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Chemistry

通过荧光基冰平面亲和力确定防冻蛋白的冰结合平面

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

防冻蛋白 （AFP） 与特定的冰平面结合，以防止或减缓冰的生长。基于荧光的冰平面亲和力 （FIPA） 分析是对确定 AFP 绑定冰平面的原始冰蚀刻方法的修改。AFP 采用荧光标记，并融入宏观单一冰晶中，并在紫外线下可视化。

Abstract

防冻蛋白 （AFP） 表现在各种冷硬生物体中，以防止或减缓内部冰的生长。AFP 通过冰结合表面与特定的冰平面结合。基于荧光的冰平面亲和力 （FIPA） 分析是一种用于确定 AFP 与之结合的冰平面的修改技术。FIPA 基于确定法新社绑定冰平面的原始冰蚀方法。它在缩短的实验时间内产生更清晰的图像。在 FIPA 分析中，AFP 被荧光标记为有幻想标记或共价染料，然后慢慢融入宏观单一冰晶中，该晶体已预制成半球，并定向以确定 a 轴 和 c 轴。法新社的冰半球在紫外线下被成像，使用过滤器来阻挡非特异性光，以可视化法新社的平面。AFP 的荧光标签允许实时监控 AFP 吸附到冰中。已发现这些标签不会影响 AFP 绑定的平面。FIPA 分析还引入了将多个不同标签的 AFP 绑在同一个单一冰晶上的选项，以帮助区分其绑定平面。FIPA的这些应用有助于增进我们对AFP如何与冰结合以阻止其生长的理解，以及为什么许多产生AFF的生物会表达多种AFP等形。

Introduction

抗冻蛋白（AFPs）的产生是生活在冰层中环境中的一些生物体的重要生存机制。直到最近，人们还认为AFP的唯一功能是防止或减缓内部冰晶的生长，这些冰晶会阻断循环，造成组织损伤和渗透应激。不能容忍任何程度的冰冻的生物，如鱼，表达AFP，以完全抑制冰晶生长1。其他，如草，是耐冻和表达AFP，以抑制冰的再封装，减少形成大冰晶在他们的组织2。在低温下稳定膜是另一个功能，建议为AFP3。最近，一个新的角色被建议为法新社的南极细菌， 马里诺莫纳斯原始，从冰覆盖的咸水湖4。这个AFP是一个更大的粘合蛋白5的一部分，被认为是附加细菌到冰上，以更好地获得氧气和营养物质6。其他微生物已知分泌AFP，这可能改变它们生活7的冰的结构。

在一些鱼类、昆虫、植物、藻类、细菌、硅藻和真菌中发现了AFP。它们具有显著不同的序列和结构，与不同祖先在不同场合的进化相一致：然而，它们都与冰结合，并通过吸附抑制机制8抑制其生长。AFP各有一个特定的表面，作为其冰结合点（IBS）。这些通常通过9-11表面残留物的现场定向突变来识别。IBS 假设将水分子排列在与特定冰平面相匹配的冰样图案中。因此，法新社形成其配体之前，绑定到它5，12。冰飞机可以通过米勒指数来定义，不同的AFP可以与不同的平面结合。因此，I型法新社从冬季比目鱼绑定到20-21金字塔平面13，III型法新社结合主棱镜和金字塔平面使用复合冰结合表面11，14，而云杉芽虫法新社，一个过度活跃的法新社，同时结合到主平面和基底平面15，16。其他过度活跃的AFP，如 MpAFP，与多个冰平面结合，如它们对单个冰晶半球5，17的完全覆盖所示。据推测，超活性AFP结合基底平面和其他飞机的能力，可能占其活性的10倍，比适度活跃的AFP18。虽然超活性AFP的效率是有据可查的，但它们与多个冰层结合的能力仍然不为人所知。

确定法新社飞往冰上飞机的最初方法是由查尔斯·奈特13，19开发的。在这种方法中，一个宏观的单一冰晶被安装在一个空心金属棒（冷手指）上，通过将其浸入装满脱气水的半球杯中形成半球。然后，半球被淹没在AFP的稀释溶液中，在几个小时内，由通过冷手指循环的乙二醇温度控制，从法新社溶液中长出一层冰到冰晶半球。冰晶从溶液中取出，从冷手指上分离出来，放置在-10至-15°C的冰柜室中。表面用锋利的刀片刮去防冻蛋白溶液的冷冻表面薄膜，冰晶允许升华至少3小时。升华后，由AFP绑定的冰平面可视为从残余蛋白质中提取的白色蚀刻图案。冰半球可以定向到其 c轴和 斧头，定位冰的基础平面和棱镜平面，并确定蚀刻补丁的米勒指数。

在这里，我们描述了对确定法新社绑定冰平面的原始方法的修改，我们称之为荧光基冰平面亲和力（FIPA）11。AFP 的荧光标记要么带有钟音标签，如绿色荧光蛋白 （GFP）11，16，17，20，要么与荧光染料共价绑定到 AFP5，21。荧光标记的AFP被吸收到一个冰晶中，并且使用与原始冰蚀实验相同的实验程序过度生长。在整个实验中，可以使用紫外线（UV）灯监测与生长的冰半球结合的AFP的程度。实验完成后，半球可以直接从冷手指上取下并成像，无需升华。然而，如果需要，半球可以留给升华，以可视化传统的冰蚀刻。对FIPA方法的修改将传统的冰蚀协议缩短了几个小时。此外，还有可能同时成像几个具有不同荧光标签的 AFP，以可视化 AFP 绑定冰平面的重叠模式。

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Protocol

1. 生长单一冰晶

  1. 拿一个干净的金属锅（直径15厘米，高4.5厘米），适合，可以漂浮在乙烯乙二醇冷却浴。
  2. 准备聚氯乙烯 （PVC） 圆柱形模具，直径 4.5 厘米，高 3-4 厘米，厚 4 毫米），从管道锯断面。
    1. 一侧切一个档次（1毫米宽，2毫米高）（图1A）。
    2. 准备尽可能多的模具，可以舒适地放入锅（图1B）。
      注：一项研究表明，聚乙烯醇（PVA）可以影响冰核22。然而，在我们的开放模具PVC系统中，我们没有遇到非典型冰层的问题。
  3. 将真空润滑脂的光膜涂在每个模具的底部表面环上，即切出缺口的表面。将这个涂有油脂的凹面密封在金属平底锅上，凹槽定位于远离平底锅中心的地方。小心不要用油脂填充或阻塞凹槽。
  4. 将 0.22 μm 过滤和脱气/除离子水添加到锅的中心，但在模具之外，并允许水通过凹槽慢慢进入模具。小心不要引入任何泡沫。水层应约5毫米深。
  5. 将平底锅放入温度控制的乙二醇浴池中，冷却至-0.5 °C。 平底锅应该是完全水平的。如有必要，在平底锅两侧添加压载重量。
  6. 锅和水达到 -0.5 °C 后，在锅中间和模具外加入一小块冰。
    1. 这将核化冰在超冷水中的生长，穿过锅和模具。每个模具底部的小缺口只能通过一个冰晶传播，导致每个模具中只有一个冰晶。
    2. 隔夜孵化形成一层冰。
  7. 在接下来的三天里，每天向每个模具添加 13 毫升 4 °C 的脱气/除离子水，并在每增加一天后将乙二醇浴池的温度降至 -0.8 °C，第二天降至 -1.1 °C，第三天降至 -1.5 °C。
    1. 在那些温度下孵化过夜。
    2. 到第四天，模具应该完全装满冰。
  8. 将模具从平底锅中拉下来，将冰晶从模具中推出，并存放在干净的表面（如称重船）中，在 -20 °C 冰柜中存放约 1 小时，然后再处理。
  9. 与其准备许多小的单一冰晶，一个体积几升的大单冰晶可以在一个恒温孵化器中准备，正如骑士23所描述的。如果将大冰晶保存在 -15 至 -20 °C 的冰柜中，则可储存一年或更长期。单晶部分可根据需要用锯从冰块上切开。

2. 确定冰晶的奇点和方向

  1. 通过在冰柜室中观察两个交叉的极性（图1D）来确定从模具中排出的冰是否是单个晶体。
    1. 如果冰晶是单一的，则不应看到任何裂缝或不连续性，冰晶内的光向不应发生变化。
      注意：如果没有冰柜室，可以在所有需要的步骤中使用冷室，谨慎地快速工作并谨慎处理冰。
  2. 由于冰的裂口，可以同时确定 c轴的方向。使用以下信息确定方向：
    1. 当 c轴与事件光完全平行时，理论上，没有光会穿过交叉的极性。如果事件光的标题与 c轴平行，则当光在交叉极性之间旋转时，均匀的多色光谱通过晶体传输。这种均匀的发射产生于冰Ih沿其 c轴24的光学不活动。冰晶的基底平面对 c轴是正常的。
    2. 当 c轴与事件光进一步平行，冰晶在交叉极性之间旋转时，传输的光将每旋转 90°，传输的光将交替 0-100% 传输。
    3. 最常见的情况是 ，c轴对圆柱形冰晶的圆形平面是正常的。
  3. 通过将冰晶紧紧包裹在铝箔中，用针头将一个小孔戳入基底平面上的冰（对c轴正常），并将其置于真空中 20 分钟，从而确定 a 轴的方向。
    1. 这种治疗将在基底平面上产生六边形对称性的蚀刻，其中A轴穿过六面星的顶点（图2A）。
    2. 如果需要，冰晶可以用锯子平行或垂直于六边形的一侧切割，分别用垂直于冷手指的主棱镜或次要棱镜平面安装它（图3）。

3. 将荧光标签防冻蛋白吸附到单一冰晶中

  1. 将单个冰晶安装到冷手指 上（图1C），首先将一个腔钻进水晶顶部。为此，用两根直径稍异但与冷指直径相似的铝棒交替融化冰层，形成冷手指可以容纳的腔。
  2. 将冷手指冷却至-0.5 °C，放在冰腔中，并将冰晶保持原位，直到它冻结到金属（图2B）。将晶体连接到手指时避免气泡，因为它们会阻碍热量从手指到棒的有效传输。
  3. 用过滤过的除离子水或缓冲器填充一个直径约为冰晶两倍的半球杯，冷却至约 4 °C。 将冰块冰晶浸入杯中，去除多余的水或缓冲液，使冰晶顶部与液层大致水平，冰不会接触杯壁。
    1. 用绝缘材料盖住杯子，将温度降低到-5°C。
    2. 等待大约1小时，冰晶形成一个半球，检查其状态大约每20分钟（图2C）。
    3. 冰会通过融化和生长冰晶来形成半球杯的形状，但触摸杯壁绝不应过度生长。墙壁和半球之间至少应该有1厘米的缝隙，冷手指不应该从冰上伸出来。
  4. 从冰晶中取出杯子，将荧光蛋白溶液加入最终体积为 25-30 毫升，并达到所需的分析浓度，小心保持杯中液体总体积不变。典型的 AFP 浓度为 0.1 毫克/毫升。
    1. 将冰晶重新注入杯中，使冰晶顶部与液体处于水平，冰晶不会接触杯壁（图2D）。
    2. 将冷手指温度降至 -8 °C，让蛋白质溶液冻结到冰晶中 2-3 小时，经常搅拌溶液。蛋白质溶液形成的冰在阻止冰生长之前应至少为5毫米。
  5. 从杯子中取出冰晶，同时仍然附着在冷手指上。通过将冷却剂通过冷手指加热到略高于 0 °C，将冰从后者分离，并等待冰晶融化。
  6. 将水晶平坦的一面放在干净的表面上，如称重盘，小心不要触摸新形成的冰，在交接前至少存放在-20°C。

4. 防冻蛋白冰平面的可视化

  1. 荧光的可视化是在较暗的冰柜或冷室进行的，通过将冰晶平坦的一面放在带有波长特定激发滤光片的灯下，以激发荧光标签和相机发射过滤器以阻止任何其他非特定光。根据图案，可以估计受AFP约束的冰平面（图4）。
  2. 如果没有波长特定的灯，则可以使用紫外线灯箱。
  3. 传统的冰蚀刻也可以简单地通过允许冰半球在-20°C升华至少3小时，之后残留蛋白粉可能会在冰面上可见（图5）。
  4. 可以重复第 2.3 步，以确定完成的冰半球 的斧头的方向。

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Representative Results

单个冰晶的准备和安装是 FIPA 程序的两个步骤，其中最常出错。确定准备好的冰晶是否为单一的，通过交叉极性体（图1D）检查它，如协议部分的第2.1步所概述。如果用于 FIPA 分析的多晶冰晶，则结果将是非晶体在半球的不连续绑定，而没有连贯的结合模式 （图 6B）。如果冰晶接口位于法新社绑定的冰层周围，最终结果可能无法解释。因此，在进入下一步之前，应仔细检查冰晶的奇点。为了增加单个冰晶用于FIPA分析的概率，应同时进行几个。

另一个常见的错误是在安装过程中将水晶面与冷手指错误地对齐。要安装垂直于冷指的主或次要棱镜面，单个冰晶必须首先以冰坑为导向，然后根据协议部分第 2.3 步中概述的星形蚀刻（图 2A和3）的方向进行切割。如果冰晶安装不对齐，最终结果将产生一个半球，其中半球赤道与冰平面的对称性不一致（图6C）。虽然这是一个可解释的结果，但它的信息量将不如正确对齐的冰晶，因为半球最大的周长在赤道（图4）。

Figure 1
图1。用于种植和安装单个冰晶的设备。A）PVC模具。 B） 潘在乙烯乙二醇浴与PVC模具。 C） 白色箭头显示的乙烯乙二醇流动的冷手指。白色的虚线表示冷手指的内壁。 D） 用于定位单个冰晶的交叉极性图。光源为黄色，交叉极性为灰色，单个冰晶为白色。指示极性（灰色箭头）和冰晶方向（红色箭头）的方向。从左到右，冰晶的定向使 c轴垂直于底部极性，45° 到底部极性，并平行于事件光。穿过交叉的极性极性和冰的光线会显示暗，光，或淡淡的多色通过顶部极性取决于冰晶的方向。 单击此处查看更大的图像。

Figure 2
图2。为 FIPA 准备冰晶。A） 用六角对称性用冰蚀刻确定轴的方向。水晶的基底平面与页面平面平行。 B） 将单个冰晶安装到冰冷的手指上。 C） 形成半球后的冰。 D） 冰半球淹没在装满蛋白质溶液的半球杯中。 单击此处查看更大的图像。

Figure 3
图3。基于方向安装冰晶。A） 与 （i） 基底平面一起安装冰的图表，（ii） 主棱镜平面，（iii） 与冷手指垂直的次要棱镜平面图。对于方向（ii）和（iii），冰晶必须切成两半，如图所示。 B） 太平洋蓝色标签 III 型 nfeAFP8 的 FIPA 结果，在安装冰晶后，与 （i） 基底平面和 （ii） 与冷手指垂直的主要棱镜平面。 单击此处查看更大的图像。

Figure 4
图4。从 FIPA 分析结果中解释法新社的飞机。A）冰的 绑定平面的表示：和 B） 当单个冰晶与与冷指垂直的主棱镜平面上安装时，相应的 FIPA 分析结果。面板表示 （i） 基底平面、（ii） 主棱镜平面、（iii） 次要棱镜平面、（iv） 金字塔平面与斧头对齐，（v） 金字塔平面与斧头对齐。 C） 单个冰晶的形态学，当生长在将金字塔平面 i） 与 斧头对齐的 AFP 溶液中时，与斧头对齐，ii） 从斧 头中抵消。 单击此处查看更大的图像。

Figure 5
图5。传统冰蚀与 FIPA 的比较。A） （i） 冬季比目鱼（伪美国）产生的I型法新社（HPLC6等形）的传统蚀刻显示为奈特等人最初制作的（1991年）。（二） 对与TRITC标记的同一蛋白质进行相应的FIPA分析。B） （i） 四 IBS 突变体（V9Q/V19L/G20V/I41V） 三型 nfeAFP11（来自日本鳗鱼嘴佐尔塞斯 elongatuskner）21的传统蚀刻。（二） 对与TRITC标记的同一蛋白质进行相应的FIPA分析。单击此处查看更大的图像。

Figure 6
图6。常见的 FIPA 分析错误导致的半球。 对GFP标记的III型HPLC12-A16H进行了分析。 A） 用于比较的最佳 FIPA 结果。冰晶与冷手指垂直的主要棱镜平面一起安装。 B） FIPA分析是无意中使用一个由多个晶体组成的冰半球进行的。 C） 对一个不对齐的单个冰晶进行的 FIPA 分析。次要棱镜平面没有完全垂直于冷手指。 单击此处查看更大的图像。

Figure 7
图7。使用 FIPA 分析来比较不同 AFP 的冰结合模式。 太平洋蓝色标签 III 型 nfeAFP8 与 TRITC 标记的 I 型 AFP 相结合，并进行了单一的 FIPA 分析。 A） 仅可视化 III 型 nfeafp8。 B） 仅可视化 I 型 AFP。 C） 可视化 III 型 nfeafp8 和 I 型 AFP 在一起。 单击此处查看更大的图像。

Figure 8
图8。适度活跃和过度活跃的自动对焦的 FIPA。A） 对三种不同中度活性鱼类AFP的FIPA分析：（一） TRITC 标记的 I 型 AFP （HPLC6 等形，伪美国）， （ii） TRITC 标记的 II 型 AFP （Ca2 +独立等形体，朗斯努特偷猎者），（iii） 太平洋蓝色标记 III 型法新社 （nfeAFP8 等形形式，佐尔塞斯 elongatuskner）.B） 对三种不同超活性AFP的FIPA分析：（一） GFP 标记的MpAFP_RIV （马里诺莫纳斯原始），（ii） 特里克标记的 sbwafp （乔里斯通鲁拉富米费拉纳）， （iii） GFP 标记Tm法新社 （特内布里奥莫利托） 。在所有图像中，c 轴垂直于页面的平面。单击此处查看更大的图像。

Figure 9
图9。FIPA分析产生的荧光模式与不同III类AFP等形体和突变体的冰晶形态的关系11，21。A） （一） 对 GFP 标记的 QAE-A16H 的 FIPA 分析。（二） QAE-A16H产生的冰晶形态。 B） （i） 对 TRITC 标记的 nfeafp11-V9Q 的 FIPA 分析。（二） 由 nfeAFP11-V9Q 产生的冰晶形态。C） （i） 对 TRITC 标记的野生类型 nfeAFP11 的 FIPA 分析。（二） 野生型 nfeAFP11 产生的冰晶形态。 D） （i） 对 TRITC 标记的野生类型 nfeAFP6 的 FIPA 分析。（二） 野生型 nfeAFP6 产生的冰晶形态。C轴方向和比例栏如所示。 单击此处查看更大的图像。

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Discussion

查尔斯·奈特研制的冰蚀方法，用于确定法新社的冰平面，大大推进了对AFP冰结合机理的研究。虽然AFP的结构可以通过X射线晶体学26，27 来解决，但没有明显的方法来推断AFP绑定在冰上的互补表面。当I型法新社从冬季比目鱼的最初特征，它被假设绑定到冰28的主要棱镜平面。然而，奈特的破冰实验I型法新社显示，他们与冰13金字塔平面结合。这一结果促使法新社研究界重新思考法新社冰结合机制，更准确地确定AFP9的冰结合面。奈特最初的冰蚀实验是使用从法新社产生的生物体中纯化的本地AFP完成的。随着重组 AFP 的发展和 GFP 标签的日益使用，有机会将这些研究扩展到许多其他 AFP29。

将共价荧光蛋白染料，如四甲基霍胺-5-（和6）异氰酸酯（TRITC）纳入分析的想法，是在GFP融合的法新社FIPA分析11成功之后才得出的。已观察到奇美荧光蛋白标签和共价染料的化学修饰，不会影响AFP的冰结合模式（图5）。与前者一起，GFP 融合到 AFP 的 N 端或 C 端端，这些端通常从 IBS 中删除得很好。此外，GFP 和 AFP 之间还插入了一个灵活的链接器，允许将标签从冰面上推开。通过后一种标签策略，与共价染料有反应的带电侧链通常在远离 IBS 的表面上。如果此处提出的荧光标签 AFP 的策略不起作用，则从 IBS 中引入一种半胱氨酸，用于对硫反应染料做出反应则是另一种选择30。通过采取措施确保荧光标签不影响法新社的冰结合，从热滞后活动和冰晶形态判断，我们相信，FIPA分析显示了法新社冰结合模式的真实表现，就像它在原来的冰蚀刻方法中所做的那样。

荧光标记 AFP 用于 FIPA 分析有几个好处。由于不需要将冰升华用于法新社飞机的可视化，手术所需的时间更少。在冰层生长期间，可以监测标记蛋白质在半球的结合情况，以评估实验完成情况，并随时记录 AFP 结合模式。这可以防止不必要的长时间实验，或过早完成冰的生长。荧光标签允许比以前更清晰的 AFP 绑定模式可视化蚀刻，这从应用于 I 型和第三类 AFP （图 5）的两种方法的结果的比较中可见一斑。然而，将半球放入冰柜中数小时，可以很容易地进行FIPA后的冰蚀，这意味着两种分析都可以在同一样本上进行，因为这两种方法都需要类似的AFP浓度。FIPA的一个宝贵优势是能够在同一冰半球（图7）上可视化多个不同标签的法新社。这对于说明具有不同 AFP 类型、等形体和活动突变体的 AFP 冰绑平面的差异很有用。

FIPA分析已经用于法新社的几项研究。它被用来支持基底平面结合是超活性AFP所独有的，是其高活性18所必需的假说。中等活跃的AFP被发现不绑定基底平面（图8A），但许多超活性AFP完全覆盖冰半球，包括冰基平面（图8B）5，20，31。FIPA分析还用于研究特定冰结合残留物的功能。例如，FIPA对几种III型等形体和突变体进行了分析，其中一些可以防止冰的生长，有些只发现形成冰11，21，32。研究发现，特定残留物在将AFP纳入冰中中非常重要，而其他残留物在冰平面特异性中也很重要（图9）。

研究单个冰晶上 AFP 结合模式的其他方法包括荧光显微镜16，33 和微流体34的直接观测。这些方法具有对法新社附着在冰上的动态敏感性以及监测冰形成与法新社与冰的亲和力的同步性的优势，但与FIPA方法相比，在确定与冰平面的亲和力方面则不那么坚固。分子动力学也被用来预测AFP12，20，21，30，35的冰平面结合特异性。利用 FIPA 分析以及其他可用技术，我们正在学习每个 AFP 的冰平面结合模式、IBS 在选择冰平面中的重要性，以及特定平面的结合与 AFP 活动的关系。

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Disclosures

未声明任何利益冲突。

Acknowledgments

PLD担任加拿大蛋白质工程研究主席。这项工作由加拿大卫生研究所向民盟提供的赠款资助。这项工作还得到了日本科学促进协会（JSPS）和日本生物导向技术研究促进机构（BRAIN）的科学研究资助。我们感谢克里斯·马歇尔博士和迈克·奎珀博士开创性的工作，导致FIPA。我们还感谢萨凯·齐达博士为这项工作提供设施，并感谢劳里·格雷厄姆博士为荧光灯激发和排放过滤器的建立提供便利。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

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References

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化学，第83期，材料，生命科学，光学，防冻蛋白，冰吸附，荧光标签，冰晶格平面，冰结合蛋白，单冰晶体
通过荧光基冰平面亲和力确定防冻蛋白的冰结合平面
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Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

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