen, die von AFPs gebunden sind, als weiß geätzte Muster gesehen werden, die aus Restproteinen abgeleitet sind. Die Eishalbkugel kann an ihrer c-Achseund a-Achsenausgerichtet werden, um die Basal- und Prismenebenen des Eises zu lokalisieren und die Miller-Indizes der geätzten Flecken zu bestimmen.

Hier beschreiben wir eine Modifikation der ursprünglichen Methode zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisebenen, eine Methode, die wir als fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität (FIPA)11bezeichnen. Die AFPs sind fluoreszierend entweder mit einem chimären Etikett, wie grünem fluoreszierendem Protein (GFP)11,16,17,20, oder mit einem fluoreszierenden Farbstoff kovalent an die AFP5,21gebunden. Die fluoreszierend markierten AFPs werden auf einen einzigen Eiskristall adsorbiert und mit dem gleichen experimentellen Verfahren wie die ursprünglichen Eisätzexperimente überwuchert. Das Ausmaß der AFP-Bindung an die wachsende Eishalbkugel kann während des gesamten Experiments mit einer ultravioletten (UV) Lampe überwacht werden. Nach Abschluss des Experiments kann die Hemisphäre direkt vom kalten Finger abgenommen und ohne Sublimation abgebildet werden. Wenn gewünscht, kann die Hemisphäre jedoch sublimiert werden, um einen traditionellen Eisätz zu visualisieren. Änderungen, die an der FIPA-Methodik vorgenommen wurden, verkürzen das traditionelle Eisätzprotokoll um mehrere Stunden. Darüber hinaus besteht das Potenzial, mehrere AFPs mit jeweils einem anderen fluoreszierenden Etikett gleichzeitig zu bebildern, um die überlappenden Muster von AFP-gebundenen Eisebenen zu visualisieren.

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Protocol

1. Wachsende Einzelne Eiskristalle

  1. Nehmen Sie eine saubere Metallwanne (15 cm Durchmesser, 4,5 cm Höhe), die in ein Ethylenglykol-Kühlbad passt und auf einem Schwimmen schwimmt.
  2. Polyvinylchlorid (PVC) zylindrische Formen vorbereiten, (4,5 cm Durchmesser, 3-4 cm hoch, 4 mm dick), durch Sägen von Profilen aus einem Rohr.
    1. Schneiden Sie eine Kerbe, (1 mm breit, 2 mm hoch) auf einer Seite (Abbildung 1A).
    2. Bereiten Sie so viele Formen vor, die bequem in die Pfanne passen (Abbildung 1B).
      Hinweis: Eine Studie zeigte, dass Polyvinylalkohol (PVA) die Eiskerne beeinflussen kann22. In unserem offenen Schimmel-PVC-System sind wir jedoch nicht auf Probleme der atypischen Eisbildung gestoßen.
  3. Tragen Sie einen leichten Film aus Vakuumfett auf den unteren Oberflächenring jeder Form auf, d. h. auf die Oberfläche mit ausgeschnittener Kerbe. Verdichten Sie diese gefettete, eingekerbte Oberfläche auf eine Metallwanne mit den Kerben, die von der Mitte der Pfanne weg ausgerichtet sind. Achten Sie darauf, die Kerben nicht mit Fett zu füllen oder zu verschließen.
  4. Fügen Sie 0,22 m gefiltertes und entgastes/deionisiertes Wasser in die Mitte der Pfanne, aber außerhalb der Formen, und lassen Sie das Wasser langsam in die Formen durch die Kerben eindringen. Achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Die Wasserschicht sollte ca. 5 mm tief sein.
  5. Die Pfanne in ein temperaturgeregeltes Ethylenglykolbad auf -0,5 °C abgekühlt. Die Pfanne sollte perfekt eben sein. Fügen Sie bei Bedarf Ballastgewichte an den Seiten der Pfanne hinzu.
  6. Nachdem die Pfanne und das Wasser -0,5 °C erreicht haben, fügen Sie ein kleines Stück Eis in die Mitte der Pfanne, außerhalb der Formen.
    1. Dadurch wird das Eiswachstum im unterkühlten Wasser über die Pfanne und in die Formen nukleiert. Die kleine Kerbe am Boden jeder Form lässt nur einen Eiskristall durch, was zu einem einzigen Eiskristall in jeder Form führt.
    2. Über Nacht bebrüten, um eine Eisschicht zu bilden.
  7. In den nächsten drei Tagen 13 ml 4 °C entgastes/deionisiertes Wasser einmal täglich in jede Form geben und die Temperatur des Ethylenglykolbades nach jeder Zugabe von -0,8 °C am ersten Tag auf -1,1 °C am zweiten Tag und auf -1,5 °C am dritten Tag senken.
    1. Inkubieren Sie bei diesen Temperaturen über Nacht.
    2. Am vierten Tag sollten die Formen vollständig mit Eis gefüllt sein.
  8. Ziehen Sie die Formen aus der Pfanne, schieben Sie die Eiskristalle aus den Formen und lagern Sie auf einer sauberen Oberfläche, wie z. B. einem Wägeboot, in einem -20 °C Gefrierschrank für ca. 1 Stunde vor dem Handling.
  9. Anstatt viele kleine einzelne Eiskristalle vorzubereiten, kann ein großer Einzele-Eiskristall mit mehreren Litern Volumen in einem konstanten Temperatur-Inkubator hergestellt werden, wie von Knight23beschrieben. Der große Eiskristall kann ein Jahr oder mehr gelagert werden, wenn er in einem Gefrierschrank von -15 bis -20 °C aufbewahrt wird. Teile von Einzelkristall können mit einer Säge nach Bedarf aus dem Eisblock geschnitten werden.

2. Bestimmung der Singularität und Orientierung des Eiskristalls

  1. Stellen Sie fest, ob es sich bei dem aus der Form vertriebenen Eis um einen einzelnen Kristall handelt, indem Sie in einem Gefrierraum zwischen zwei gekreuzten Polaroiden (Abbildung 1D)beobachten.
    1. Wenn der Eiskristall einzeln ist, sollten keine Risse oder Diskontinuitäten gesehen werden, und die Lichtrichtung sollte sich innerhalb des Eiskristalls nicht ändern.
      Hinweis: Wenn kein Gefrierraum zur Verfügung steht, kann stattdessen ein Kühlraum in allen erforderlichen Schritten genutzt werden, wobei man vorsichtig ist, schnell zu arbeiten und das Eis sparsam zu handhaben.
  2. Aufgrund der Eisbirefreringence kann man gleichzeitig die Ausrichtung der c-Achsebestimmen. Verwenden Sie die folgenden Informationen, um die Ausrichtung zu bestimmen:
    1. Wenn die c-Achsegenau parallel zum einfallenden Licht ist, wird theoretisch kein Licht durch die gekreuzten Polaroids passieren. Wenn das einfallende Licht leicht von parallel zur c-Achsebetitelt wird, wird ein gleichmäßiges mehrfarbiges Lichtspektrum durch den Kristall übertragen, wenn es zwischen den gekreuzten Polaroids gedreht wird. Diese gleichmäßige Transmission entsteht durch die optische Inaktivität von Eis Ih entlang seiner c-Achse24. Die Basalebene des Eiskristalls ist normal zur c-Achse.
    2. Wenn die c-Achseweiter vom parallelen zum einfallenden Licht entfernt ist und der Eiskristall zwischen den gekreuzten Polaroids gedreht wird, wechselt das übertragende Licht zwischen 0-100% Transmission mit jeder 90° Drehung des Kristalls.
    3. Am häufigsten ist die c-Achsenormal zur kreisförmigen Ebene des zylindrischen Eiskristalls.
  3. Bestimmen Sie die Ausrichtung der a-Achsendurch Eislochierung25, die geschieht, indem Sie den Eiskristall fest in Aluminiumfolie wickeln, ein kleines Loch mit einer Nadel durch die Folie in das Eis auf der Basalebene (normal zur c-Achse)stecken und ihn 20 min unter Vakuum stellen.
    1. Diese Behandlung erzeugt eine Ätze mit sechseckiger Symmetrie auf der Basalebene, wo die a-Achsendurch die Scheitelpunkte des sechsseitigen Sterns verlaufen (Abbildung 2A).
    2. Auf Wunsch kann der Eiskristall mit einer Säge entweder parallel oder senkrecht zu einer Seite des Sechsecks geschnitten werden, um ihn mit einer primären oder sekundären Prismaebene senkrecht zum kalten Finger zu montieren (Abbildung 3).

3. Adsorption von fluoreszierend gekennzeichneten Frostschutzproteinen an einen einzigen Eiskristall

  1. Montieren Sie einen einzelnen Eiskristall auf den kalten Finger (Abbildung 1C), indem Sie zuerst einen Hohlraum in die Oberseite des Kristalls bohren. Dazu wechseln Sie das Eis abwechselnd mit zwei Aluminiumstäben mit leicht unterschiedlichem Durchmesser, aber ähnlich dem Durchmesser des kalten Fingers, um den Hohlraum zu bilden, in den der kalte Finger passen kann.
  2. Kühlen Sie den kalten Finger auf -0,5 °C, legen Sie ihn in die Eishöhle und halten Sie den Eiskristall an Ort und Stelle, bis er auf das Metall gefriert (Abbildung 2B). Vermeiden Sie Luftblasen, wenn Sie den Kristall am Finger befestigen, da sie eine effiziente Wärmeübertragung vom Finger zum Stab behindern.
  3. Füllen Sie einen halbkugelförmigen Becher, der etwa doppelt so groß ist wie der Durchmesser des Eiskristalls, mit gefiltertem entionisiertem Wasser oder Puffer, gekühlt auf ca. 4 °C. Untertauchen Sie den kalten, fingergebundenen Eiskristall in die Tasse und entfernen Sie überschüssiges Wasser oder Puffer, so dass die Spitze des Eiskristalls ungefähr mit der flüssigkeitsschicht gleich ist und das Eis die Tassenwände nicht berührt.
    1. Bedecken Sie den Becher mit Isolierung und senken Sie die Temperatur auf -5 °C.
    2. Warten Sie etwa 1 Stunde, bis sich der Eiskristall zu einer Hemisphäre formt und überprüft seinen Status etwa alle 20 min (Abbildung 2C).
    3. Das Eis wird die Form des halbkugelförmigen Bechers annehmen, indem es den Eiskristall schmilzt und wächst, aber es sollte nie überwachsen, um die Tassenwände zu berühren. Es sollte mindestens 1 cm Abstand zwischen Wand und Hemisphäre vorhanden sein und der kalte Finger sollte nicht aus dem Eis herausragen.
  4. Entfernen Sie die Tasse aus dem Eiskristall und fügen Sie die fluoreszierende Proteinlösung zu einem Endvolumen von 25-30 ml und der gewünschten Analysekonzentration hinzu, wobei Sie darauf achten, das gesamte Flüssigkeitsvolumen in der Tasse unverändert zu halten. Eine typische AFP-Konzentration beträgt 0,1 mg/ml.
    1. Den Eiskristall wieder in den Becher untertauchen, so dass die Spitze des Eiskristalls mit der Flüssigkeit auf dem Niveau ist und der Eiskristall die Tassenwände nicht berührt (Abbildung 2D).
    2. Lassen Sie die kalte Fingertemperatur auf -8 °C fallen und lassen Sie die Proteinlösung 2-3 Stunden lang in den Eiskristall einfrieren, wodurch die Lösung oft unter Rühren behandelt wird. Das aus der Proteinlösung gebildete Eis sollte mindestens 5 mm betragen, bevor das Eiswachstum gestoppt wird.
  5. Entfernen Sie den Eiskristall aus der Tasse, während Sie noch am kalten Finger befestigt sind. Lösen Sie das Eis von letzterem, indem Sie das Kühlmittel durch den kalten Finger auf knapp über 0 °C erwärmen und warten, bis der Eiskristall abschmilzt.
  6. Legen Sie den Kristall flach auf eine saubere Oberfläche, wie z. B. eine Wägeschale, achten Sie darauf, das neu formierte Eis nicht zu berühren und vor der Übergabe mindestens 20 min bei -20 °C aufzubewahren.

4. Visualisierung von Frostschutzprotein-gebundenen Eisebenen

  1. Die Visualisierung der Fluoreszenz erfolgt in einem abgedunkelten Gefrierschrank oder Kühlraum, indem der Eiskristall flach unter Lampen mit wellenlängenspezifischen Anregungsfiltern platziert wird, um das Fluoreszenzetikett und kameraemissionsfilter zu anregen, um jedes andere unspezifische Licht zu blockieren. Basierend auf dem Muster können die Eisebenen, die durch AFPs gebunden sind, geschätzt werden (Abbildung 4).
  2. Wenn Wellenlängenspezifische Leuchten nicht verfügbar sind, kann stattdessen ein UV-Lichtkasten verwendet werden.
  3. Herkömmliche Eisätze können auch einfach durchgeführt werden, indem die Eishalbkugel bei -20 °C für mindestens 3 Stunden sublimiert werden kann, danach kann Restproteinpulver auf der Eisoberfläche sichtbar werden (Abbildung 5).
  4. Schritt 2.3 kann wiederholt werden, um die Ausrichtung der a-Achsender fertigen Eishalbkugel zu bestimmen.

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Representative Results

Die Vorbereitung und Montage des einzelnen Eiskristalls sind die beiden Schritte des FIPA-Verfahrens, bei denen am häufigsten Fehler gemacht werden. Die Bestimmung, ob der vorbereitete Eiskristall einzeln ist, erfolgt durch Untersuchung durch gekreuzte Polaroide (Abbildung 1D), wie in Schritt 2.1 des Protokollabschnitts beschrieben. Wenn ein multikristalliner Eiskristall für die FIPA-Analyse verwendet wird, wird das Ergebnis eine diskontinuierliche Bindung der AFPs auf der Hemisphäre ohne ein kohärentes Bindungsmuster sein (Abbildung 6B). Befinden sich die Eiskristallschnittstellen um die Eisebenen, an die die AFP bindet, ist das Endergebnis möglicherweise nicht interpretierbar. Aus diesem Grund sollte der Eiskristall sorgfältig auf Singularität überprüft werden, bevor er zu den nächsten Schritten übergeht. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einzelne Eiskristalle für die FIPA-Analyse zu haben, sollten mehrere gleichzeitig gemacht werden.

Ein weiterer häufiger Fehler ist die falsche Ausrichtung der Kristallflächen mit dem kalten Finger während der Montage. Um die primären oder sekundären Prismenflächen senkrecht zum kalten Finger zu montieren, muss der einzelne Eiskristall zunächst durch Eisgruben ausgerichtet und dann auf der Grundlage der Ausrichtung des sternförmigen Ätzes (Abbildungen 2A und 3)geschnitten werden, wie in Schritt 2.3 des Protokollabschnitts beschrieben. Wenn der Eiskristall falsch ausgerichtet montiert ist, erzeugt das Endergebnis eine Hemisphäre, bei der der Äquator der Hemisphäre nicht mit der Symmetrie der Eisebenen übereinstimmt (Abbildung 6C). Obwohl dies ein interpretierbares Ergebnis ist, wird es weniger informativ sein als ein korrekt ausgerichteter Eiskristall, da sich der größte Umfang der Hemisphäre am Äquator befindet (Abbildung 4).

Figure 1
Abbildung 1. Ausrüstung für den Anbau und die Montage von einzelnen Eiskristallen. A) PVC-Formen. B) In Ethylenglykolbad mit PVC-Formen ausschwenken. C) Kalter Finger mit Fluss von Ethylenglykol durch den weißen Pfeil gezeigt. Die weiße gestrichelte Linie zeigt die Innenwand des kalten Fingers an. D) Diagramm der gekreuzten Polaroide zur Orientierung eines einzelnen Eiskristalls. Die Lichtquelle ist gelb, gekreuzte Polaroids sind grau und der einzelne Eiskristall ist weiß. Die Ausrichtung der Polaroids (graue Pfeile) und die Eiskristallausrichtung (rote Pfeile) sind angezeigt. Von links nach rechts ist der Eiskristall so ausgerichtet, dass die c-Achsesenkrecht zum unteren Polaroid, 45° zum unteren Polaroid und parallel zum einfallenden Licht ist. Das Licht, das durch die gekreuzten Polaroids und das Eis geht, erscheint dunkel, hell oder schwach bunt durch das obere Polaroid, abhängig von der Ausrichtung des Eiskristalls. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2. Vorbereitung von Eiskristall für FIPA. A) Bestimmung der Achsenausrichtung durch Eisätz mit sechseckigen Symmetrie. Die Basalebene des Kristalls ist parallel zur Ebene der Seite. B) Montage des einzelnen Eiskristalls auf den kalten Finger. C) Eis nach der Bildung in die Hemisphäre. D) Eishalbkugel in halbkugelförmigen Becher mit Proteinlösung gefüllt getaucht. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3. Montage von Eiskristall basierend auf der Ausrichtung. A) Diagramm des Montageeises mit (i) der Basalebene, (ii) einer primären Prismaebene und (iii) einer sekundären Prismenebene senkrecht zum kalten Finger. Für Die Ausrichtungen ii) und iii) muss der Eiskristall halbiert werden, wie in der Abbildung dargestellt. B) FIPA-Ergebnisse des pazifischen blau markierten Typs III nfeAFP8 nach Montage von Eiskristallen mit (i) der Basalebene und (ii) einer primären Prismaebene senkrecht zum kalten Finger. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4. Interpretieren von AFP-gebundenen Ebenen aus FIPA-Analyseergebnissen. A) Darstellung der gebundenen Ebenen von Ih Eis; und B) ergibt die entsprechende FIPA-Analyse, wenn der einzelne Eiskristall mit einer primär prismen Ebene senkrecht zum kalten Finger montiert ist. Die Panels stellen (i) die Basalebene, (ii) die primäre Prismenebene, (iii) die sekundäre Prismenebene, (iv) die Pyramidenebene dar, die an den a-Achsenausgerichtet ist, und (v) pyramidale Ebene, die an den a-Achsenversetzt ist. C) Morphologie eines einzelnen Eiskristalls, wenn sie in Lösung von AFPs angebaut wird, die Pyramidenebenen i) an den a-Achsenausgerichtet und ii) von den a-Achsenversetzt sind. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5. Vergleich von traditionellen Eisätzen mit FIPA. A) (i) Der traditionelle Ätz vom Typ I AFP (HPLC6 isoform), der durch die Winterflunder (Pseudopleuronectes americanus) hergestellt wird, wird wie ursprünglich von Knight et al.(1991) hergestellt. ii) Die entsprechende FIPA-Analyse desselben mit TRITC gekennzeichneten Proteins. B) (i) Traditionelle Sätzmenge eines vierfachen IBS-Mutanten (V9Q/V19L/G20V/I41V) vom Typ III nfeAFP11 (vom japanischen Aalpout Zoarces elongatuskner)21. ii) Die entsprechende FIPA-Analyse desselben mit TRITC gekennzeichneten Proteins. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6. Hemisphären, die aus häufigen FIPA-Analysefehlern resultieren. Es wurden Analysen mit GFP-tags Typ III HPLC12-A16H durchgeführt. A) Ein optimales FIPA-Ergebnis zum Vergleich. Der Eiskristall wurde mit seiner primären Prismaebene senkrecht zum kalten Finger montiert. B) FIPA-Analyse, die versehentlich mit einer Eishalbkugel durchgeführt wurde, die aus mehr als einem Kristall besteht. C) FIPA-Analyse, die an einem falsch ausgerichteten Einzeleiskristall durchgeführt wurde. Die sekundäre Prismenebene war nicht exakt senkrecht zum kalten Finger montiert. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7. Verwendung der FIPA-Analyse zum Vergleichen von Eisbindungsmustern verschiedener AFPs. Der pazifische blau markierte Typ III nfeAFP8 wurde mit DEM TRITC-markierten Typ I AFP kombiniert und eine einzige FIPA-Analyse durchgeführt. A) Visualisierung nur vom Typ III nfeAFP8. B) Visualisierung nur vom Typ I AFP. C) Visualisierung vom Typ III nfeAFP8 und Typ I AFP zusammen. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8. FIPA von mäßig aktiven und hyperaktiven AFPs. A) FIPA-Analyse von drei verschiedenen mäßig aktiven Fisch-AFPs; (i) TRITC-markierte Art. I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus), (ii) TRITC-labeled type II AFP(Ca2+-independent isoform, Longsnout poacher), (iii) Pacific-blue-labeled type III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B) FIPA-Analyse von drei verschiedenen hyperaktiven AFPs; i) GFP-getaggte MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (ii) TRITC-labeled sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (iii) GFP-tagged TmAFP (Tenebrio molitor). In allen Bildern ist die c-Achsesenkrecht zur Ebenenebene der Seite. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9. Verhältnis des durch FIPA-Analyse erzeugten fluoreszierenden Musters zur Eiskristallmorphologie verschiedener Typ III AFP Isoformen und Mutanten11,21. A) (i) FIPA-Analyse von GFP-markierten QAE-A16H. ii) Eiskristallmorphologie, hergestellt durch QAE-A16H. B) (i) FIPA-Analyse von TRITC-markierten nfeAFP11-V9Q. ii) Eiskristallmorphologie, hergestellt von nfeAFP11-V9Q. C) i) FIPA-Analyse von TRITC-markiertem Wildtyp nfeAFP11. ii) Eiskristallmorphologie, die von Wildtyp nfeAFP11 erzeugt wird. D) i) FIPA-Analyse von TRITC-markiertem Wildtyp nfeAFP6. ii) Eiskristallmorphologie, die von Wildtyp nfeAFP6 erzeugt wird. C-Achsenausrichtungen und Skalenbalken sind wie angegeben. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.

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Discussion

Entwicklung der Eisätzmethode durch Charles Knight zur Bestimmung von AFP-gebundenen Eisflugzeugen hat die Studien über den Mechanismus der Eisbindung durch AFPs weit fortgeschritten. Während Strukturen von AFPs durch Röntgenkristallographie26,27 gelöst werden konnten, gab es keine offensichtliche Methode, um die komplementäre Oberfläche auf Eis abzuleiten, an die sich die AFP gebunden hatte. Als Typ I AFP von Winterflunder zunächst charakterisiert wurde, wurde es angenommen, an die primären Prismaebenen von Eis28zu binden. Knights bahnbrechende Eisätzexperimente vom Typ I AFP zeigten jedoch, dass sie an Pyramidenebenen aus Eis13binden. Dieses Ergebnis regte die AFP-Forschungsgemeinschaft an, den Mechanismus der AFP-Eisbindung zu überdenken und die eisbindende Fläche von AFPs9genauer zu bestimmen. Knights ursprüngliche Eisätzexperimente wurden mit einheimischen AFPs durchgeführt, die von den AFP-produzierenden Organismen gereinigt wurden. Mit der Entwicklung rekombinanter AFPs und der zunehmenden Verwendung von GFP-Tags gab es die Möglichkeit, diese Studien auf viele andere AFPs auszuweiten29.

Die Idee, kovalente fluoreszierende Proteinfarbstoffe wie Tetramethylrhodamin-5-(und 6)-Isothiocyanat (TRITC) in die Analyse einzubeziehen, kam erst nach dem Erfolg der GFP-fused AFP FIPA-Analysen11. Die chimären fluoreszierenden Protein-Tags und die chemischen Modifikationen durch kovalente Farbstoffe wurden beobachtet, um die eisbindenden Muster der AFPs nicht zu beeinflussen (Abbildung 5). Bei ersterem wird GFP entweder mit den N- oder C-Terminalenden der AFPs verschmolzen, die oft gut aus dem IBS entfernt sind. Außerdem kann ein flexibler Linker zwischen GFP und AFP eingefügt werden, so dass das Tag von der Eisfläche weggedrückt werden kann. Bei der letztgenannten Etikettierungsstrategie befinden sich die geladenen Seitenketten, die mit den kovalenten Farbstoffen reagieren, in der Regel auf Oberflächen, die vom IBS entfernt sind. Wenn die hier vorgestellten Strategien zur fluoreszierenden Kennzeichnung von AFPs nicht funktionieren, ist die Einführung eines Cysteins weg vom IBS zur Reaktion mit Thiol-reaktiven Farbstoffen eine weitere Option30. Indem wir Maßnahmen ergreifen, um sicherzustellen, dass die fluoreszierenden Etiketten die AFP-Eisbindung nicht beeinflussen, wie sie anhand der thermischen Hystereseaktivität und der Eiskristallmorphologie beurteilt wird, sind wir zuversichtlich, dass die FIPA-Analyse eine wahre Darstellung von AFP-Eisbindungsmustern zeigt, wie es bei der ursprünglichen Eisätzmethode der Fall war.

Die fluoreszierende Kennzeichnung der AFPs für die FIPA-Analyse bietet mehrere Vorteile. Für das Verfahren ist weniger Zeit erforderlich, da die Sublimation von Eis für die Visualisierung von AFP-gebundenen Flugzeugen nicht erforderlich ist. Die Aufnahme von markiertem Protein in die Hemisphäre kann während des Eiswachstums überwacht werden, um die experimentelle Fertigstellung zu bewerten, und das AFP-bindende Muster kann jederzeit aufgezeichnet werden. Dies verhindert unnötig lange Experimente oder den vorzeitigen Abschluss des Eiswachstums. Die fluoreszierende Beschriftung ermöglicht eine klarere AFP-Bindungsmustervisualisierung als bisher bei der Ätzung möglich, wie der Vergleich der Ergebnisse beider Methoden, die auf Typ I und Typ III AFPs angewendet werden, deutlich wird (Abbildung 5). Eine Post-FIPA-Eisätze kann jedoch leicht durchgeführt werden, indem die Hemisphäre für mehrere Stunden in einem Gefrierschrank platziert wird, was bedeutet, dass beide Analysen an derselben Probe durchgeführt werden können, da ähnliche AFP-Konzentrationen für beide Methoden erforderlich sind. Ein wertvoller Vorteil von FIPA ist die Möglichkeit, mehr als einen unterschiedlich gekennzeichneten AFP auf derselben Eishalbkugel zu visualisieren (Abbildung 7). Dies ist nützlich, um Unterschiede in AFP-Eisbindungsebenen zu veranschaulichen, die mit verschiedenen AFP-Typen, Isoformen und Aktivitätsmutanten beobachtet werden.

Die FIPA-Analyse wurde bereits in mehreren AFP-Studien verwendet. Es wurde verwendet, um die Hypothese zu stützen, dass Basalebenenbindung ist einzigartig für hyperaktive AFPs und notwendig für ihre hohe Aktivität18. Mäßig aktive AFPs wurden gefunden, um die Basalebene nicht zu binden (Abbildung 8A), aber viele hyperaktive AFPs decken die Eishalbkugel vollständig ab, einschließlich der Basalebene des Eises (Abbildung 8B) 5,20,31. Die FIPA-Analyse wurde auch verwendet, um die Funktion spezifischer Eisbindungsrückstände zu untersuchen. Zum Beispiel wurde die FIPA-Analyse an mehreren Typ-III-Isoformen und Mutanten durchgeführt, von denen einige das Eiswachstum verhindern und von denen einige nur Eisformen 11,21,32. Aus den Studien wurde festgestellt, dass bestimmte Rückstände bei der Einbeziehung der AFPs in Eis wichtig sind und andere für die Spezifität der Eisebene wichtig sind (Abbildung 9).

Andere Methoden zur Untersuchung von AFP-bindenden Mustern auf einzelnen Eiskristallen sind die direkte Beobachtung durch Fluoreszenzmikroskopie16,33 und Mikrofluidik34. Diese Methoden haben den Vorteil der Empfindlichkeit gegenüber der Dynamik der Befestigung der AFP an Eis und Überwachung der Gleichzeitigkeit der Eisformung mit der Affinität der AFP zum Eis, sind aber im Vergleich zur FIPA-Methode bei der Bestimmung der Affinität zu den Eisebenen weniger robust. Die molekulare Dynamik wird auch verwendet, um die Bindungsspezifität von AFPs auf Eisebene vorherzusagen12,20,21,30,35. Anhand der FIPA-Analyse lernen wir zusammen mit den anderen verfügbaren Techniken die Bindungsmuster der einzelnen AFPs, die Bedeutung der Zusammensetzung der IBS bei der Auswahl von Eisebenen und wie die Bindung bestimmter Ebenen mit der AFP-Aktivität zusammenhängt.

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Disclosures

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Acknowledgments

PLD hat den Canada Research Chair in Protein Engineering inne. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Canadian Institutes of Health Research an die PLD finanziert. Diese Arbeit wurde auch durch ein Grant-in-Aid für wissenschaftliche Forschung von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Nr. 23310171) und von der Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN) unterstützt. Wir danken Drs. Chris Marshall und Mike Kuiper für die Pionierarbeit, die zur FIPA geführt hat. Wir sind auch Dr. Sakae Tsuda für die Bereitstellung von Einrichtungen für einige dieser Arbeiten und Dr. Laurie Graham für den Aufbau der Fluoreszenzlicht-Erregungs- und Emissionsfilter dankbar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

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References

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Chemie Ausgabe 83 Materialien Biowissenschaften Optik Frostschutzproteine Eisadsorption Fluoreszierende Etikettierung Eisgitterebenen Eisbindende Proteine Eineiskristall
Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität
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Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

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