Summary
Antivrieseiwitten (ACP's) binden zich aan specifieke ijsvlakken om ijsgroei te voorkomen of te vertragen. Fluorescentie-gebaseerde ijsvlakaffiniteitsanalyse (FIPA) is een wijziging van de oorspronkelijke ijsetsmethode voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken. AFP's zijn fluorescerend gelabeld, verwerkt in macroscopische enkelvoudige ijskristallen en gevisualiseerd onder UV-licht.
Abstract
Antivrieseiwitten (ACP's) worden uitgedrukt in een verscheidenheid aan koudharde organismen om interne ijsgroei te voorkomen of te vertragen. ASP's binden zich aan specifieke ijsvlakken door hun ijsbindende oppervlakken. Fipa-analyse (Fluorescence-based ice plane affinity) is een aangepaste techniek die wordt gebruikt om de ijsvlakken te bepalen waaraan de ABP's binden. FIPA is gebaseerd op de originele ijsetsmethode voor het bepalen van AFP-gebonden ijsvlakken. Het produceert duidelijkere beelden in een verkorte experimentele tijd. In FIPA-analyse worden ARP's fluorescerend gelabeld met een chimerische tag of een covalente kleurstof en vervolgens langzaam opgenomen in een macroscopisch enkel ijskristal, dat is voorgevormd tot een hemisfeer en is gericht op het bepalen van de a- en c-assen. De AFP-gebonden ijshelft wordt afgebeeld onder UV-licht om AFP-gebonden vlakken te visualiseren met behulp van filters om aspecifieke licht te blokkeren. Fluorescerende etikettering van de AFP's maakt real-time monitoring van AFP adsorptie in ijs mogelijk. De labels bleken geen invloed te hebben op de vliegtuigen waaraan ASP's zich binden. FIPA-analyse introduceert ook de optie om meer dan één verschillend getagde AFP op hetzelfde enkele ijskristal te binden om hun bindingsvlakken te helpen differentiëren. Deze toepassingen van FIPA helpen ons begrip te bevorderen van hoe AFP's zich binden aan ijs om de groei ervan te stoppen en waarom veel AFP-producerende organismen meerdere AFP-isovormen uitdrukken.
Introduction
De productie van antivrieseiwitten (ACP's) is een belangrijk overlevingsmechanisme van sommige organismen die in met ijs beladen omgevingen leven. Tot voor kort werd gedacht dat de enige functie van ASP's was om de groei van interne ijskristallen te voorkomen of te vertragen die de bloedsomloop zouden blokkeren, weefselschade en osmotische stress zouden veroorzaken. Organismen die geen enkele mate van bevriezing kunnen verdragen, zoals vissen, drukken ASP's uit om de groei van ijskristallen volledig te remmen1. Anderen, zoals gras, zijn vorsttolerant en drukken ACP's uit om ijsrestallisatie te remmen, wat de vorming van grote ijskristallen in hun weefsels vermindert2. Stabilisatie van membranen bij lage temperatuur is nog een andere functie die werd voorgesteld voor de APS3. Onlangs werd een nieuwe rol voorgesteld voor de AFP van een Antarctische bacterie, Marinomonas primoryensis, uit met ijs bedekte brakke meren4. Deze AFP maakt deel uit van een veel groter adhesine-eiwit5 waarvan wordt gedacht dat het de bacterie aan ijs hecht voor een betere toegang tot zuurstof en voedingsstoffen6. Van andere microben is bekend dat ze ASP's afscheiden, wat de structuur van het ijs waarin ze leven kan veranderen7.
AFP's zijn gevonden in sommige vissen, insecten, planten, algen, bacteriën, diatomeeën en schimmels. Ze hebben opmerkelijk uiteenlopende sequenties en structuren die consistent zijn met hun evolutie van verschillende voorlopers bij verschillende gelegenheden; en toch binden ze zich allemaal aan ijs en remmen ze de groei ervan door het adsorptieremmingsmechanisme8. De ASP's hebben elk een specifiek oppervlak dat fungeert als zijn ijsbindende site (IBS). Deze zijn doorgaans geïdentificeerd aan de deen plaatsgerichte mutagenese van oppervlakteresiduen9-11. De PDS wordt verondersteld om watermoleculen te rangschikken in een ijsachtig patroon dat overeenkomt met specifieke ijsvlakken. Aldus vormt AFP zijn ligand alvorens aan het te binden5, 12. IJsvlakken kunnen worden gedefinieerd door hun Miller-indexen en verschillende ASP's kunnen zich binden aan verschillende vlakken. Zo bindt type I AFP van winters bot aan de 20-21 piramidalevlakken 13, type III AFP bindt zowel primaire prisma als piramidale vlakken met behulp van een samengesteld ijsbindend oppervlak11,14, terwijl de sparrenknopworm AFP, een hyperactieve AFP, zich tegelijkertijd bindt aan zowel de primaire als basalevlakken 15,16. Andere hyperactieve AFP's, zoals MpAFP, binden zich aan meerdere ijsvlakken, zoals blijkt uit hun volledige dekking van enkele ijskristalhersenenhelften5,17. Er wordt verondersteld dat het vermogen van hyperactieve ACP's om het basale vlak te binden, evenals andere vlakken, hun 10-voudige hogere activiteit kan verklaren ten opzichte van matig actieve ASP's18. Hoewel de efficiëntie van hyperactieve ACP's goed gedocumenteerd is, wordt hun vermogen om zich te binden aan meerdere ijsvlakken nog steeds niet begrepen.
De oorspronkelijke methode voor het bepalen van de AFP-gebonden ijsvlakken werd ontwikkeld door Charles Knight13,19. Bij deze methode wordt een macroscopisch enkel ijskristal op een holle metalen staaf (koude vinger) gemonteerd en gevormd tot een halfrond door het onder te dompelen in een hemisferische beker gevuld met ontgast water. Vervolgens wordt de hemisfeer ondergedompeld in een verdunde oplossing van AFP's en wordt een laag ijs uit de AFP-oplossing gedurende enkele uren op de ijskristalhelft gekweekt, gecontroleerd door de temperatuur van de ethyleenglycol die door de koude vinger circuleert. Het ijskristal wordt uit de oplossing verwijderd, losgemaakt van de koude vinger en in een vriesruimte van -10 tot -15 °C geplaatst. Het oppervlak wordt geschraapt met een scherp mes om de bevroren oppervlaktefilm van antivries-eiwitoplossing te verwijderen en het ijskristal mag minstens 3 uur sublimeren. Na sublimatie kunnen de ijsvlakken die door APS's worden gebonden, worden gezien als wit geëtste patronen afgeleid van resteiwit. De ijshelft kan worden georiënteerd op zijn c-as en een-assen, om de basale en prismavlakken van ijs te lokaliseren en de Miller-indexen van de geëteerde plekken te bepalen.
Hier beschrijven we een wijziging van de oorspronkelijke methode voor het bepalen van AFP-gebonden ijsvlakken, een methode die we fluorescentiegebaseerde ijsvlakaffiniteit (FIPA)11noemen. De AFP 's zijn fluorescerend gelabeld met ofwel een chimerische tag, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP)11,16,17,20, of met een fluorescerende kleurstof die covalent gebonden is aan de AFP5,21. De fluorescerend gelabelde ARP's worden geadsorbeerd tot een enkel ijskristal en overwoekerd volgens dezelfde experimentele procedure als de oorspronkelijke ijsetsexperimenten. De mate van AFP-binding aan de groeiende ijshelft kan tijdens het experiment worden gecontroleerd met behulp van een ultraviolette (UV) lamp. Nadat het experiment is voltooid, kan de hemisfeer direct van de koude vinger worden verwijderd en worden afgebeeld, zonder sublimatie. Indien gewenst kan de hemisfeer echter worden overgelaten aan sublimate om een traditionele ijst ets te visualiseren. Wijzigingen in de FIPA-methodologie verkorten het traditionele ijsetsprotocol met enkele uren. Bovendien is er het potentieel om tegelijkertijd verschillende AFP's, elk met een ander fluorescerend label, in beeld te brengen om de overlappende patronen van AFP-gebonden ijsvlakken te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het kweken van Enkele Ijskristallen
- Neem een schone metalen pan (15 cm diameter, 4,5 cm hoog) die in een koelbad met ethyleenglycol past en erop kan drijven.
- Bereid polyvinylchloride (PVC) cilindrische mallen (4,5 cm diameter, 3-4 cm hoog, 4 mm dik), door secties uit een pijp te zagen.
- Snijd een inkeping (1 mm breed, 2 mm hoog) aan één kant (afbeelding 1A).
- Bereid zoveel mogelijk mallen die comfortabel in de pan passen (figuur 1B).
Opmerking: Een studie toonde aan dat polyvinylalcohol (PVA) ijskernen kan beïnvloeden22. In ons pvc-systeem met open schimmels zijn we echter geen problemen met atypische ijsvorming tegengekomen.
- Breng een lichte film vacuümvet aan op de onderste oppervlaktering van elke mal, het oppervlak met de inkeping uitgesneden. Sluit dit ingevette, gekerfde oppervlak af op een metalen pan met de inkepingen weg van het midden van de pan. Zorg ervoor dat u de inkepingen niet met vet vult of belemmert.
- Voeg 0,22 μm gefilterd en ontgast/gedeioneerd water toe aan het midden van de pan, maar buiten de mallen, en laat het water langzaam in de mallen komen via de inkepingen. Zorg ervoor dat u geen bubbels introduceert. De waterlaag moet ongeveer 5 mm diep zijn.
- Plaats de pan in een temperatuurgestuurd ethyleenglycolbad gekoeld tot -0,5 °C. De pan moet perfect waterpas staan. Voeg indien nodig ballastgewichten toe aan de zijkanten van de pan.
- Nadat de pan en het water -0,5 °C hebben bereikt, voegt u een klein stukje ijs toe aan het midden van de pan, buiten de mallen.
- Dit zal de ijsgroei in het onderkoelde water over de pan en in de mallen kernen. De kleine inkeping aan de onderkant van elke mal zorgt ervoor dat slechts één ijskristal zich kan voortplanten, wat resulteert in een enkel ijskristal in elke mal.
- Incubeer 's nachts om een laag ijs te vormen.
- Voeg in de komende drie dagen eenmaal daags 13 ml ontgast/gedeioneerd water van 4 °C toe aan elke mal en laat de temperatuur van het ethyleenglycolbad na elke toevoeging dalen tot -0,8 °C op dag één, tot -1,1 °C op dag twee en tot -1,5 °C op dag drie.
- Incubeer 's nachts bij die temperaturen.
- Op dag vier moeten de mallen volledig gevuld zijn met ijs.
- Trek de mallen van de pan, duw de ijskristallen uit de mallen en bewaar ze op een schoon oppervlak, zoals een weegboot, ongeveer 1 uur in een vriezer van -20 °C voordat u ze gebruikt.
- In plaats van veel kleine enkele ijskristallen te bereiden, kan een groot enkel ijskristal van enkele liters in volume worden bereid in een incubator met constante temperatuur zoals beschreven door Knight23. Het grote ijskristal kan een jaar of langer worden bewaard als het bedekt wordt gehouden in een vriezer van -15 tot -20 °C. Delen van enkel kristal kunnen naar wens met een zaag uit het ijsblok worden gesneden.
2. Singulariteit en oriëntatie van het ijskristal bepalen
- Bepaal of het ijs dat uit de mal wordt verdreven een enkel kristal is door in een vriesruimte te observeren, tussen twee gekruiste polaroïden (figuur 1D).
- Als het ijskristal enkelvoudig is, mogen er geen scheuren of discontinuïteiten worden gezien en mag de lichtrichting in het ijskristal niet veranderen.
Opmerking: Als er geen vriesruimte beschikbaar is, kan in plaats daarvan een koelruimte worden gebruikt in alle vereiste stappen, waarbij u voorzichtig bent om snel te werken en spaarzaam met het ijs om te gaan.
- Als het ijskristal enkelvoudig is, mogen er geen scheuren of discontinuïteiten worden gezien en mag de lichtrichting in het ijskristal niet veranderen.
- Door de ijsbirefringentie kan men tegelijkertijd de oriëntatie van de c-asbepalen. Gebruik de volgende informatie om de oriëntatie te bepalen:
- Wanneer de c-asprecies evenwijdig is aan het invallende licht, zal er in theorie geen licht door de gekruiste polaroïden gaan. Als het invallende licht iets parallel met de c-aswordt betiteld, wordt een uniform veelkleurig spectrum van licht door het kristal overgebracht wanneer het tussen de gekruiste polaroïden wordt gedraaid. Deze uniforme transmissie ontstaat door de optische inactiviteit van ijs Ih langs zijn c-as24. Het basale vlak van het ijskristal is normaal voor de c-as.
- Wanneer de c-asverder van parallel aan het invallende licht is en het ijskristal tussen de gekruiste polaroids wordt gedraaid, wisselt het overgedragen licht af tussen 0-100% overdracht met elke 90° rotatie van het kristal.
- Meestal zal de c-asnormaal zijn voor het cirkelvormige vlak van het cilindrische ijskristal.
- Bepaal de oriëntatie van de a-assendoor ijsputjes 25 die wordt gedaan door het ijskristal stevig in aluminiumfolie te wikkelen, een klein gaatje met een naald door de folie in het ijs op het basale vlak te steken (normaal voor de c-as)en het gedurende 20 minuten onder vacuüm te plaatsen.
- Deze behandeling zal een ets met zeshoekige symmetrie op het basale vlak produceren, waarbij de a-assendoor de hoekpunten van de zeszijdige ster lopen (figuur 2A).
- Indien gewenst kan het ijskristal worden gesneden met een zaag parallel of loodrecht op één kant van de zeshoek om het te monteren met een primair of secundair prismavlak loodrecht op de koude vinger (figuur 3).
3. Adsorptie van fluorescerend gelabelde antivrieseiwitten tot een enkel ijskristal
- Monteer een enkel ijskristal op de koude vinger (figuur 1C) door eerst een holte in de bovenkant van het kristal te boren. Om dit te doen, wisselt u het smelten van het ijs af met twee aluminium staven met een iets andere diameter, maar vergelijkbaar met de diameter van de koude vinger, om de holte te vormen waarin de koude vinger kan passen.
- Koel de koude vinger af tot -0,5 °C, plaats deze in de ijsholte en houd het ijskristal op zijn plaats totdat het bevriest tot het metaal bevriest (afbeelding 2B). Vermijd luchtbellen bij het bevestigen van het kristal aan de vinger, omdat ze een efficiënte overdracht van warmte van de vinger naar de staaf belemmeren.
- Vul een hemisferische beker met een diameter van ongeveer twee keer de diameter van het ijskristal met gefilterd gedeïoniseerd water of buffer, gekoeld tot ongeveer 4 °C. Dompel het koude vingergebonden ijskristal onder in de beker en verwijder overtollig water of buffer zodanig dat de bovenkant van het ijskristal ongeveer waterpas staat met de vloeistoflaag en het ijs de bekerwanden niet raakt.
- Bedek de beker met isolatie en verlaag de temperatuur tot -5 °C.
- Wacht ongeveer 1 uur tot het ijskristal zich vormt tot een halfrond en controleer de status ongeveer elke 20 minuten (figuur 2C).
- Het ijs zal de vorm aannemen van de hemisferische beker door het smelten en laten groeien van het ijskristal, maar het mag nooit overgroeien om de bekerwanden aan te raken. Er moet minstens 1 cm opening zijn tussen de muur en de hemisfeer en de koude vinger mag niet uit het ijs steken.
- Verwijder de beker uit het ijskristal en voeg de fluorescerende eiwitoplossing toe aan een eindvolume van 25-30 ml en de gewenste analyseconcentratie, waarbij u voorzichtig moet zijn om het totale vloeibare volume in de beker ongewijzigd te houden. Een typische AFP-concentratie is 0,1 mg/ml.
- Breng het ijskristal opnieuw in de beker zodat de bovenkant van het ijskristal op niveau is met de vloeistof en het ijskristal de bekerwanden niet raakt (afbeelding 2D).
- Laat de koude vingertemperatuur zakken tot -8 °C en laat de eiwitoplossing 2-3 uur invriezen in het ijskristal, waardoor de oplossing vaak wordt geroerd. Het ijs gevormd uit de eiwitoplossing moet ten minste 5 mm zijn voordat de ijsgroei wordt gestopt.
- Verwijder het ijskristal uit de beker terwijl het nog aan de koude vinger is bevestigd. Maak het ijs los van het laatste door het koelmiddel via de koude vinger op te warmen tot net boven 0 °C en wacht tot het ijskristal smelt.
- Plaats de kristalvlakte kant naar beneden op een schoon oppervlak, zoals een weegschaal, en zorg ervoor dat u het nieuw gevormde ijs niet aanraakt en bewaar het ten minste 20 minuten bij -20 °C voordat u het inlevert.
4. Visualisatie van antivries-eiwitgebonden ijsvlakken
- Visualisatie van fluorescentie gebeurt in een verduisterde vriezer of koude kamer, door de ijskristal platte kant naar beneden te plaatsen onder lampen met golflengtespecifieke excitatiefilters om het fluorescerende label en camera-emissiefilters te prikkelen om ander niet-specifiek licht te blokkeren. Op basis van het patroon kunnen de ijsvlakken die door ASP's zijn gebonden, worden geschat (figuur 4).
- Als golflengtespecifieke lichten niet beschikbaar zijn, kan in plaats daarvan een UV-lichtbak worden gebruikt.
- Traditionele ijs etsen kunnen ook eenvoudig worden uitgevoerd door de ijshelft gedurende ten minste 3 uur te laten sublimeren bij -20 °C, waarna resteiwitpoeder zichtbaar kan worden op het ijsoppervlak (figuur 5).
- Stap 2.3 kan worden herhaald om de oriëntatie van de a-assenvan de voltooide ijshelft te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De voorbereiding en montage van het enkele ijskristal zijn de twee stappen van de FIPA-procedure waarbij meestal fouten worden gemaakt. Bepalen of het voorbereide ijskristal enkelvoudig is, wordt gedaan door het te onderzoeken door gekruiste polaroids (figuur 1D),zoals beschreven in stap 2.1 van de protocolsectie. Als voor de FIPA-analyse een multikristallijn ijskristal wordt gebruikt, zal het resultaat discontinue binding van de ACP's op de hemisfeer zijn zonder een coherent bindingspatroon (figuur 6B). Als de ijskristalinterfaces zich rond de ijsvlakken bevinden waaraan de AFP zich bindt, is het eindresultaat mogelijk niet interpreteerbaar. Om deze reden moet het ijskristal zorgvuldig worden gecontroleerd op singulariteit voordat u naar de volgende stappen gaat. Om de kans op het hebben van enkele ijskristallen voor de FIPA-analyse te vergroten, moeten er tegelijkertijd meerdere worden gemaakt.
Een andere veel voorkomende fout is het verkeerd uitlijnen van de kristalvlakken met de koude vinger tijdens de montage. Om de primaire of secundaire prismavlakken loodrecht op de koude vinger te monteren, moet het enkele ijskristal eerst worden georiënteerd door ijs putjes, vervolgens snijden op basis van de oriëntatie van de stervormige ets (figuren 2A en 3), zoals beschreven in stap 2.3 van het protocolgedeelte. Als het ijskristal verkeerd uitgelijnd is gemonteerd, zal het eindresultaat een hemisfeer produceren waarbij de evenaar van de hemisfeer niet in lijn is met de symmetrie van de ijsvlakken (figuur 6C). Hoewel dit een interpreteerbaar resultaat is, zal het minder informatief zijn dan een correct uitgelijnd ijskristal, omdat de grootste omtrek van de hemisfeer zich op de evenaar bevindt (figuur 4).
Figuur 1. Apparatuur voor het kweken en monteren van enkele ijskristallen. A) PVC mallen. B) Pan in ethyleenglycolbad met PVC-mallen. C) Koude vinger met stroom van ethyleenglycol die door de witte pijl wordt getoond. De witte stippellijn geeft de binnenwand van de koude vinger aan. D) Diagram van gekruiste polaroids voor het oriënteren van een enkel ijskristal. De lichtbron is geel, gekruiste polaroids zijn grijs en het enkele ijskristal is wit. De oriëntatie van de polaroids (grijze pijlen) en ijskristaloriëntatie (rode pijlen) worden aangegeven. Van links naar rechts is het ijskristal zo georiënteerd dat de c-asloodrecht staat op de onderste polaroid, 45° op de onderste polaroid en evenwijdig aan het invallende licht. Het licht dat door de gekruiste polaroids en ijs gaat, zal donker, licht of zwak veelkleurig door de bovenste polaroid verschijnen, afhankelijk van de oriëntatie van het ijskristal. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Het voorbereiden van ijskristal voor FIPA. A) Het bepalen van de oriëntatie van assen door ijstentachtig met zeshoekige symmetrie. Het basale vlak van het kristal is evenwijdig aan het vlak van de pagina. B) Montage van het enkele ijskristal op de koude vinger. C) IJs na vorming tot halfrond. D) IJshelft ondergedompeld in hemisferische beker gevuld met eiwitoplossing. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Montage van ijskristal op basis van oriëntatie. A) Diagram van het monteren van ijs met (i) het basale vlak, (ii) een primair prismavlak en (iii) een secundair prismavlak loodrecht op de koude vinger. Voor de oriëntaties ii) en iii) moet het ijskristal doormidden worden gesneden, zoals in de afbeelding is aangegeven. B) FIPA-resultaten van pacific blauw gelabeld type III nfeAFP8 na montage van ijskristallen met (i) het basale vlak en (ii) een primair prismavlak loodrecht op de koude vinger. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Het interpreteren van AFP-gebonden vlakken uit FIPA-analyseresultaten. A) Weergave van de gebonden vlakken van Ih ijs; en B) het overeenkomstige FIPA-analyseresultaat wanneer het enkele ijskristal is gemonteerd met een primair prismavlak loodrecht op de koude vinger. Panelen vertegenwoordigen (i) basaal vlak, (ii) primair prismavlak, (iii) secundair prismavlak, (iv) piramidaal vlak uitgelijnd met de a-assen, en (v) piramidaal vlak offset naar de a-assen. C) Morfologie van een enkel ijskristal wanneer gekweekt in oplossing van APS die piramidale vlakken binden i) uitgelijnd op de a-assen en ii) offset van de a-assen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Vergelijking van traditionele ijsets versus FIPA. A) (i) De traditionele ets van type I AFP (HPLC6 isoform) geproduceerd door de winter bot (Pseudopleuronectes americanus) wordt getoond zoals oorspronkelijk geproduceerd door Knight et al., (1991). ii) de overeenkomstige FIPA-analyse van hetzelfde eiwit met TRITC. B) i) Traditionele ets van een viervoudige IBS mutant (V9Q/V19L/G20V/I41V) van type III nfeAFP11 (van de Japanse palingpuit Zoarces elongatuskner)21. ii) de overeenkomstige FIPA-analyse van hetzelfde eiwit met TRITC. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Hemisferen als gevolg van veelvoorkomende FIPA-analysefouten. Er werden analyses uitgevoerd op GFP-gelabeld type III HPLC12-A16H. A) Een optimaal FIPA-resultaat ter vergelijking. Het ijskristal werd gemonteerd met zijn primaire prismavlak loodrecht op de koude vinger. B) FIPA-analyse die per ongeluk werd uitgevoerd met behulp van een ijshelft die uit meer dan één kristal bestond. C) FIPA-analyse die werd uitgevoerd op een verkeerd uitgelijnd enkel ijskristal. Het secundaire prismavlak was niet precies loodrecht op de koude vinger gemonteerd. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Fipa-analyse gebruiken om ijsbindende patronen van verschillende ASP's te vergelijken. Pacific blue-label type III nfeAFP8 werd gecombineerd met TRITC-gelabeld type I AFP en er werd één FIPA-analyse uitgevoerd. A) Visualisatie van alleen type III nfeAFP8. B) Visualisatie van alleen type I AFP. C) Visualisatie van type III nfeAFP8 en type I AFP samen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 8. FIPA van matig actieve en hyperactieve ABP's. A) FIPA-analyse van drie verschillende matig actieve vis-ABP's; i) TRITC-gelabeld type I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus), (ii) TRITC-gelabeld type II AFP (Ca2+-onafhankelijke isoform, Longsnout stroper), (iii) Pacific-blue-label type III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B) FIPA-analyse van drie verschillende hyperactieve ACP's; (i) GFP-gelabeld MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (ii) TRITC-gelabelde sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (iii) GFP-gelabeld TmAFP (Tenebrio molitor). In alle afbeeldingen staat de c-asloodrecht op het vlak van de pagina. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 9. Relatie van fluorescerend patroon geproduceerd door FIPA-analyse met ijskristalmorfologie van verschillende type III AFP-isovormen en mutanten11,21. A) i) FIPA-analyse van QAE-A16H met GFP-tag. ii) IJskristalmorfologie geproduceerd door QAE-A16H. B) i) FIPA-analyse van TRITC-gelabelde nfeAFP11-V9Q. ii) IJskristalmorfologie geproduceerd door nfeAFP11-V9Q. C) i) FIPA-analyse van TRITC-gelabeld wildtype nfeAFP11. ii) IJskristalmorfologie geproduceerd door nfeAFP11 van het wilde type. D) i) FIPA-analyse van TRITC-gelabeld wildtype nfeAFP6. ii) IJskristalmorfologie geproduceerd door nfeAFP6 van het wildtype. C-asstanden en schaalbalken zijn zoals aangegeven. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ontwikkeling van de ijsetsmethode door Charles Knight voor de bepaling van AFP-gebonden ijsvlakken zeer geavanceerde studies over het mechanisme van ijsbinding door AFP's. Terwijl structuren van AFP's konden worden opgelost door röntgenkristallografie26,27, was er geen voor de hand liggende methode om het complementaire oppervlak op ijs af te leiden waaraan het AFP gebonden was. Toen type I AFP van winter bot aanvankelijk werd gekenmerkt, werd verondersteld te binden aan de primaire prismavlakken van ijs28. Knight's baanbrekende ijsetsexperimenten van type I AFP toonden echter aan dat ze zich binden aan piramidevormige ijsvlakken13. Dit resultaat stimuleerde de AFP-onderzoeksgemeenschap om het mechanisme van AFP-ijsbinding te heroverwegen en het ijsbindende gezicht van AFP's nauwkeuriger te bepalen9. Knight's originele ijsetsexperimenten werden gedaan met behulp van inheemse AFP's gezuiverd van de AFP-producerende organismen. Met de ontwikkeling van recombinante AVP's en het toenemende gebruik van GFP-tags was er een mogelijkheid om deze studies uit te breiden naar vele andere AFP's29.
Het idee om covalente fluorescerende eiwitkleurstoffen, zoals tetramethylrhodamine-5-(en 6)-isothiocyanaat (TRITC), in de analyse op te nemen, kwam pas na het succes van de met GFP gefuseerde AFP FIPA-analyses11. De chimerische fluorescerende eiwittags en de chemische modificaties door covalente kleurstoffen hebben geen invloed op de ijsbindende patronen van de APS 's (figuur 5). Met de eerste wordt GFP versmolten met de N- of C-terminale uiteinden van de AFP's, die vaak goed uit het PDS zijn verwijderd. Ook kan een flexibele linker tussen de GFP en AFP worden geplaatst, waardoor de tag van het ijsoppervlak kan worden verwijderd. Met de laatste etiketteringsstrategie bevinden de geladen zijketens die reageren met de covalente kleurstoffen zich meestal op oppervlakken weg van het PDS. Als de hier gepresenteerde strategieën voor fluorescerend labelen van APS niet werken, is de introductie van een cysteïne uit de buurt van het PDS voor reactie met thiol-reactieve kleurstoffen een andere optie30. Door maatregelen te nemen om ervoor te zorgen dat de fluorescerende labels geen invloed hebben op de AFP-ijsbinding, zoals beoordeeld door thermische hystereseactiviteit en ijskristalmorfologie, zijn we ervan overtuigd dat de FIPA-analyse een echte weergave van AFP-ijsbindingspatronen laat zien, zoals bij de oorspronkelijke ijsetsmethode.
Er zijn verschillende voordelen aan het fluorescerend labelen van de ASP's voor de FIPA-analyse. Er is minder tijd nodig voor de procedure, omdat de sublimatie van ijs voor visualisatie van AFP-gebonden vlakken niet nodig is. De opname van gelabeld eiwit in de hemisfeer kan worden gecontroleerd tijdens de groei van het ijs om de experimentele voltooiing te beoordelen en het AFP-bindende patroon kan op elk moment worden geregistreerd. Dit voorkomt onnodig lange experimenten of voortijdige voltooiing van ijsgroei. De fluorescerende etikettering maakt duidelijkere AFP-bindende patroonvisualisatie mogelijk dan voorheen mogelijk was met etsen, zoals blijkt uit de vergelijking van de resultaten van beide methoden die worden toegepast op type I- en type III-AFP's (figuur 5). Een post-FIPA-ijsetachtig kan echter gemakkelijk worden uitgevoerd door de hemisfeer enkele uren in een vriezer te plaatsen, wat betekent dat beide analyses op hetzelfde monster kunnen worden uitgevoerd, omdat voor beide methoden vergelijkbare AFP-concentraties nodig zijn. Een waardevol voordeel van FIPA is de mogelijkheid om meer dan één AFP met een verschillend label op dezelfde ijshelft te visualiseren (figuur 7). Dit is handig voor het illustreren van verschillen in AFP-ijsbindende vlakken gezien met verschillende AFP-typen, isovormen en activiteitsmutanten.
Fipa-analyse is al gebruikt in verschillende AFP-studies. Het is gebruikt om de hypothese te ondersteunen dat basale vlakbinding uniek is voor hyperactieve ACP 's en noodzakelijk is voor hun hoge activiteit18. Matig actieve ACP's bleken het basale vlak niet te binden (figuur 8A), maar veel hyperactieve ACP's bedekken de ijshelft volledig, inclusief het basale ijsvlak (figuur 8B)5,20,31. Fipa-analyse is ook gebruikt om de functie van specifieke ijsbindende residuen te bestuderen. Zo werd fipa-analyse uitgevoerd op verschillende type III-isovormen en mutanten, waarvan sommige ijsgroei voorkomen, en waarvan sommige alleen ijs11,21,32bleken te vormen. Uit de studies bleek dat bepaalde residuen belangrijk zijn voor de integratie van de ACP's in ijs en andere zijn belangrijk in de specificiteit van ijsvlakten (figuur 9).
Andere methoden voor het bestuderen van AFP-bindende patronen op enkelvoudige ijskristallen omvatten directe observatie door fluorescentiemicroscopie16,33 en microfluïdica34. Deze methoden hebben het voordeel van gevoeligheid voor de dynamiek van de gehechtheid van de AFP aan ijs en monitoring van ijsvormende simultaneiteit met de affiniteit van de AFP met het ijs, maar zijn minder robuust in vergelijking met de FIPA-methode bij het bepalen van de affiniteit met de ijsvlakken. Moleculaire dynamica wordt ook gebruikt om de ijsvlakbindingsspecifiekheid van AMP's12,20,21,30,35te voorspellen. Met behulp van FIPA-analyse, samen met de andere beschikbare technieken, leren we de bindingspatronen van ijsvlakken van elke AVP, het belang van de samenstelling van het PDS bij het selecteren van ijsvlakken en hoe binding van specifieke vlakken verband houdt met AFP-activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
PLD bekleedt de Canada Research Chair in Protein Engineering. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Canadian Institutes of Health Research aan PLD. Dit werk werd ook ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek van de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr. 23310171) en van de Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). We zijn Drs. Chris Marshall en Mike Kuiper dankbaar voor het pionierswerk dat heeft geleid tot FIPA. We zijn dr. Sakae Tsuda ook dankbaar voor het leveren van faciliteiten voor een deel van dit werk en aan Dr. Laurie Graham voor het opzetten van de fluorescerende lichtopwekkers en emissiefilters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
