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Chemistry

La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Las proteínas anticongelante (AFP) se unen a planos específicos de hielo para prevenir o retardar el crecimiento del hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una modificación del método original de grabado en hielo para la determinación de planos de hielo unidos a AFP. Las AFP están etiquetadas fluorescentemente, incorporadas en cristales de hielo macroscópicos individuales y visualizadas bajo luz UV.

Abstract

Las proteínas anticongelante (AFP) se expresan en una variedad de organismos resistentes al frío para prevenir o retardar el crecimiento interno del hielo. Las AFP se unen a planos específicos de hielo a través de sus superficies de unión al hielo. El análisis de afinidad de plano de hielo basado en fluorescencia (FIPA) es una técnica modificada utilizada para determinar los planos de hielo a los que se unen las AFP. FIPA se basa en el método original de grabado en hielo para determinar los planos de hielo unidos a AFP. Produce imágenes más claras en un tiempo experimental acortado. En el análisis FIPA, las AFP se etiquetan fluorescentemente con una etiqueta quimérica o un tinte covalente y luego se incorporan lentamente en un solo cristal de hielo macroscópico, que ha sido preformado en un hemisferio y orientado para determinar los ejes a y c. El hemisferio de hielo unido a AFP se toma imágenes bajo luz UV para visualizar planos unidos a AFP utilizando filtros para bloquear la luz inespecífica. El etiquetado fluorescente de las AFP permite el monitoreo en tiempo real de la adsorción de AFP en el hielo. Se ha encontrado que las etiquetas no influyen en los planos a los que se unen las AFP. El análisis FIPA también introduce la opción de unir más de un AFP etiquetado de manera diferente en el mismo cristal de hielo para ayudar a diferenciar sus planos de unión. Estas aplicaciones de FIPA están ayudando a avanzar en nuestra comprensión de cómo las AFP se unen al hielo para detener su crecimiento y por qué muchos organismos productores de AFP expresan múltiples isoformas de AFP.

Introduction

La producción de proteínas anticongelante (AFP) es un importante mecanismo de supervivencia de algunos organismos que viven en ambientes cargados de hielo. Hasta hace poco, se pensaba que la única función de las AFP era prevenir o retardar el crecimiento de cristales de hielo internos que bloquearían la circulación, causarían daño tisular y estrés osmótico. Los organismos que no pueden tolerar ningún grado de congelación, como los peces, expresan AFP para inhibir completamente el crecimiento de cristales de hielo1. Otros, como la hierba, son tolerantes a la congelación y expresan AFP para inhibir la recristalización del hielo que reduce la formación de grandes cristales de hielo en sus tejidos2. La estabilización de membranas a baja temperatura es otra función que se sugirió para las AFP3. Recientemente, se sugirió un nuevo papel para la AFP de una bacteria antártica, Marinomonas primoryensis, de lagos salobres cubiertos de hielo4. Esta AFP es parte de una proteína adhesina5 mucho más grande que se cree que une la bacteria al hielo para un mejor acceso al oxígeno y los nutrientes6. Se sabe que otros microbios secretan AFP, lo que podría alterar la estructura del hielo en el que viven7.

Las AFP se han encontrado en algunos peces, insectos, plantas, algas, bacterias, diatomeas y hongos. Tienen secuencias y estructuras notablemente divergentes consistentes con su evolución de diferentes progenitores en varias ocasiones; y, sin embargo, todos ellos se unen al hielo e inhiben su crecimiento por el mecanismo adsorción-inhibición8. Cada una de las AFP tiene una superficie específica que actúa como su sitio de unión al hielo (SII). Estos han sido típicamente identificados por mutagénesis dirigida por el sitio de residuos superficiales9-11. El IBS se presume para organizar las moléculas de agua en un patrón hielo-como que coincida con planos específicos del hielo. Así el AFP forma su ligand antes de atando a él5, 12. Los planos de hielo se pueden definir por sus índices de Miller, y diferentes AFP pueden unirse a diferentes planos. Así, la AFP tipo I de la platija invernal se une a los planos piramidales20-21 13,la AFP tipo III se une tanto al prisma primario como a los planos piramidales utilizando una superficie compuesta de unión al hielo11,14,mientras que el gusano de abeto AFP, un AFP hiperactivo, se une simultáneamente tanto al plano primario como al basal15,16. Otras AFP hiperactivas, como las AFP mp,se unen a múltiples planos de hielo como lo demuestra su cobertura completa de hemisferios de cristal de hielo individuales5,17. Se presume, que la capacidad de las AFP hiperactivas para unirse al plano basal, así como a otros planos, puede explicar su actividad 10 veces mayor sobre las AFP moderadamente activas18. Aunque la eficiencia de las AFP hiperactivas está bien documentada, su capacidad para unirse a múltiples planos de hielo todavía no se entiende.

El método original para determinar los aviones de hielo ligados a las AFP fue desarrollado por Charles Knight13,19. En este método, un solo cristal de hielo macroscópico se monta sobre una varilla metálica hueca (dedo frío) y se forma en un hemisferio sumergiéndolo en una copa hemisférica llena de agua desgastada. Luego, el hemisferio se sumerge en una solución diluida de AFP y se cultiva una capa de hielo de la solución de AFP en el hemisferio de cristal de hielo durante varias horas controladas por la temperatura del etilenglicol que circula a través del dedo frío. El cristal de hielo se retira de la solución, se desprende del dedo frío y se coloca en una sala de congelador de -10 a -15 °C. La superficie se raspa con una hoja afilada para eliminar la película superficial congelada de la solución de proteína anticongelante y se permite que el cristal de hielo sublite durante al menos 3 horas. Después de la sublimación, los planos de hielo unidos por AFP se pueden ver como patrones grabados en blanco derivados de la proteína residual. El hemisferio de hielo se puede orientar a sus ejes c ya, para localizar los planos basal y prisma del hielo, y determinar los índices de Miller de los parches grabados.

Aquí describimos una modificación del método original para determinar planos de hielo unidos a AFP, un método al que nos referimos como afinidad de plano de hielo basada en fluorescencia (FIPA)11. Las AFP se etiquetan fluorescentemente con una etiqueta quimérica, como la proteína fluorescente verde (GFP)11,16,17,20,o con un tinte fluorescente unido covalentemente a la AFP5,21. Las AFP etiquetadas fluorescentemente se adsorben en un solo cristal de hielo y se sobrecrean utilizando el mismo procedimiento experimental que los experimentos originales de grabado en hielo. La extensión de la unión de AFP al hemisferio de hielo en crecimiento se puede monitorear a lo largo del experimento utilizando una lámpara ultravioleta (UV). Una vez completado el experimento, el hemisferio puede ser sacado directamente del dedo frío y foto foto, sin sublimación. Sin embargo, si se desea, el hemisferio se puede dejar sublimar para visualizar un grabado de hielo tradicional. Las modificaciones introducidas en la metodología FIPA acortan el protocolo tradicional de grabado en hielo en varias horas. Además, existe la posibilidad de obtener imágenes simultáneas de varias AFP, cada una con una etiqueta fluorescente diferente, para visualizar los patrones superpuestos de los planos de hielo unidos a AFP.

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Protocol

1. Crecimiento de cristales de hielo individuales

  1. Tome una sartén de metal limpia (15 cm de diámetro, 4,5 cm de alto) que se ajuste a, y pueda flotar en, un baño de enfriamiento de etilenglicol.
  2. Preparar moldes cilíndricos de cloruro de polivinilo (PVC), (4,5 cm de diámetro, 3-4 cm de alto, 4 mm de espesor), aserrado de secciones de una tubería.
    1. Corte una muesca, (1 mm de ancho, 2 mm de alto) en un lado (Figura 1A).
    2. Preparar tantos moldes que puedan caber cómodamente en la sartén (Figura 1B).
      Nota: Un estudio mostró que el alcohol polivinílico (ACV) puede afectar la nucleación del hielo22. Sin embargo, en nuestro sistema de PVC de molde abierto no hemos encontrado problemas de formación de hielo atípico.
  3. Aplique una película ligera de grasa de vacío al anillo de superficie inferior de cada molde, que es la superficie con la muesca cortada. Selle esta superficie engrasada con muescas en una sartén de metal con las muescas orientadas lejos del centro de la sartén. Tenga cuidado de no llenar u obstruir las muescas con grasa.
  4. Agregue 0.22 μm de agua filtrada y desgastada / desionizada al centro de la sartén, pero fuera de los moldes, y deje que el agua entre lentamente en los moldes a través de las muescas. Tenga cuidado de no introducir ninguna burbuja. La capa de agua debe tener aproximadamente 5 mm de profundidad.
  5. Coloque la sartén en un baño de etilenglicol con temperatura controlada enfriado a -0,5 °C. La sartén debe estar perfectamente nivelado. Agregue pesos de lastre a los lados de la sartén si es necesario.
  6. Después de que la sartén y el agua hayan alcanzado -0.5 °C, agregue un pequeño pedazo de hielo al centro de la sartén, fuera de los moldes.
    1. Esto nucleará el crecimiento del hielo en el agua sobreenfriada a través de la sartén y en los moldes. La pequeña muesca en la parte inferior de cada molde permite que solo un cristal de hielo se propague a través, lo que resulta en un solo cristal de hielo en cada molde.
    2. Incubar durante la noche para formar una capa de hielo.
  7. Durante los próximos tres días agregue 13 ml de agua desgastada/desionizada a 4 °C a cada molde una vez al día y baje la temperatura del baño de etilenglicol después de cada adición a -0.8 °C el primer día, a -1.1 °C el segundo día y a -1.5 °C el tercer día.
    1. Incubar a esas temperaturas durante la noche.
    2. Para el cuarto día, los moldes deben estar completamente llenos de hielo.
  8. Tire de los moldes de la sartén, empuje los cristales de hielo fuera de los moldes y guárdelos en una superficie limpia, como un bote de pesaje, en un congelador de -20 °C durante aproximadamente 1 hora antes de manipularlos.
  9. En lugar de preparar muchos cristales de hielo individuales pequeños, un gran cristal de hielo de varios litros de volumen se puede preparar en una incubadora de temperatura constante como se describe en Knight23. El cristal de hielo grande se puede almacenar durante un año o más si se mantiene cubierto en un congelador de -15 a -20 °C. Las porciones de un solo cristal se pueden cortar del bloque de hielo con una sierra según sea necesario.

2. Determinación de la singularidad y orientación del cristal de hielo

  1. Determinar si el hielo expulsado del molde es un solo cristal mediante la observación en una sala de congelador, entre dos polaroids cruzadas (Figura 1D).
    1. Si el cristal de hielo es único, entonces no se deben ver grietas o discontinuidades, y la dirección de la luz no debe cambiar dentro del cristal de hielo.
      Nota: Si una habitación con congelador no está disponible, se puede usar una cámara frigorífica en todos los pasos requeridos, teniendo cuidado de trabajar rápidamente y manejar el hielo con moderación.
  2. Debido a la birrefringencia del hielo, se puede determinar la orientación del eje cal mismo tiempo. Utilice la siguiente información para determinar la orientación:
    1. Cuando el eje ces exactamente paralelo a la luz incidente, en teoría, ninguna luz pasará a través de las polaroids cruzadas. Si la luz incidente se titula ligeramente desde paralelo con el eje c,se transmite un espectro de luz multicolor uniforme a través del cristal cuando se gira entre las polaroids cruzadas. Esta transmitancia uniforme surge de la inactividad óptica del hielo Ih a lo largo desu eje c24. El plano basal del cristal de hielo es normal al eje c.
    2. Cuando el eje cestá más lejos del paralelo a la luz incidente y el cristal de hielo se gira entre las polaroids cruzadas, la luz transmitida alternará entre 0-100% de transmitancia con cada 90° de rotación del cristal.
    3. Más comúnmente, el eje cserá normal al plano circular del cristal de hielo cilíndrico.
  3. Determinar la orientación de losa -ejes por hielo depicaduras 25 que se hace mediante el envoltorio del cristal de hielo firmemente en papel de aluminio, empujando un pequeño agujero con una aguja a través de la lámina en el hielo en el plano basal (normal al eje c),y colocándolo bajo vacío durante 20 min.
    1. Este tratamiento producirá un grabado con simetría hexagonal en el plano basal, donde losejes a recorren los vértices de la estrella de seis lados (Figura 2A).
    2. Si se desea, el cristal de hielo se puede cortar con una sierra paralela o perpendicular a un lado del hexágono para montarlo con un plano de prisma primario o secundario perpendicular al dedo frío, respectivamente (Figura 3).

3. Adsorción De Proteínas Anticongelante Etiquetadas Fluorescentemente a un Solo Cristal de Hielo

  1. Monte un solo cristal de hielo en el dedo frío (Figura 1C) agujereando primero una cavidad en la parte superior del cristal. Para ello, alternar el derretimiento del hielo con dos varillas de aluminio de diámetro ligeramente diferente, pero similar al diámetro del dedo frío, para formar la cavidad en la que puede caber el dedo frío.
  2. Enfriar el dedo frío a -0,5 °C, colocar en la cavidad de hielo, y mantener el cristal de hielo en su lugar hasta que se congele al metal (Figura 2B). Evite las burbujas de aire al unir el cristal al dedo, ya que dificultan la transferencia eficiente de calor del dedo a la varilla.
  3. Llene una taza hemisférica que tenga aproximadamente el doble del diámetro del cristal de hielo con agua desionizada filtrada o tampón, enfriada a aproximadamente 4 °C. Sumerja el cristal de hielo frío unido a los dedos en la taza y elimine el exceso de agua o el amortiguador de tal manera que la parte superior del cristal de hielo esté aproximadamente nivelada con la capa líquida y el hielo no toque las paredes de la copa.
    1. Cubra la taza con aislamiento y baje la temperatura a -5 °C.
    2. Espere aproximadamente 1 hora para que el cristal de hielo se forme en un hemisferio, comprobando su estado aproximadamente cada 20 min (Figura 2C).
    3. El hielo tomará la forma de la copa hemisférica derritiendo y haciendo crecer el cristal de hielo, pero nunca debe crecer demasiado para tocar las paredes de la copa. Debe haber al menos un espacio de 1 cm entre la pared y el hemisferio y el dedo frío no debe sobresalir del hielo.
  4. Retire la taza del cristal de hielo y agregue la solución de proteína fluorescente a un volumen final de 25-30 ml y la concentración de análisis deseada, teniendo cuidado de mantener el volumen líquido total en la taza sin cambios. Una concentración típica de AFP es de 0,1 mg/ml.
    1. Vuelva a sumergir el cristal de hielo en la taza para que la parte superior del cristal de hielo esté a nivel del líquido y el cristal de hielo no esté tocando las paredes de la copa (Figura 2D).
    2. Deje caer la temperatura fría del dedo a -8 °C y deje que la solución de proteína se congele en el cristal de hielo durante 2-3 horas, agitando la solución a menudo. El hielo formado a partir de la solución proteica debe ser de al menos 5 mm antes de detener el crecimiento del hielo.
  5. Retire el cristal de hielo de la taza mientras todavía está unido al dedo frío. Desprenda el hielo de este último calentando el refrigerante a través del dedo frío hasta justo por encima de 0 °C y espere hasta que el cristal de hielo se derrita.
  6. Coloque el lado plano de cristal sobre una superficie limpia, como un plato de pesaje, teniendo cuidado de no tocar el hielo recién conformado y guárdelo a -20 °C durante al menos 20 minutos antes de entregarlo.

4. Visualización de planos de hielo anticongelante-proteína-unidos

  1. La visualización de la fluorescencia se realiza en un congelador o cámara frigorífica oscurecida, colocando el lado plano del cristal de hielo debajo de las lámparas con filtros de excitación específicos de longitud de onda para excitar la etiqueta fluorescente y los filtros de emisión de la cámara para bloquear cualquier otra luz inespecífica. Con base en el patrón, se pueden estimar los planos de hielo que están unidos por las AFP (Figura 4).
  2. Si las luces específicas de longitud de onda no están disponibles, se puede usar una caja de luz UV en su lugar.
  3. Los grabados de hielo tradicionales también se pueden realizar simplemente permitiendo que el hemisferio de hielo se sublime a -20 °C durante al menos 3 horas, después de lo cual la proteína residual en polvo puede hacerse visible en la superficie del hielo (Figura 5).
  4. El paso 2.3 se puede repetir para determinar la orientación de losejes a del hemisferio de hielo completado.

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Representative Results

La preparación y el montaje del único cristal de hielo son los dos pasos del procedimiento FIPA donde los errores se comen con mayor frecuencia. La determinación de si el cristal de hielo preparado es único se realiza examinándolo a través de polaroids cruzadas (Figura 1D),como se describe en el paso 2.1 de la sección de protocolo. Si se utiliza un cristal de hielo multicristalino para el análisis FIPA, el resultado será la unión discontinua de las AFP en el hemisferio sin un patrón de unión coherente (Figura 6B). Si las interfaces de cristal de hielo se encuentran alrededor de los planos de hielo a los que se une la AFP, el resultado final puede no ser interpretable. Por esta razón, el cristal de hielo debe ser cuidadosamente revisado para la singularidad antes de pasar a los siguientes pasos. Para aumentar la probabilidad de tener cristales de hielo individuales para el análisis FIPA se deben hacer varios al mismo tiempo.

Otro error común es alinear incorrectamente las caras de cristal con el dedo frío durante el montaje. Para montar las caras del prisma primario o secundario perpendiculares al dedo frío, el cristal de hielo simple debe orientarse primero mediante picaduras de hielo, y luego cortarse en función de la orientación del grabado en forma de estrella (Figuras 2A y 3),como se describe en el paso 2.3 de la sección de protocolo. Si el cristal de hielo se monta desalineado el resultado final producirá un hemisferio donde el ecuador del hemisferio no se alinea con la simetría de los planos de hielo (Figura 6C). Aunque este es un resultado interpretable, será menos informativo que un cristal de hielo correctamente alineado ya que la circunferencia más grande del hemisferio está en el ecuador (Figura 4).

Figure 1
Figura 1. Equipos para el cultivo y montaje de cristales de hielo individuales. A)Moldes de PVC. B)Sartén en baño de etilenglicol con moldes de PVC. C)Dedo frío con flujo de etilenglicol mostrado por la flecha blanca. La línea discontinua blanca indica la pared interna del dedo frío. D) Diagrama de polaroids cruzadas para orientar un solo cristal de hielo. La fuente de luz es amarilla, las polaroids cruzadas son grises y el único cristal de hielo es blanco. Se indica la orientación de las polaroids (flechas grises) y la orientación del cristal de hielo (flechas rojas). De izquierda a derecha el cristal de hielo está orientado de tal manera que el eje ces perpendicular a la polaroid inferior, 45° a la polaroid inferior, y paralelo a la luz incidente. La luz que pasa a través de las polaroids cruzadas y el hielo aparecerá oscura, clara o ligeramente multicolora a través de la polaroid superior dependiendo de la orientación del cristal de hielo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 2
Figura 2. Preparación de cristal de hielo para FIPA. A)Determinación de las orientaciones de los ejes mediante grabado en hielo con simetría hexagonal. El plano basal del cristal es paralelo al plano de la página. B)Montaje del cristal de hielo único sobre el dedo frío. C) Hielo después de formarse en el hemisferio. D)Hemisferio de hielo sumergido en una taza hemisférica llena de solución proteica. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 3
Figura 3. Montaje de cristal de hielo basado en la orientación. A)Diagrama de hielo de montaje con (i) el plano basal, (ii) un plano prisma primario, y (iii) un plano prisma secundario perpendicular al dedo frío. Para las orientaciones (ii) y (iii) el cristal de hielo debe cortarse por la mitad, como se muestra en la figura. B)Resultados fipa de pacific blue-labeled tipo III nfeAFP8 después de montar cristales de hielo con (i) el plano basal y (ii) un plano prisma primario perpendicular al dedo frío. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 4
Figura 4. Interpretación de los planos enlazados a AFP a partir de los resultados del análisis FIPA. A) Representación de los planos enlazados de hielo Ih; y B)el resultado correspondiente del análisis FIPA cuando el único cristal de hielo se monta con un plano prisma primario perpendicular al dedo frío. Los paneles representan (i) plano basal, (ii) plano de prisma primario, (iii) plano de prisma secundario, (iv) plano piramidal alineado con los-ejes a, y (v) plano piramidal desplazado a los-ejes a. C)Morfología de un solo cristal de hielo cuando se cultiva en solución de AFP que se unen a planos piramidales i) alineados con los-ejes a y ii) desplazados de losejes a. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 5
Figura 5. Comparación de grabados de hielo tradicionales versus FIPA. A)(i) El grabado tradicional de tipo I AFP (ISOFORMA HPLC6) producido por la platija de invierno (Pseudopleuronectes americanus) se muestra como originalmente producido por Knight et al., (1991). ii) El correspondiente análisis FIPA de la misma proteína etiquetada con TRITC. B) (i) Grabado tradicional de un mutante IBS cuádruple (V9Q/V19L/G20V/I41V) de tipo III nfeAFP11 (del zoarda de anguila japonesa Zoarces elongatuskner)21. ii) El correspondiente análisis FIPA de la misma proteína etiquetada con TRITC. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 6
Figura 6. Hemisferios resultantes de errores comunes de análisis FIPA. Los análisis se llevaron a cabo en GFP-etiquetado tipo III HPLC12-A16H. A)Un resultado FIPA óptimo para la comparación. El cristal de hielo fue montado con su plano primario del prisma perpendicular al dedo frío. B)Análisis FIPA que se realizó inadvertidamente utilizando un hemisferio de hielo compuesto por más de un cristal. C)Análisis FIPA que se llevó a cabo en un solo cristal de hielo desalineado. El plano de prisma secundario no se montó exactamente perpendicular al dedo frío. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 7
Figura 7. Uso del análisis FIPA para comparar patrones de unión al hielo de diferentes AFP. El tipo iii nfeAFP8 marcado con la etiqueta azul del Pacífico se combinó con el tipo I AFP etiquetado con TRITC y se realizó un solo análisis FIPA. A)Visualización de tipo III nfeAFP8 solamente. B) Visualización de AFP tipo I solamente. C)Visualización de nfeAFP8 tipo III y AFP tipo I juntos. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 8
Figura 8. FIPA de AFP moderadamente activas e hiperactivas. A)Análisis FIPA de tres AFP de peces moderadamente activas diferentes; (i) AFP tipo I etiquetado por TRITC (isoforma HPLC6, Pseudopleuronectes americanus), (ii) AFP tipo II etiquetado por TRITC (isoforma independiente de Ca2+,cazador furtivo de longsnout), (iii) AFP tipo III etiquetado con azul del Pacífico (isoforma nfeAFP8, Zoarces elongatuskner). B)Análisis FIPA de tres AFP hiperactivas diferentes; (i) MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (ii) SBwAFP etiquetado con TRITC (Choristoneura fumiferana), (iii) TmAFP etiquetado con GFP (Tenebrio molitor). En todas las imágenes, el eje c-es perpendicular al plano de la página. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figure 9
Figura 9. Relación del patrón fluorescente producido por el análisis FIPA con la morfología de cristales de hielo de diferentes isoformas y mutantes AFP tipo III11,21. A)(i) Análisis FIPA de QAE-A16H marcado con GFP. ii) Morfología de cristales de hielo producida por QAE-A16H. B)(i) Análisis FIPA de nfeAFP11-V9Q marcado con TRITC. ii) Morfología de cristales de hielo producida por nfeAFP11-V9Q. C) (i) Análisis FIPA de tritc-etiquetado de tipo salvaje nfeAFP11. ii) Morfología de cristales de hielo producida por nfeAFP11 de tipo salvaje. D) (i) Análisis FIPA de tritc-etiquetado de tipo salvaje nfeAFP6. ii) Morfología de cristales de hielo producida por nfeAFP6 de tipo salvaje. Las orientacionesdel eje C y las barras de escala son las indicadas. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

El desarrollo del método de grabado en hielo por Charles Knight para la determinación de planos de hielo ligados a AFP avanzó enormemente los estudios sobre el mecanismo de unión de hielo por AFP. Mientras que las estructuras de las AFP podían resolverse mediante cristalografía de rayos X26,27, no existía un método obvio para deducir la superficie complementaria sobre hielo a la que se unían las AFP. Cuando se caracterizó inicialmente la AFP tipo I de la platija invernal, se planteó la hipótesis de que se unía a los planos prisma primarios del hielo28. Sin embargo, los innovadores experimentos de grabado en hielo de Knight de tipo I AFP mostraron que se unen a planos piramidales de hielo13. Este resultado estimuló a la comunidad de investigación de las AFP a repensar el mecanismo de unión al hielo de las AFP y determinar con mayor precisión la cara de unión al hielo de las AFP9. Los experimentos originales de grabado en hielo de Knight se realizaron utilizando AFP nativas purificadas de los organismos productores de AFP. Con el desarrollo de AFP recombinantes y el creciente uso de etiquetas GFP, hubo una oportunidad de ampliar estos estudios a muchas otras AFP29.

La idea de incorporar colorantes proteicos fluorescentes covalentes, como la tetrametilgradamina-5-(y 6)-isotiocianato (TRITC), en el análisis surgió sólo después del éxito de los análisis AFP FIPA fusionados con GFP11. Se ha observado que las etiquetas quiméricas de proteínas fluorescentes y las modificaciones químicas por colorantes covalentes no afectan a los patrones de unión al hielo de las AFP (Figura 5). Con el primero, la GFP se fusiona con los extremos terminales N o C de las AFP, que a menudo están bien alejados del SII. Además, se puede insertar un vinculador flexible entre la GFP y la AFP, lo que permite que la etiqueta se aleje de la superficie del hielo. Con esta última estrategia de etiquetado, las cadenas laterales cargadas que reaccionan con los tintes covalentes suelen estar en superficies alejadas del SII. Si las estrategias aquí presentadas para el etiquetado fluorescente de las AFP no funcionan, la introducción de una cisteína lejos del SII para la reacción con colorantes tiol-reactivos es otra opción30. Al tomar medidas para garantizar que las etiquetas fluorescentes no afecten la unión al hielo AFP, según lo juzgado por la actividad de histéresis térmica y la morfología del cristal de hielo, estamos seguros de que el análisis FIPA muestra una verdadera representación de los patrones de unión al hielo AFP, como lo hizo en el método original de grabado en hielo.

Hay varios beneficios en el etiquetado fluorescente de las AFP para el análisis FIPA. Se requiere menos tiempo para el procedimiento, ya que no se necesita la sublimación del hielo para la visualización de planos unidos a AFP. La incorporación de proteína etiquetada en el hemisferio se puede monitorear durante el crecimiento del hielo para evaluar la finalización experimental y el patrón de unión a AFP se puede registrar en cualquier momento. Esto evita experimentos innecesariamente largos, o la finalización prematura del crecimiento del hielo. El etiquetado fluorescente permite una visualización más clara del patrón de unión a AFP que antes posible con el grabado, como se ve en la comparación de los resultados de ambos métodos aplicados a las AFP tipo I y tipo III (Figura 5). Sin embargo, un grabado de hielo post-FIPA se puede llevar a cabo fácilmente colocando el hemisferio en un congelador durante varias horas, lo que significa que ambos análisis se pueden hacer en la misma muestra, ya que se necesitan concentraciones similares de AFP para ambos métodos. Una ventaja valiosa de FIPA es la capacidad de visualizar más de un AFP etiquetado de manera diferente en el mismo hemisferio de hielo (Figura 7). Esto es útil para ilustrar las diferencias en los planos de unión al hielo AFP vistos con diferentes tipos de AFP, isoformas y mutantes de actividad.

El análisis FIPA ya se ha utilizado en varios estudios de AFP. Se ha utilizado para apoyar la hipótesis de que la unión al plano basal es exclusiva de las AFP hiperactivas y necesaria para su alta actividad18. Se encontró que las AFP moderadamente activas no se unen al plano basal (Figura 8A), pero muchas AFP hiperactivas cubren completamente el hemisferio de hielo, incluido el plano basal del hielo (Figura 8B)5,20,31. El análisis FIPA también se ha utilizado para estudiar la función de residuos específicos de unión al hielo. Por ejemplo, el análisis FIPA se llevó a cabo en varias isoformas y mutantes de tipo III, algunas de las cuales previenen el crecimiento del hielo, y algunas de las cuales se ha encontrado que solo dan forma al hielo11,21,32. A partir de los estudios, se encontró que los residuos particulares son importantes en la incorporación de las AFP en el hielo y otros son importantes en la especificidad del plano de hielo (Figura 9).

Otros métodos para estudiar los patrones de unión a la AFP en cristales de hielo individuales incluyen la observación directa por microscopía de fluorescencia16,33 y la microfluídica34. Estos métodos tienen la ventaja de la sensibilidad a la dinámica de la unión de la AFP al hielo y el monitoreo de la simultaneidad de la conformación del hielo con la afinidad de la AFP con el hielo, pero son menos robustos en comparación con el método FIPA para determinar la afinidad con los planos de hielo. La dinámica molecular también se está utilizando para predecir la especificidad de unión al plano de hielo de las AFP12,20,21,30,35. Utilizando el análisis FIPA, junto con las otras técnicas disponibles, estamos aprendiendo los patrones de unión del plano de hielo de cada AFP, la importancia de la composición del SII en la selección de planos de hielo y cómo la unión de planos específicos se relaciona con la actividad de las AFP.

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Disclosures

No se declaran conflictos de intereses.

Acknowledgments

PLD ocupa la Cátedra de Investigación de Canadá en Ingeniería de Proteínas. Este trabajo fue financiado por una subvención de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud a PLD. Este trabajo también fue apoyado por una subvención para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (No. 23310171) y de la Institución japonesa de avance de la investigación en tecnología bioorientada (BRAIN). Estamos agradecidos a los Dres. Chris Marshall y Mike Kuiper por el trabajo pionero que condujo a FIPA. También estamos agradecidos al Dr. Sakae Tsuda por proporcionar instalaciones para algunos de estos trabajos y a la Dra. Laurie Graham por configurar los filtros de excitación y emisión de luz fluorescente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
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La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia
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Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

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