Summary
Proteínas anticongelantes (AFPs) se ligam a planos específicos de gelo para prevenir ou retardar o crescimento do gelo. A análise de afinidade de aviões de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma modificação do método original de gravação de gelo para determinação de aviões de gelo ligados à AFP. Os AFPs são rotulados fluorescentemente, incorporados em cristais de gelo simples macroscópicos, e visualizados sob luz UV.
Abstract
As proteínas anticongelante (AFPs) são expressas em uma variedade de organismos resistentes a frio para prevenir ou retardar o crescimento interno do gelo. Os AFPs se ligam a planos específicos de gelo através de suas superfícies de ligação de gelo. A análise de afinidade de plano de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma técnica modificada usada para determinar os planos de gelo aos quais os AFPs se ligam. A FIPA baseia-se no método original de gravação de gelo para determinar aviões de gelo com destino à AFP. Produz imagens mais claras em um tempo experimental encurtado. Na análise fipa, os AFPs são fluorescentemente rotulados com uma etiqueta quimrica ou um corante covalente e, em seguida, lentamente incorporado em um cristal de gelo único macroscópico, que foi pré-formado em um hemisfério e orientado para determinar os eixos a e c. O hemisfério de gelo ligado à AFP é retratado sob luz UV para visualizar aviões ligados à AFP usando filtros para bloquear a luz inespecífica. A rotulagem fluorescente dos AFPs permite o monitoramento em tempo real da adsorção da AFP no gelo. Os rótulos foram encontrados para não influenciar os planos aos quais os AFPs se ligam. A análise fipa também introduz a opção de vincular mais de um AFP marcado de forma diferente no mesmo cristal de gelo único para ajudar a diferenciar seus planos de ligação. Essas aplicações da FIPA estão ajudando a avançar nosso entendimento de como as AFPs se ligam ao gelo para deter seu crescimento e por que muitos organismos produtores da AFP expressam múltiplas isoformas da AFP.
Introduction
A produção de proteínas anticongelantes (AFPs) é um importante mecanismo de sobrevivência de alguns organismos que vivem em ambientes carregados de gelo. Até recentemente, pensava-se que a única função das AFPs era prevenir ou retardar o crescimento de cristais de gelo internos que bloqueassem a circulação, causassem danos teciduais e estresse osmótico. Organismos que não toleram qualquer grau de congelamento, como peixes, expressam AFPs para inibir completamente o crescimento de cristais de gelo1. Outros, como a grama, são tolerantes ao congelamento e expressam AFPs para inibir a recristalização do gelo que reduz a formação de grandes cristais de gelo em seus tecidos2. A estabilização das membranas em baixa temperatura é mais uma função sugerida para as AFPs3. Recentemente, um novo papel foi sugerido para a AFP de uma bactéria antártica, Marinomonas primoryensis, dos lagos salgados cobertos de gelo4. Esta AFP faz parte de uma proteína de adesivo5 muito maior que se pensa em anexar a bactéria ao gelo para melhor acesso ao oxigênio e nutrientes6. Outros micróbios são conhecidos por segregar AFPs, o que pode alterar a estrutura do gelo em que vivem7.
AfPs foram encontrados em alguns peixes, insetos, plantas, algas, bactérias, diatomas e fungos. Eles têm sequências e estruturas notavelmente divergentes consistentes com sua evolução de diferentes progenitores em várias ocasiões; e ainda assim todos se ligam ao gelo e inibem seu crescimento pelo mecanismo de inibição de adsorção8. Cada um dos AFPs tem uma superfície específica que atua como seu local de ligação de gelo (IBS). Estes têm sido tipicamente identificados por mutagênese direcionada ao local de resíduos superficiais9-11. O IBS é hipótese para organizar moléculas de água em um padrão semelhante ao gelo que corresponde a planos específicos de gelo. Assim, a AFP forma seu ligante antes de vinculá-lo a ele5, 12. Aviões de gelo podem ser definidos por seus índices Miller, e diferentes AFPs podem se ligar a diferentes planos. Assim, o tipo I AFP do flounder de inverno liga-se aos 20-21 planos piramidários13, tipo III AFP liga tanto os planos prisma primário quanto o piramidal usando uma superfície composta de ligação de gelo11,14, enquanto o budworm de abeto AFP, um AFP hiperativo, liga-se simultaneamente aos planos primários e basais15,16. Outros AFPs hiperativos, como o MPAFP, ligam-se a múltiplos planos de gelo, como mostra a cobertura completa dos hemisférios de cristal de geloúnico 5,17. É hipótese, que a capacidade dos AFPs hiperativos de ligar o plano basal, bem como outros planos, pode explicar sua atividade 10 vezes maior sobre AFPs moderadamente ativa18. Embora a eficiência dos AFPs hiperativos esteja bem documentada, sua capacidade de se ligar a múltiplos planos de gelo ainda não é compreendida.
O método original para determinar os aviões de gelo com destino à AFP foi desenvolvido por Charles Knight13,19. Neste método, um cristal de gelo único macroscópico é montado em uma haste de metal oca (dedo frio) e formado em um hemisfério submergindo-o em um copo hemisférico cheio de água desgassada. Em seguida, o hemisfério é submerso em uma solução diluída de AFPs e uma camada de gelo é cultivada a partir da solução AFP para o hemisfério cristal de gelo ao longo de várias horas controlada pela temperatura do glicol de etileno circulando através do dedo frio. O cristal de gelo é removido da solução, retirado do dedo frio, e colocado em uma sala de congelador de -10 a -15 °C. A superfície é raspada com uma lâmina afiada para remover o filme de superfície congelada da solução de proteína anticongelante e o cristal de gelo é permitido sublimar por pelo menos 3 horas. Após a sublimação, os planos de gelo ligados por AFPs podem ser vistos como padrões brancos gravados derivados de proteína residual. O hemisfério de gelo pode ser orientado para seu eixo ce eixos,para localizar os planos basais e prisma de gelo, e determinar os índices Miller das manchas gravadas.
Aqui descrevemos uma modificação do método original para determinar aviões de gelo vinculados à AFP, um método a que chamamos de afinidade de avião de gelo baseado em fluorescência (FIPA)11. Os AFPs são fluorescentes rotulados com uma etiqueta quimrica, como proteína fluorescente verde (GFP)11,16,17,20, ou com um corante fluorescente covalentemente ligado à AFP5,21. Os AFPs fluorescentes são adsorvidos a um único cristal de gelo e crescidos usando o mesmo procedimento experimental que os experimentos originais de gravação de gelo. A extensão da ligação da AFP ao crescente hemisfério de gelo pode ser monitorada durante todo o experimento usando uma lâmpada ultravioleta (UV). Depois que o experimento estiver completo, o hemisfério pode ser diretamente retirado do dedo frio e imageado, sem sublimação. No entanto, se desejar, o hemisfério pode ser deixado para sublimar para visualizar uma etch de gelo tradicional. Modificações introduzidas na metodologia FIPA encurtam o protocolo tradicional de gravura de gelo em várias horas. Além disso, há o potencial de imagens simultâneas de vários AFPs, cada um com um rótulo fluorescente diferente, para visualizar os padrões sobrepostos de planos de gelo ligados à AFP.
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Protocol
1. Crescendo cristais de gelo únicos
- Pegue uma panela de metal limpa (15 cm de diâmetro, 4,5 cm de altura) que se encaixe e possa flutuar sobre, um banho de resfriamento etileno glicol.
- Preparem os moldes cilíndricos de cloreto de polivinil (PVC), (4,5 cm de diâmetro, 3-4 cm de altura, 4 mm de espessura), serrando seções de um tubo.
- Corte um entalhe, (1 mm de largura, 2 mm de altura) em um lado (Figura 1A).
- Prepare quantos moldes possam caber confortavelmente na panela (Figura 1B).
Nota: Estudo mostrou que o álcool polivinyl (PVA) pode afetar a nucleação do gelo22. No entanto, em nosso sistema de PVC de molde aberto não encontramos problemas de formação atípica de gelo.
- Aplique uma película leve de graxa de vácuo no anel de superfície inferior de cada molde, que é a superfície com o entalhe cortado. Sele esta superfície untada e entalhada em uma panela de metal com os entalhes orientados para longe do centro da panela. Tenha cuidado para não encher ou obstruir os entalhes com graxa.
- Adicione 0,22 μm de água filtrada e desgaseada/desomuionizada ao centro da panela, mas fora dos moldes, e deixe a água entrar lentamente nos moldes através dos entalhes. Tenha cuidado para não introduzir bolhas. A camada de água deve ter aproximadamente 5 mm de profundidade.
- Coloque a panela em um banho de etileno glicol controlado pela temperatura resfriado a -0,5 °C. A panela deve estar perfeitamente nivelada. Adicione pesos de lastro nas laterais da panela, se necessário.
- Depois que a panela e a água atingirem -0,5 °C, adicione um pequeno pedaço de gelo no meio da panela, fora dos moldes.
- Isso nucleará o crescimento do gelo na água superfriada através da panela e nos moldes. O pequeno entalhe na parte inferior de cada molde permite que apenas um cristal de gelo se propague, resultando em um único cristal de gelo em cada molde.
- Incubar durante a noite para formar uma camada de gelo.
- Ao longo dos próximos três dias adicione 13 ml de água desgassada/desionizada a cada molde uma vez por dia e deixe cair a temperatura do banho de etileno glicol após cada adição a -0,8 °C no primeiro dia, para -1,1 °C no segundo dia, e para -1,5 °C no terceiro dia.
- Incubar a essas temperaturas durante a noite.
- No quarto dia, os moldes devem estar completamente cheios de gelo.
- Retire os moldes da panela, empurre os cristais de gelo para fora dos moldes e armazene em uma superfície limpa, como um barco de pesagem, em um congelador de -20 °C por aproximadamente 1 hora antes de manusear.
- Em vez de preparar muitos pequenos cristais de gelo, um grande cristal de gelo de vários litros em volume pode ser preparado em uma incubadora de temperatura constante, como descrito pelo Knight23. O grande cristal de gelo pode ser armazenado por um ano ou mais se mantido coberto em um congelador de -15 a -20 °C. Porções de cristal único podem ser cortadas do bloco de gelo com uma serra conforme necessário.
2. Determinando singularidade e orientação do cristal de gelo
- Determine se o gelo expelido do molde é um único cristal observando em uma sala de congelador, entre duas polaroides cruzadas (Figura 1D).
- Se o cristal de gelo é único, então não devem ser vistas rachaduras ou descontinuidades, e a direção da luz não deve mudar dentro do cristal de gelo.
Nota: Se uma sala de freezer não estiver disponível, uma sala fria pode ser usada em todas as etapas necessárias, sendo cautelosa para trabalhar rapidamente e manusear o gelo com moderação.
- Se o cristal de gelo é único, então não devem ser vistas rachaduras ou descontinuidades, e a direção da luz não deve mudar dentro do cristal de gelo.
- Devido à birefringência de gelo, pode-se determinar a orientação do eixo cao mesmo tempo. Use as seguintes informações para determinar a orientação:
- Quando o eixo cé exatamente paralelo à luz do incidente, em teoria, nenhuma luz passará pelas polaroides cruzadas. Se a luz incidente é intitulada ligeiramente de paralelo com o eixo c,um espectro multicolorido uniforme de luz é transmitido através do cristal quando é girado entre as polaroides cruzadas. Esta transmissão uniforme surge da inatividade óptica do gelo Ih ao longo de seu eixo c24. O plano basal do cristal de gelo é normal para o eixo c.
- Quando o eixo cestiver mais distante do paralelo com a luz incidente e o cristal de gelo é girado entre as polaroides cruzadas, a luz transmitida alternará entre 0-100% de transmissão a cada 90° de rotação do cristal.
- Mais comumente, o eixo cserá normal ao plano circular do cristal cilíndrico de gelo.
- Determine a orientação dos eixosa por gelo colocando25, o que é feito embrulhando o cristal de gelo firmemente em papel alumínio, cutucando um pequeno buraco com uma agulha através da folha no gelo no plano basal (normal ao eixo c),e colocando-o sob vácuo por 20 minutos.
- Este tratamento produzirá uma gravação com simetria hexagonal no plano basal, onde os eixos acorrem através dos vértices da estrela de seis lados (Figura 2A).
- Se desejar, o cristal de gelo pode ser cortado com uma serra paralela ou perpendicular a um lado do hexágono para montá-lo com um plano prisma primário ou secundário perpendicular ao dedo frio, respectivamente (Figura 3).
3. Adsorção de Proteínas anticongelantes fluorescentes rotuladas para um único cristal de gelo
- Monte um único cristal de gelo sobre o dedo frio (Figura 1C) primeiro entediando uma cavidade no topo do cristal. Para isso, alternar derreter o gelo com duas hastes de alumínio de diâmetro ligeiramente diferente, mas semelhante ao diâmetro do dedo frio, para formar a cavidade em que o dedo frio pode caber.
- Esfrie o dedo frio a -0,5 °C, coloque na cavidade de gelo e mantenha o cristal de gelo no lugar até congelar até congelar até o metal (Figura 2B). Evite bolhas de ar ao fixar o cristal no dedo, pois elas dificultam a transferência eficiente de calor do dedo para a haste.
- Encha um copo hemisférico que tenha aproximadamente o dobro do diâmetro do cristal de gelo com água ou tampão desionizado filtrado, resfriado a aproximadamente 4 °C. Submergir o cristal de gelo frio ligado ao dedo no copo e remover o excesso de água ou tampão de tal forma que o topo do cristal de gelo esteja aproximadamente nivelado com a camada líquida e o gelo não esteja tocando as paredes do copo.
- Cubra o copo com isolamento e baixe a temperatura para -5 °C.
- Aguarde aproximadamente 1 hora para que o cristal de gelo se forme em um hemisfério, verificando seu status aproximadamente a cada 20 minutos (Figura 2C).
- O gelo tomará a forma do copo hemisférico derretendo e cultivando o cristal de gelo, mas nunca deve crescer demais para tocar as paredes do copo. Deve haver pelo menos uma distância de 1 cm entre a parede e o hemisfério e o dedo frio não deve se projetar do gelo.
- Retire o copo do cristal de gelo e adicione a solução de proteína fluorescente a um volume final de 25-30 ml e concentração de análise desejada, tendo o cuidado de manter o volume líquido total no copo inalterado. Uma concentração típica da AFP é de 0,1 mg/ml.
- Resubmergar o cristal de gelo no copo para que o topo do cristal de gelo esteja nivelado com o líquido e o cristal de gelo não toque nas paredes do copo (Figura 2D).
- Solte a temperatura do dedo frio para -8 °C e deixe a solução de proteína congelar no cristal de gelo por 2-3 horas, agitando a solução com frequência. O gelo formado a partir da solução proteica deve ser de pelo menos 5 mm antes de parar o crescimento do gelo.
- Retire o cristal de gelo do copo enquanto ainda estiver preso ao dedo frio. Retire o gelo deste último aquecendo o refrigerante através do dedo frio para pouco mais de 0 °C e espere até que o cristal de gelo derreta.
- Coloque o lado plano de cristal para baixo sobre uma superfície limpa, como um prato de pesagem, tomando cuidado para não tocar no gelo recém-formado e armazenar a -20 °C por pelo menos 20 minutos antes de entregar.
4. Visualização de planos de gelo ligados à proteína anticongelante
- A visualização da fluorescência é feita em um congelador escurecido ou sala fria, colocando o fundo de cristal de gelo para baixo sob lâmpadas com filtros de excitação específicos de comprimento de onda para excitar o rótulo fluorescente e filtros de emissão da câmera para bloquear qualquer outra luz inespecífica. Com base no padrão, os planos de gelo que são vinculados por AFPs podem ser estimados (Figura 4).
- Se as luzes específicas do comprimento de onda não estiverem disponíveis, uma caixa de luz UV pode ser usada em vez disso.
- As etches de gelo tradicionais também podem ser realizadas simplesmente permitindo que o hemisfério de gelo sublimar a -20 °C por pelo menos 3 horas, após o qual o pó de proteína residual pode se tornar visível na superfície do gelo (Figura 5).
- O passo 2.3 pode ser repetido para determinar a orientação dos eixosa do hemisfério de gelo completo.
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Representative Results
A preparação e a montagem do cristal de gelo único são as duas etapas do procedimento FIPA onde os erros são mais comumente cometidos. Determinar se o cristal de gelo preparado é único é feito examinando-o através de polaroides cruzadas (Figura 1D), conforme descrito na etapa 2.1 da seção de protocolo. Se um cristal de gelo multicristalino for usado para a análise FIPA, o resultado será a vinculação descontínua dos AFPs no hemisfério sem um padrão de ligação coerente (Figura 6B). Se as interfaces de cristal de gelo estiverem localizadas ao redor dos planos de gelo aos quais a AFP vincula o resultado final pode não ser interpretável. Por esta razão, o cristal de gelo deve ser cuidadosamente verificado para singularidade antes de passar para os próximos passos. Para aumentar a probabilidade de ter cristais de gelo únicos para a análise fipa vários devem ser feitos ao mesmo tempo.
Outro erro comum é alinhar incorretamente as faces de cristal com o dedo frio durante a montagem. Para montar as faces do prisma primário ou secundário perpendicular ao dedo frio, o cristal de gelo único deve primeiro ser orientado por meio de gelo, depois cortado com base na orientação do etch em forma de estrela (Figuras 2A e 3), conforme descrito na etapa 2.3 da seção de protocolo. Se o cristal de gelo for montado desalinhado, o resultado final produzirá um hemisfério onde o equador do hemisfério não se alinha com a simetria dos planos de gelo (Figura 6C). Embora este seja um resultado interpretativo, será menos informativo do que um cristal de gelo corretamente alinhado, uma vez que a maior circunferência do hemisfério está no equador (Figura 4).
Figura 1. Equipamento para cultivar e montar cristais de gelo únicos. A) Moldes de PVC. B) Panela no banho de etilenoglicol com moldes de PVC. C) Dedo frio com fluxo de etileno glicol mostrado pela seta branca. A linha branca traço indica a parede interna do dedo frio. D) Diagrama de polaroides cruzadas para orientação de um único cristal de gelo. A fonte de luz é amarela, as polaroides cruzadas são cinzas e o cristal de gelo único é branco. A orientação das polaroides (setas cinzas) e orientação de cristal de gelo (setas vermelhas) são indicadas. Da esquerda para a direita o cristal de gelo é orientado de tal forma que o eixo cé perpendicular à polaroid inferior, 45° à polaroid inferior, e paralelo à luz incidente. A luz que passa embora as polaroides cruzadas e o gelo parecerão escuros, claros ou ligeiramente multicoloridos através da polaroid superior, dependendo da orientação do cristal de gelo. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 2. Preparando cristal de gelo para FIPA. A) Determinando orientações de eixos por trava de gelo com simetria hexagonal. O plano basal do cristal é paralelo ao plano da página. B) Montagem do cristal de gelo único no dedo frio. C) Gelo depois de se formar no hemisfério. D) Hemisfério de gelo submerso em copo hemisférico cheio de solução proteica. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 3. Montagem de cristal de gelo baseado na orientação. A) Diagrama de gelo de montagem com (i) o plano basal, (ii) um plano prisma primário, e (iii) um plano prisma secundário perpendicular ao dedo frio. Para orientações (ii) e (iii) o cristal de gelo deve ser cortado ao meio, como mostrado na figura. B) Resultados fipa do tipo III de rotulagem azul do Pacífico nfeAFP8 após a montagem de cristais de gelo com (i) o plano basal e (ii) um plano prisma primário perpendicular ao dedo frio. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 4. Interpretação de planos vinculados à AFP a partir dos resultados da análise FIPA. A) Representação dos planos vinculados do gelo Ih; e B) o resultado correspondente da análise FIPA quando o cristal de gelo único é montado com um plano prisma primário perpendicular ao dedo frio. Os painéis representam (i) plano basal, (ii) plano prisma primário, (iii) plano prisma secundário, (iv) plano piramim alinhado com oseixos a, e (v) plano piramim deslocado para oseixos a. C) Morfologia de um único cristal de gelo quando cultivado em solução de AFPs que ligam planos piramifecionais i) alinhados aos eixosa e ii) deslocados doseixos a. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 5. Comparação dos etches de gelo tradicionais versus FIPA. A) (i) O etch tradicional do tipo I AFP (isoform HPLC6) produzido pelo flounder de inverno (Pseudopleuronectes americanus) é mostrado como originalmente produzido por Knight et al., (1991). (ii) A análise FIPA correspondente da mesma proteína rotulada com TRITC. B) (i) Etch tradicional de um mutante quádruplo do IBS (V9Q/V19L/G20V/I41V) do tipo III nfeAFP11 (do pout de enguia japonês Zoarces elongatuskner)21. (ii) A análise FIPA correspondente da mesma proteína rotulada com TRITC. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 6. Hemisférios resultantes de erros comuns de análise da FIPA. As análises foram realizadas no tipo III HPLC12-A16H com etiqueta GFP. A) Um ótimo resultado FIPA para comparação. O cristal de gelo foi montado com seu plano prisma primário perpendicular ao dedo frio. B) Análise FIPA que foi conduzida inadvertidamente utilizando um hemisfério de gelo composto por mais de um cristal. C) Análise FIPA realizada em um cristal de gelo único desalinhado. O plano prisma secundário não foi montado exatamente perpendicular ao dedo frio. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 7. Usando a análise FIPA para comparar padrões de ligação de gelo de diferentes AFPs. O tipo III nfeAFP8 com a rotulagem azul do Pacífico III nfeAFP8 foi combinado com a AFP tipo I, com a rotulagem TRITC, e uma única análise FIPA foi realizada. A) Visualização apenas do tipo III nfeAFP8. B) Visualização apenas do tipo I AFP. C) Visualização do tipo III nfeAFP8 e tipo I AFP juntos. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 8. FIPA de AFPs moderadamente ativas e hiperativas. A) Análise FIPA de três AFPs de peixes moderadamente ativos; (i) TRITC rotulado tipo I AFP (ISOform HPLC6, Pseudopleuronectes americanus), (ii) TRITC-rotulado tipo II AFP(Ca2+-independent isoform, Longsnout poacher), (iii) Pacific-blue-labeled tipo III AFP (isoform nfeAFP8, Zoarces elongatuskner). B) Análise FIPA de três AFPs hiperativos diferentes; (i) MpAFP_RIV(Marinomonas primoryensis),(ii) SBWAFP(Choristoneura fumiferana),(iii) TmAFP(Tenebrioitor mol). Em todas as imagens, o eixo cé perpendicular ao plano da página. Clique aqui para ver imagem maior.
Figura 9. Relação de padrão fluorescente produzido pela análise FIPA com morfologia de cristal de gelo de diferentes isoformas e mutantes tipo III AFP e mutantes11,21. A) (i) análise FIPA do QAE-A16H marcado por GFP. (ii) Morfologia de cristal de gelo produzida por QAE-A16H. B) (i) análise FIPA do nfeAFP11-V9Q rotulado por TRITC. (ii) Morfologia de cristal de gelo produzida por nfeAFP11-V9Q. C) (i) análise FIPA do nfeAFP11 com rótulo wild-type tritc. (ii) Morfologia de cristal de gelo produzida por nfeAFP11 do tipo selvagem. D) (i) análise FIPA do nfeAFP6 com rótulo silvestre tritc. (ii) Morfologia de cristal de gelo produzida por nfeAFP6 do tipo selvagem. Asorientações do eixo C e as barras de escala são como indicado. Clique aqui para ver imagem maior.
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Discussion
Desenvolvimento do método de gravação de gelo por Charles Knight para determinação de aviões de gelo ligados à AFP estudos muito avançados sobre o mecanismo de ligação de gelo por AFPs. Considerando que as estruturas de AFPs poderiam ser resolvidas pela cristalografia de raios-X26,27, não havia um método óbvio para deduzir a superfície complementar no gelo a que a AFP se ligava. Quando o tipo I AFP do flounder de inverno foi inicialmente caracterizado, foi hipótese para se ligar aos planos principais de prisma de gelo28. No entanto, os experimentos inovadores de gravação de gelo de Knight do tipo I AFP mostraram que eles se ligam a planos piramidais de gelo13. Esse resultado estimulou a comunidade de pesquisa da AFP a repensar o mecanismo de ligação de gelo da AFP e determinar com mais precisão a face de ligação de gelo das AFPs9. Os experimentos originais de gravação de gelo de Knight foram feitos usando AFPs nativos purificados dos organismos produtores da AFP. Com o desenvolvimento de AFPs recombinantes e o uso crescente de tags GFP, houve uma oportunidade de expandir esses estudos para muitos outros AFPs29.
A ideia de incorporar corantes de proteína fluorescente covalente, como tetrametilrhodamina-5-(e 6)-isothiocyanato (TRITC), na análise só veio após o sucesso das análises da AFP FIPA fundidas pelo GFP11. As etiquetas de proteína fluorescente quimrica e as modificações químicas por corantes covalentes têm sido observadas para não afetar os padrões de ligação de gelo das AFPs (Figura 5). Com o primeiro, o GFP é fundido às extremidades do terminal N ou C dos AFPs, que muitas vezes são bem removidos do IBS. Além disso, um linker flexível pode ser inserido entre o GFP e a AFP permitindo que a etiqueta seja empurrada para longe da superfície de gelo. Com esta última estratégia de rotulagem, as cadeias laterais carregadas que reagem com os corantes covalentes geralmente estão em superfícies afastadas do IBS. Se as estratégias aqui apresentadas para rotular fluorescente OS AFPs não funcionam, a introdução de uma cisteína longe do IBS para reação com corantes tiol-reativos é outra opção30. Ao tomar medidas para garantir que os rótulos fluorescentes não afetem a ligação de gelo da AFP, como julgado pela atividade de histerese térmica e morfologia do cristal de gelo, estamos confiantes de que a análise da FIPA mostra a verdadeira representação dos padrões de ligação de gelo da AFP, como fez no método original de gravação de gelo.
Existem vários benefícios para rotular fluorescentemente os AFPs para a análise FIPA. Menos tempo é necessário para o procedimento, uma vez que a sublimação de gelo para visualização de aviões ligados à AFP não é necessária. A incorporação de proteína rotulada no hemisfério pode ser monitorada durante o crescimento do gelo para avaliar a conclusão experimental e o padrão de ligação à AFP pode ser registrado a qualquer momento. Isso evita experimentos desnecessariamente longos, ou conclusão prematura do crescimento do gelo. A rotulagem fluorescente permite uma visualização de padrão de vinculação AFP mais clara do que antes possível com a gravura, como é visto na comparação dos resultados de ambos os métodos aplicados aos AFPs tipo I e tipo III (Figura 5). No entanto, uma trava de gelo pós-FIPA pode ser facilmente conduzida colocando o hemisfério em um congelador por várias horas, o que significa que ambas as análises podem ser feitas na mesma amostra, uma vez que concentrações similares da AFP são necessárias para ambos os métodos. Uma vantagem valiosa da FIPA é a capacidade de visualizar mais do que uma AFP de diferentes denominações no mesmo hemisfério de gelo (Figura 7). Isso é útil para ilustrar diferenças em aviões de ligação de gelo da AFP vistos com diferentes tipos de AFP, isoforms e mutantes de atividade.
A análise da FIPA já foi utilizada em vários estudos da AFP. Tem sido usado para apoiar a hipótese de que a ligação de plano basal é única para AFPs hiperativas e necessária para sua alta atividade18. AfPs moderadamente ativos não foram encontrados para ligar o plano basal (Figura 8A), mas muitos AFPs hiperativos cobrem completamente o hemisfério de gelo, incluindo o plano basal de gelo (Figura 8B)5,20,31. A análise da FIPA também tem sido utilizada para estudar a função de resíduos específicos de ligação de gelo. Por exemplo, a análise fipa foi realizada em vários isóformes tipo III e mutantes, alguns dos quais impedem o crescimento do gelo, e alguns dos quais foram encontrados apenas para moldar gelo11,21,32. A partir dos estudos, verificou-se que resíduos particulares são importantes na incorporação das AFPs no gelo e outros são importantes na especificidade do plano de gelo (Figura 9).
Outros métodos para estudar padrões de ligação com a AFP em cristais de gelo únicos incluem observação direta por microscopia de fluorescência16,33 e microfluidos34. Esses métodos têm a vantagem da sensibilidade à dinâmica da ligação da AFP com o gelo e o monitoramento da simultaneidade de modelagem do gelo com a afinidade da AFP com o gelo, mas são menos robustos em comparação com o método FIPA na determinação da afinidade com os planos de gelo. A dinâmica molecular também está sendo usada para prever a especificidade de ligação do plano de gelo de AFPs12,20,21,30,35. Usando a análise fipa, juntamente com as outras técnicas disponíveis, estamos aprendendo os padrões de ligação de plano de gelo de cada AFPs, a importância da composição do IBS na seleção de planos de gelo e como a ligação de planos específicos está relacionada com a atividade da AFP.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
A PLD ocupa a Cadeira de Pesquisa do Canadá em Engenharia de Proteínas. Este trabalho foi financiado por uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde para a PLD. Este trabalho também foi apoiado por um Grant-in-Aid para pesquisas científicas da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nº 23310171) e da Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Somos gratos aos Drs. Chris Marshall e Mike Kuiper pelo trabalho pioneiro que levou à FIPA. Também agradecemos ao Dr. Sakae Tsuda por fornecer instalações para alguns deste trabalho e à Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
