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Chemistry

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

부동액 단백질(AfP)은 얼음 의 특정 평면에 결합하여 얼음 성장을 방지하거나 느리게 합니다. 형광계 얼음 비행기 선호도(FIPA) 분석은 AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 측정을위한 원래 얼음 에칭 방법을 수정한 것입니다. AFP는 형광으로 표시되고, 거시적 단일 얼음 결정에 통합되고, UV 빛 아래에서 시각화됩니다.

Abstract

부동액 단백질(Afp)은 내부 얼음 성장을 방지하거나 늦추기 위해 다양한 냉강한 유기체로 표현됩니다. AFP는 얼음 바인딩 표면을 통해 특정 얼음 평면에 바인딩합니다. 형광 계 얼음 평면 선호도 (FIPA) 분석은 AFP가 결합하는 얼음 비행기를 결정하는 데 사용되는 수정 된 기술입니다. FIPA는 AFP 바인딩 된 얼음 비행기를 결정하기위한 원래의 얼음 에칭 방법을 기반으로합니다. 실험 시간이 단축된 후 선명한 이미지를 생성합니다. FIPA 분석에서 AFP는 키메라 태그 또는 공유 염료로 형광으로 형광으로 표시된 다음 천천히 거시적 단일 얼음 결정으로 통합되어 반구로 미리 형성되어 a-및 c-축을결정합니다. AFP 바인딩 된 얼음 반구는 비특이적 인 빛을 차단하기 위해 필터를 사용하여 AFP 바인딩 평면을 시각화하기 위해 UV 빛 아래 이미지입니다. AFP의 형광 라벨링을 통해 AFP흡착을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 레이블은 AF가 바인딩하는 비행기에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. FIPA 분석은 또한 결합 평면을 차별화하는 데 도움이 동일한 단일 얼음 결정에 서로 다른 태그가 달린 AFP를 바인딩하는 옵션을 소개합니다. FIPA의 이러한 응용 프로그램은 AFP가 성장을 중지얼음에 바인딩하는 방법과 많은 AFP 생산 유기체가 여러 AFP 동위 형태를 표현하는 이유에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 도움이됩니다.

Introduction

부동액 단백질 (AfP)의 생산은 얼음이 가득한 환경에 사는 일부 유기체의 중요한 생존 메커니즘입니다. 최근까지, AFP의 유일한 기능은 혈액 순환을 막고 조직 손상을 일으키고 삼투압을 유발하는 내부 얼음 결정의 성장을 방지하거나 늦추는 것이라고 생각되었습니다. 물고기와 같은 동결정도를 견딜 수 없는 유기체는 얼음 결정 성장을 완전히 저해하기 위해 AFP를발현한다 1. 잔디와 같은 다른 것들은 동결 관용이며 조직에 큰 얼음 결정의 형성을 감소시키는 얼음 재결정을 억제하기 위해 AFP를 발현한다2. 저온에서 멤브레인의 안정화는 AFP3에대해 제안된 또 다른 기능이다. 최근, 얼음으로 덮인 황천 호수4에서남극 박테리아 마리노모나스 원시인의AFP에 대한 새로운 역할이 제안되었습니다. 이 AFP는 훨씬 더 큰 접착 단백질의일부입니다 5 산소와 영양소에 더 나은 액세스를 위해 얼음에 박테리아를 부착 하는 것으로 생각 되는6. 그밖 미생물은7에사는 얼음의 구조물을 바꿀 수 있는 AFP를 분비하기 위하여 알려지고 있습니다.

일부 물고기, 곤충, 식물, 조류, 박테리아, 규격 및 곰팡이에서 Afp가 발견되었습니다. 그들은 여러 경우에 다른 선조에서 그들의 진화와 일치 하는 현저하게 발산 순서와 구조; 그러나 그들은 모두 얼음에 결합하고 흡착 억제 메커니즘 8에 의해 성장을억제한다. AFP에는 각각 얼음 바인딩 사이트(IBS)의 역할을 하는 특정 표면이 있습니다. 이들은 전형적으로 표면 잔류물의 사이트 지시 돌연변이 발생에 의해 확인되었습니다9-11. IBS는 얼음의 특정 평면과 일치하는 얼음 모양의 패턴으로 물 분자를 배열하는 가설입니다. 따라서 AFP는5, 12에바인딩하기 전에 리간드를 형성한다. 얼음 비행기는 밀러 지수에 의해 정의될 수 있으며, 다른 AFP는 다른 평면에 묶을 수 있습니다. 따라서, 겨울 가마에서 타입 I AFP는 20-21 피라미드 평면(13)에바인딩, 유형 III AFP는 복합 얼음 바인딩 표면을 사용하여 기본 프리즘과 피라미드 평면을 모두 결합11,14,가문비 나무 budworm AFP, 활동적인 AFP, 기본 및 기저 평면 모두에 동시에 결합15,16. MpAFP와 같은 다른 활동적인 AFP는 단일 얼음 결정 반구5,17의완전한 커버리지에 의해 표시된 바와 같이 여러 얼음 비행기에 결합합니다. 기저 평면뿐만 아니라 다른 평면을 묶는 활동적인 AFP의 능력이 적당히 활성18을통해 10 배 더 높은 활동을 차지할 수 있다고 가설이 있습니다. 활동적인 AF의 효율성은 잘 문서화되어 있지만 여러 얼음 비행기에 결합하는 능력은 아직 이해되지 않습니다.

AFP 바인딩 얼음 비행기를 결정하는 원래 방법은 찰스 나이트에 의해 개발되었다13,19. 이 방법에서 거시적인 단일 얼음 결정은 중공 금속 막대 (차가운 손가락)에 장착되어 탈가스물로 채워진 반구 컵에 침수하여 반구로 형성됩니다. 이어서, 반구는 AFP의 희석용액으로 침수되고, 차가운 손가락을 통해 순환하는 에틸렌 글리콜의 온도에 의해 제어되는 몇 시간 동안 AFP 용액에서 얼음 결정 반구로 얼음층이 재배된다. 얼음 결정은 용액에서 제거되고, 차가운 손가락에서 분리하고- 10 ~ -15 °C 냉동실에 놓습니다. 표면은 부동액 단백질 용액의 냉동 표면 필름을 제거하기 위해 날카로운 블레이드로 긁어 내고 얼음 결정은 적어도 3 시간 동안 승화 할 수 있습니다. 승화 후, AfP에 의해 결합된 얼음 비행기는 잔류 단백질에서 파생된 백색 에칭 패턴으로 볼 수 있다. 얼음 반구는 c-축및-축을 향하여 얼음의 기저 및 프리즘 평면을 찾고 에칭 패치의 밀러 지수를 결정할 수 있습니다.

여기서우리는 형광기반 얼음 평면 친화성(FIPA)11로지칭하는 방법인 얼음의 AFP 바운드 평면을 결정하는 본래 방법의 수정을 설명한다. AfPs는 녹색 형광 단백질 (GFP)11,16,17,20과같은 키메라 태그 또는 AFP5,21에공유결합된 형광 염료로 형광으로 표시된다. 형광으로 표시된 AfP는 단일 얼음 결정으로 흡착되고 원래얼음 에칭 실험과 동일한 실험 절차를 사용하여 자란다. 성장하는 얼음 반구에 결합하는 AFP의 범위는 자외선(UV) 램프를 사용하여 실험 전반에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 실험이 완료되면 반구는 차가운 손가락에서 직접 분리하고 승화없이 이미지화 될 수 있습니다. 그러나 원하는 경우 반구를 상화하여 기존의 얼음 식각을 시각화할 수 있습니다. FIPA 방법론에 도입된 수정은 기존의 얼음 에칭 프로토콜을 몇 시간 단축시합니다. 또한, AFP 바인딩 된 얼음 비행기의 중복 패턴을 시각화하기 위해 서로 다른 형광 라벨을 가진 여러 AfP를 동시에 이미징 할 가능성이 있습니다.

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Protocol

1. 성장하는 단일 얼음 결정

  1. 깨끗한 금속 팬 (직경 15cm, 높이 4.5cm)을 가지고 에틸렌 글리콜 냉각 욕조에 장착할 수 있습니다.
  2. 파이프에서 단면을 톱질하여 폴리염화비닐(PVC) 원통형 몰드(직경 4.5cm, 높이 3-4cm, 두께 4mm)를 준비한다.
    1. 한쪽에 노치(폭 1mm, 높이 2mm)를 자른다(그림 1A).
    2. 팬에 편안하게 맞을 수 있는 금형을 최대한 준비합니다(그림 1B)
      참고: 연구에 따르면 폴리비닐 알코올(PVA)이 얼음핵(22)에영향을 줄 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 개방형 금형 PVC 시스템에서는 비정형 얼음 형성에 문제가 발생하지 않았습니다.
  3. 노치 컷이 있는 표면인 각 금형의 바닥 표면 링에 진공 그리스의 가벼운 필름을 적용합니다. 노치가 팬 의 중심에서 멀리 방향을 그리는 금속 팬에 기름칠한 노치 표면을 밀봉합니다. 노치를 기름으로 채우거나 방해하지 않도록 주의하십시오.
  4. 0.22 μm을 팬 중앙에 여과 및 탈기/탈기/탈온된 물을 추가하지만 금형 바깥쪽에 서서히 노치를 통해 금형에 물이 들어갈 수 있도록 합니다. 거품을 소개하지 않도록주의하십시오. 물 층은 약 5mm 깊이여야 합니다.
  5. 팬을 온도 조절에 따라 -0.5°C로 냉각된 에틸렌 글리콜 목욕에 넣습니다. 팬은 완벽하게 평평해야합니다. 필요한 경우 팬 의 측면에 밸러스트 웨이트를 추가합니다.
  6. 팬과 물이 -0.5 °C에 도달 한 후, 금형의 외부, 팬의 중간에 얼음의 작은 조각을 추가합니다.
    1. 이것은 팬을 가로 질러 금형에 과냉각 된 물에 얼음 성장을 핵 것입니다. 각 금형의 하단에 있는 작은 노치를 통해 하나의 얼음 크리스탈만 전파할 수 있으며, 그 결과 각 금형에 단일 얼음 결정이 생성됩니다.
    2. 하룻밤 동안 배양하여 얼음 층을 형성합니다.
  7. 다음 3일 동안 하루에 한 번 각 금형에 4°C 의 탈가스/탈이온수 13ml를 추가하고, 첫날 -0.8°C를 각각 첨가한 후 에틸렌 글리콜 목욕의 온도를 1일째에 -1.1°C, 3일째에는 -1.5°C로 떨어뜨린다.
    1. 하룻밤 사이에 그 온도에서 배양.
    2. 4일째가 되면 금형은 얼음으로 완전히 채워져야 합니다.
  8. 팬에서 금형을 당겨 얼음 결정을 금형밖으로 밀어 내고 계량 보트와 같은 깨끗한 표면에 보관하여 처리하기 전에 약 1 시간 동안 -20 ° C 냉동고에 보관하십시오.
  9. 많은 작은 단일 얼음 결정을 준비하는 대신, 기사23에의해 설명 된 바와 같이 볼륨에 큰 단일 얼음 결정 여러 리터를 제조 할 수 있습니다. 대형 얼음 결정은 -15 ~ -20 °C 냉동고로 덮여 보관하는 경우 1 년 이상 보관 할 수 있습니다. 단일 결정의 부분은 필요에 따라 톱으로 얼음 블록에서 절단 될 수 있습니다.

2. 얼음 결정의 특이점 과 방향을 결정

  1. 금형에서 배출된 얼음이 두 개의 교차 폴라로이드(그림 1D)사이에 있는 냉동실에서 관찰하여 단일 결정인지 확인합니다.
    1. 얼음 결정이 단일인 경우 균열이나 불연속성을 볼 수 없으며 얼음 결정 내에서 빛의 방향이 바뀌어서는 안 됩니다.
      참고: 냉동실을 사용할 수 없는 경우 필요한 모든 단계에서 콜드룸을 사용할 수 있으며, 신속하게 작업하고 얼음을 아껴서 처리해야 합니다.
  2. 얼음 비경작으로 인해 c-축의 방향을 동시에 결정할 수 있습니다. 다음 정보를 사용하여 방향을 결정합니다.
    1. c-축이인시던트 라이트와 정확히 평행하면 이론적으로 교차된 폴라로이드를 통과하는 빛은 없습니다. 입사 라이트가 c-축과평행하여 약간 제목이 있는 경우 교차 폴라로이드 사이에서 회전할 때 균일한 다색 스펙트럼의 빛이 크리스탈을 통해 전달됩니다. 이 균일한 전송은 c-축24를따라 얼음 Ih의 광학 비활성에서 발생합니다. 얼음 결정의 기저 평면은 c-축에정상입니다.
    2. c-축이입사 광과 평행에서 교차 폴라로이드 사이에 회전하면, 전달된 빛은 크리스탈의 회전마다 0-100% 송전을 번갈아 가며 회전합니다.
    3. 가장 일반적으로 c-축은원통형 얼음 결정의 원형 평면으로 정상이 될 것입니다.
  3. 알루미늄 호일에 얼음 결정을 단단히 감싸고, 호일을 통해 바늘로 작은 구멍을 뚫고 기저 평면(c-축까지 정상)에 넣고 20분 동안 진공 아래에 놓음으로써 -축의방향을 결정합니다.
    1. 이 치료는 기저 평면에 육각대 대칭으로 육각형 대칭을 가진 에칭을 생성합니다, 여기서 -축은6 면 별 (그림 2A)의정점을 통해 실행됩니다.
    2. 원하는 경우, 얼음 결정은 각각 차가운 손가락에 수직으로 1차 또는 이차 프리즘 평면으로 장착하기 위해 육각형의 한쪽에 평행 또는 수직으로 톱으로 절단될 수 있다(그림 3).

3. 단일 얼음 결정에 형광 라벨부동액 단백질의 흡착

  1. 먼저 크리스탈의 상단에 캐비티를 지루하게하여 차가운 손가락 (그림 1C)에 단일 얼음 결정을 마운트합니다. 이렇게하려면, 약간 다른 직경의 두 개의 알루미늄 막대로 얼음을 녹여, 그러나 차가운 손가락의 직경과 유사, 차가운 손가락이 맞을 수있는 구멍을 형성한다.
  2. 차가운 손가락을 -0.5°C로 식히고 얼음 구멍에 놓고 얼음 결정을 금속으로 동결할 때까지 제자리에 고정시한다(도 2B). 손가락에서 막대로 의기온을 효율적으로 전달하는 것을 방해하기 때문에 손가락에 크리스탈을 부착할 때 기포를 피하십시오.
  3. 얼음 결정의 직경의 약 2배에 달하는 반구형 컵을 여과된 탈온화 물 또는 완충액으로 채우고 약 4°C로 냉각시다. 차가운 손가락바인딩 얼음 결정을 컵에 담그고 얼음 결정의 상단이 액상층과 약 수준이며 얼음이 컵 벽을 만지지 않도록 과도한 물이나 버퍼를 제거합니다.
    1. 단열재로 컵을 덮고 온도를 -5 °C로 낮춥춥습니다.
    2. 얼음 결정이 반구로 형성될 때까지 약 1시간 정도 기다려 약 20분마다 상태를 확인합니다(그림 2C).
    3. 얼음은 얼음 결정을 녹이고 성장시킴으로써 반구형 컵의 모양을 취할 것이지만, 컵 벽을 만지기 위해 결코 자라서는 안됩니다. 벽과 반구 사이에 는 적어도 1cm 간격이 있어야하며 차가운 손가락은 얼음에서 튀어 나가지 않아야합니다.
  4. 얼음 결정에서 컵을 제거하고 25-30ml의 최종 부피와 원하는 분석 농도에 형광 단백질 용액을 추가하여 컵의 총 액체 부피를 변하지 않도록 주의하십시오. 전형적인 AFP 농도는 0.1 mg/ml입니다.
    1. 얼음 결정의 상단이 액체와 수준에 있고 얼음 결정이 컵 벽을 만지지 않도록 컵에 얼음 결정을 다시 병합 (도 2D).
    2. 차가운 손가락 온도를 -8°C로 떨어뜨리고 단백질 용액이 얼음 결정으로 2-3 시간 동안 동결되어 용액을 자주 저어줍니다. 단백질 용액에서 형성된 얼음은 얼음 성장을 멈추기 전에 적어도 5mm여야 합니다.
  5. 차가운 손가락에 부착된 상태에서 컵에서 얼음 결정을 제거합니다. 차가운 손가락을 통해 냉각수를 0°C 이상으로 데우고 얼음 결정이 녹을 때까지 기다립니다.
  6. 결정평면면을 계량 접시와 같은 깨끗한 표면에 내려놓고 새로 형성된 얼음을 만지지 않도록 주의하고 -20°C에서 최소 20분 동안 보관하십시오.

4. 부동액 단백질 바인딩 얼음 비행기의 시각화

  1. 형광의 시각화는 어두운 냉동고 또는 콜드 룸에서 수행되며, 파장 특정 흥분 필터가있는 램프 아래에 얼음 결정 평면 면을 배치하여 다른 비특이적 인 빛을 차단합니다. 패턴에 따라, AfP에 의해 바인딩되는 얼음 비행기를 추정 할 수있다 (그림 4).
  2. 파장 특정 조명을 사용할 수 없는 경우 UV 라이트 박스를 대신 사용할 수 있습니다.
  3. 전통적인 얼음 등광은 얼음 반구가 적어도 3 시간 동안 -20 °C에서 승화할 수 있도록 함으로써 간단하게 수행 될 수 있으며, 그 후에 잔류 단백질 분말이 얼음 표면 (그림 5)에서볼 수 있습니다.
  4. 2.3단계는 완성된 얼음 반구의 -축의방향을 결정하기 위해 반복될 수 있다.

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Representative Results

단일 얼음 결정의 준비 및 장착은 오류가 가장 일반적으로 이루어지는 FIPA 절차의 두 단계입니다. 준비된 얼음 결정이 단일인지 여부를 결정하는 것은 프로토콜 섹션의 2.1 단계에서 설명된 대로 교차 폴라로이드(도 1D)를통해 이를 검사하여 수행된다. FIPA 분석에 다결정 얼음 결정이 사용되는 경우, 그 결과는 일관된 결합 패턴(도 6B)없이반구에 대한 AFP의 불연속 결합이 될 것이다. 얼음 결정 인터페이스가 AFP가 결합하는 얼음 비행기 주변에 있는 경우 최종 결과를 해석할 수 없습니다. 이러한 이유로, 얼음 결정은 신중하게 다음 단계로 이동하기 전에 특이성을 확인해야합니다. FIPA 분석에 대한 단일 얼음 결정이 있을 확률을 높이기 위해 여러 가지 동시에 만들어야 한다.

또 다른 일반적인 오류는 장착 하는 동안 차가운 손가락으로 크리스탈 면을 잘못 정렬 하는. 차가운 손가락에 수직으로 원차 또는 이차 프리즘얼굴을 장착하려면, 단일 얼음 결정은 먼저 얼음 피팅에 의해 지향되어야하며, 프로토콜 섹션의 2.3 단계에 설명된 바와 같이 별 모양의 에칭 (그림 2A 및 3)의방향에 따라 절단해야합니다. 얼음 결정이 잘못 정렬되면 최종 결과는 반구의 적도가 얼음 비행기의 대칭과 일치하지 않는 반구를 생성합니다 (그림 6C). 이것은 해석 가능한 결과이지만 반구의 가장 큰 둘레가 적도에 있기 때문에 올바르게 정렬 된 얼음 결정보다 덜 유익할 것입니다 (그림 4).

Figure 1
그림 1. 단일 얼음 결정의 성장 및 장착을 위한 장비. A) PVC 금형. B)PVC 금형에 에틸렌 글리콜 목욕에 팬. C)흰 화살로 표시된 에틸렌 글리콜의 흐름이 있는 차가운 손가락. 흰색 파선은 차가운 손가락의 내부 벽을 나타냅니다. D)단일 얼음 결정방향을 위한 교차 폴라로이드의 다이어그램. 광원은 노란색이고, 교차 된 폴라로이드는 회색이며 단일 얼음 크리스탈은 흰색입니다. 폴라로이드(회색 화살표)와 얼음 결정 방향(빨간색 화살표)의 방향이 표시됩니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 얼음 결정은 c-축이아래 폴라로이드에 수직, 45°에서 바닥 폴라로이드에 수직이 되고, 사고 광에 평행하게 된다. 교차된 폴라로이드와 얼음이 얼음 결정의 방향에 따라 상단 폴라로이드를 통해 어둡거나 밝거나 희미하게 여러 가지 색이 변하더라도 지나가는 빛. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. FIPA를 위한 얼음 결정 준비. A)육각형 대칭으로 얼음 에칭으로 축 방향을 결정합니다. 결정의 기저 평면은 페이지의 평면과 평행합니다. B)차가운 손가락에 단일 얼음 결정을 장착. C)반구로 형성 한 후 얼음. D)단백질 용액으로 채워진 반구컵에 침수된 얼음 반구. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 방향을 기반으로 얼음 결정을 장착합니다. A)(i) 기저 평면, (ii) 기본 프리즘 평면, (iii) 차가운 손가락에 수직이 되는 보조 프리즘 평면을 장착하는 다이어그램. 방향(ii)과 (iii)의 경우 그림과 같이 얼음 결정을 반으로 절단해야 합니다. B)(i) 기저 평면과 (ii) 차가운 손가락에 수직인 1차 프리즘 평면을 장착한 후 태평양 청색 표기 형 III nfeAFP8의 FIPA 결과. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. FIPA 분석 결과에서 AFP 바인딩 평면 해석. A)Ih 얼음의 바운드 평면의 표현; 및 B)단일 얼음 결정이 차가운 손가락에 수직으로 1차 프리즘 평면으로 장착될 때 해당 FIPA 분석 결과가 생성된다. 패널은 (i) 기저 평면, (ii) 기본 프리즘 평면, (iii) 보조 프리즘 평면, (iv) 피라미드 평면이 -축과 정렬되고(v) 피라미드 평면을 -축으로오프셋한다. C)피라미드 평면 i)를 결합하는 AFP의 용액에서 성장할 때 단일 얼음 결정의 형태학은 -축및 ii) -축에서오프셋된다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5. FIPA 대 전통적인 얼음 에칭의 비교. A)(i) 겨울가미(슈도플루네크 아메리카누스)에의해 생성된 타입 I AFP(HPLC6 isoform)의 전통적인 에칭은 원래 나이트 등(1991)에 의해 생성된 것으로 나타났다. (ii) TRITC로 표지된 동일한 단백질의 해당 FIPA 분석. B) (i) 4중 IBS 돌연변이체(V9Q/V19L/G20V/I41V) 타입 III nfeAFP11(일본 뱀장어 pout Zoarces elongatuskner)21. (ii) TRITC로 표지된 동일한 단백질의 해당 FIPA 분석. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6. 일반적인 FIPA 분석 오류로 인한 반구입니다. 분석은 GFP 태그형 III HPLC12-A16H에서 수행되었다. A)비교를 위한 최적의 FIPA 결과. 얼음 결정은 차가운 손가락에 수직으로 기본 프리즘 비행기로 장착되었다. B)FIPA 분석은 둘 이상의 결정으로 구성된 얼음 반구를 사용하여 실수로 수행되었다. C)잘못 정렬된 단일 얼음 결정에서 수행된 FIPA 분석. 보조 프리즘 비행기는 차가운 손가락에 정확히 수직으로 장착되지 않았습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7. FIPA 분석을 사용하여 다른 AFP의 얼음 바인딩 패턴을 비교합니다. 퍼시픽 블루 라벨 타입 III nfeAFP8은 TRITC 라벨 타입 I AFP와 결합되었고 단일 FIPA 분석이 수행되었다. A)III nfeAFP8 타입의 시각화만 가능합니다. B)I 형 I AFP의 시각화. C)타입 III nfeAFP8의 시각화 및 I AFP 타입을 함께 입력합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8. 적당히 활동적이고 활동적인 AFP의 FIPA. A)3개의 상이한 적당히 활동적인 물고기 AFP의 FIPA 분석; (i) TRITC 라벨 타입 I AFP (HPLC6 아이소폼, 슈도플라뉴트 아메리카누스),(ii) TRITC 라벨 형 II AFP(Ca2+-독립 동소폼, 롱스아웃 밀렵꾼), (iii) 태평양-블루 라벨형 III(nfeAFP8 아이소폼, 조아케스 롱나움). B)3개의 상이한 활동적인 AFP의 FIPA 분석; (i) GFP 태그 MpAFP_RIV(마리노모나스 원시)( ii) TRITC 라벨 sbwAFP(콜로스토누라 후미페라나),(iii) GFP 태그 TmAFP(테네리오 molitor). 모든 이미지에서 c-축은페이지의 평면에 수직입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9. FIPA 분석에 의해 생성된 형광 패턴의 관계와 다른 유형 III AFP 동소형 및 돌연변이체의 얼음 결정형태에 11,21. A) (i) GFP 태그 QAE-A16H의 FIPA 분석. (ii) QAE-A16H에 의해 생성된 얼음 결정 형태. B) (i) TRITC 라벨 nfeAFP11-V9Q의 FIPA 분석. (ii) nfeAFP11-V9Q에 의해 생성 된 얼음 결정 형태. C)(i) TRITC 라벨 야생형 nfeAFP11의 FIPA 분석. (ii) 야생형 nfeAFP11에 의해 생성된 얼음 결정 형태. D)(i) TRITC 라벨 야생 형 nfeAFP6의 FIPA 분석. (ii) 야생형 nfeAFP6에 의해 생성된 얼음 결정 형태. C축방향 및 축 막대는 표시된 대로 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

AFP 바인딩 아이스 비행기의 결정에 대한 찰스 나이트에 의해 얼음 에칭 방법의 개발은 크게 AFP에 의해 얼음 바인딩의 메커니즘에 대한 연구를 고급. Afp의 구조는 X 선 결정학26,27에 의해 해결 될 수있는 반면 AFP가 결합하는 얼음에 보완 표면을 추론하는 명백한 방법은 없었다. 겨울 가자미에서 I 타입 I AFP가 처음에 특징지어졌을 때, 얼음28의주요 프리즘 비행기에 결합하는 것이 가설이 되었다. 그러나, 기사의 획기적인 얼음 에칭 실험 I AFP 유형의 그들은 얼음의 피라미드 비행기에 바인딩 하는 것으로 나타났다13. 이 결과 AFP 연구 커뮤니티는 AFP 얼음 결합 메커니즘을 재고하고 AFP9의얼음 바인딩 면을 보다 정확하게 결정하도록 자극했습니다. 기사의 원래 얼음 에칭 실험은 AFP 생산 유기체에서 정제 된 네이티브 AfP를 사용하여 수행되었다. 재조합 AfP의 개발과 GFP 태그의 사용증가로, 다른 많은Afp29로이러한 연구를 확장 할 수있는 기회가 있었다.

테트라메틸lrhodamine-5-(및 6)-이소티오야네이트(TRITC)와 같은 공유형 형광 단백질 염료를 분석에 통합하는 아이디어는 GFP-융합 AFP FIPA 분석11의성공 후에만 나왔다. 키메라 형광 단백질 태그 및 covalent 염료에 의한 화학적 변형은 AFP(도 5)의얼음 결합 패턴에 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다. 이전과 함께 GFP는 종종 IBS에서 잘 제거되는 AfP의 N 또는 C 단말 단말 중 하나에 융합됩니다. 또한 GFP와 AFP 사이에 유연한 링커를 삽입하여 태그를 얼음 표면에서 밀어내도록 할 수 있습니다. 후자의 라벨링 전략으로, 공유 염료와 반응하는 충전된 측면 체인은 일반적으로 IBS에서 멀리 표면에 있습니다. 형광 라벨에 대한 여기에 제시 된 전략이 작동하지 않는 경우, 티올 반응 염료와의 반응을 위해 IBS에서 멀리 시스테인의 도입은 또 다른옵션30입니다. 열 히스테리시스 활동과 얼음 결정 형태에 의해 판단된 형광 라벨이 AFP 얼음 바인딩에 영향을 미치지 않도록 하는 조치를 취함으로써, 우리는 FIPA 분석이 원래의 얼음 에칭 방법에서와 마찬가지로 AFP 얼음 결합 패턴의 진정한 표현을 보여준다고 확신합니다.

FIPA 분석을 위해 AFP를 형광으로 라벨링하는 데는 몇 가지 이점이 있습니다. AFP 바인딩 비행기의 시각화를 위한 얼음의 승화가 필요하지 않기 때문에 절차에 필요한 시간보다 적습니다. 반구에 표지된 단백질의 편입은 실험 완성을 평가하기 위해 얼음의 성장 중에 모니터링될 수 있으며 AFP 결합 패턴은 어느 시점에서든 기록될 수 있다. 이것은 불필요하게 긴 실험, 또는 얼음 성장의 조기 완성을 방지할 수 있습니다. 형광 라벨링은 I 형 및 유형 III AFP (그림 5)에적용 된 두 가지 방법모두에서 결과의 비교에서 볼 수 있듯이 에칭으로 이전에 가능한 것보다 더 명확한 AFP 결합 패턴 시각화를 허용합니다. 그러나 FIPA 이후의 얼음 에칭은 몇 시간 동안 반구를 냉동실에 배치하여 쉽게 수행될 수 있으며, 이는 두 방법 모두에 대해 유사한 AFP 농도가 필요하기 때문에 두 분석 모두 동일한 샘플에서 수행될 수 있음을 의미합니다. FIPA의 귀중한 장점은 동일한 얼음 반구에서 하나 이상의 서로 다른 레이블이 붙은 AFP를 시각화할 수 있다는 것입니다(그림 7). 이는 AFP 유형, 동소형 및 활동 돌연변이체로 보이는 AFP 얼음 바인딩 평면의 차이를 설명하는 데 유용합니다.

FIPA 분석은 이미 여러 AFP 연구에서 사용되었습니다. 기저 평면 바인딩이 활동적인 AFP에 고유하고 높은활동(18)에필요하다는 가설을 뒷받침하는 데 사용되었습니다. 적당히 활동적인 AfP는 기저 평면(그림 8A)을 묶지 않는 것으로 나타났지만, 많은 활동적인 AFP가 얼음 반구를 완전히 덮는 것으로 나타났으며, 얼음기(그림 8B)5,20,31을포함한다. FIPA 분석은 또한 특정 얼음 결합 잔류물의 기능을 연구하기 위하여 이용되었습니다. 예를 들어, FIPA 분석은 여러 유형 III 등산화 및 돌연변이에 대해 수행되었으며, 그 중 일부는 얼음 성장을 방지하고 그 중 일부는 얼음11,21,32를형성하는 것으로 나타났습니다. 연구에서, 특정 잔류물은 얼음에 AFP를 통합하는 데 중요하며 다른 사람들은 얼음 비행기 특이성에서 중요하다는 것을 발견했습니다 (그림 9).

단일 얼음 결정에 AFP 결합 패턴을 연구하기위한 다른 방법은 형광 현미경검사법 16,33 및 미세 유체(34)에의해 직접 관찰을 포함한다. 이러한 방법은 AFP가 얼음과 얼음을 형성하는 동시성에 대한 얼음 형성 시뮬레이션을 얼음에 부착하는 데 민감성을 가지고 있지만, 얼음 비행기와의 친화성을 결정하는 FIPA 방법에 비해 견고하지 않다는 장점이 있습니다. 분자 역학은 또한 AfP12,20,21,30,35의얼음 평면 결합 특이성을 예측하는 데 사용된다. FIPA 분석을 사용하여 각 AFP의 얼음 평면 바인딩 패턴, 얼음 비행기 선택에 대한 IBS 구성의 중요성, 특정 비행기의 바인딩이 AFP 활동과 어떻게 관련이 있는지 를 배우고 있습니다.

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Disclosures

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Acknowledgments

PLD는 단백질 공학에서 캐나다 연구 위원장을 보유하고 있습니다. 이 작품은 PLD에 건강 연구의 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다. 이 연구는 또한 일본 과학진흥협회(JSPS)(제23310171호)와 일본 바이오 중심기술연구진흥기관(BRAIN)의 과학연구를 위한 보조금 지원에도 의해 지원되었습니다. 우리는 FIPA로 이어진 선구적인 작업에 대한 박사 크리스 마샬과 마이크 쿠이퍼에 감사드립니다. 우리는 또한 이 사업의 일부에 대한 시설을 제공하고 형광 광 여기 및 방출 필터를 설정한 로리 그레이엄 박사님께 도리어 사카에 츠다 박사님께 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

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References

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형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정
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Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

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