Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Bestemme isbindende fly av frostvæskeproteiner ved fluorescensbasert isplanaffinitet

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Frostvæskeproteiner (AFPer) binder seg til bestemte isplan for å forhindre eller bremse isveksten. Fluorescensbasert isplanaffinitet (FIPA) analyse er en modifikasjon av den opprinnelige isetsingsmetoden for bestemmelse av AFP-bundet isplan. AFPer er fluorescerende merket, innlemmet i makroskopiske enkeltiskrystaller og visualisert under UV-lys.

Abstract

Frostvæskeproteiner (AFPer) uttrykkes i en rekke kaldharde organismer for å forhindre eller bremse intern isvekst. AFPer binder seg til spesifikke isplan gjennom sine isbindingsflater. Fluorescensbasert isplanaffinitet (FIPA) analyse er en modifisert teknikk som brukes til å bestemme isplanene som AFPene binder seg til. FIPA er basert på den opprinnelige isetsingsmetoden for å bestemme AFP-bundet isplan. Det gir klarere bilder i en forkortet eksperimentell tid. I FIPA-analyse er AFPer fluorescerende merket med en chimerisk tag eller et kovalent fargestoff som deretter sakte innlemmes i en makroskopisk enkeltiskrystall, som har blitt formet til en halvkule og orientert for å bestemme a- og c-aksene. Den AFP-bundne ishalvøya er avbildet under UV-lys for å visualisere AFP-bundne plan ved hjelp av filtre for å blokkere ikke-spesifikt lys. Fluorescerende merking av AFP-ene gjør det mulig å overvåke AFP-adsorpsjon i sanntid i is. Etikettene har vist seg å ikke påvirke flyene som AFPer binder seg til. FIPA-analyse introduserer også muligheten til å binde mer enn en annen merket AFP på samme enkelt iskrystall for å bidra til å differensiere bindingsplanene deres. Disse bruksområdene til FIPA bidrar til å fremme vår forståelse av hvordan AFPer binder seg til is for å stoppe veksten og hvorfor mange AFP-produserende organismer uttrykker flere AFP-isoformer.

Introduction

Produksjon av frostvæskeproteiner (AFPer) er en viktig overlevelsesmekanisme for noen organismer som lever i isbelastede miljøer. Inntil nylig ble det antatt at AFPs eneste funksjon var å forhindre eller bremse veksten av indre iskrystaller som ville blokkere sirkulasjon, forårsake vevsskade og osmotisk stress. Organismer som ikke tåler noen grad av frysing, for eksempel fisk, uttrykker AFPer for å fullstendig hemme iskrystallvekst1. Andre, som gress, er frysetolerante og uttrykker AFPer for å hemme isrekrystallisering som reduserer dannelsen av store iskrystaller i vevet2. Stabilisering av membraner ved lav temperatur er enda en funksjon som ble foreslått for AFP-ene3. Nylig ble det foreslått en ny rolle for AFP av en antarktisk bakterie, Marinomonas primoryensis, fra isdekkede brakvann4. Denne AFP er en del av en mye større adhesin protein5 som antas å feste bakterien til is for bedre tilgang til oksygen og næringsstoffer6. Andre mikrober er kjent for å utskille AFPer, noe som kan endre isstrukturen der de bor7.

AFPer har blitt funnet i noen fisk, insekter, planter, alger, bakterier, diatomer og sopp. De har bemerkelsesverdig avvikende sekvenser og strukturer i samsvar med deres utvikling fra forskjellige forfedre ved ulike anledninger; og likevel binder de seg alle til is og hemmer veksten av adsorpsjonshemmingsmekanismen8. AFP-ene har hver en bestemt overflate som fungerer som sitt isbindende sted (IBS). Disse har vanligvis blitt identifisert ved stedsstyrt mutagenese av overflaterester9-11. IBS er hypoteset om å arrangere vannmolekyler i et islignende mønster som samsvarer med spesifikke isplan. Dermed danner AFP sin ligand før binding til den5, 12. Isfly kan defineres av Miller-indeksene sine, og forskjellige AFPer kan binde seg til forskjellige fly. Dermed binder type I AFP fra vinterflunder til 20-21 pyramidale fly13, type III AFP binder både primært prisme og pyramidale fly ved hjelp av en sammensatt isbindende overflate11,14, mens gran budworm AFP, en hyperaktiv AFP, binder seg samtidig til både primære og basale fly15,16. Andre hyperaktive AFPer, som MpAFP, binder seg til flere isplan som vist ved deres fullstendige dekning av enkeltiskrystallhalvdeler5,17. Det er hypoteset, at evnen til hyperaktive AFPer til å binde basalplanet, så vel som andre fly, kan utgjøre deres 10 ganger høyere aktivitet over moderat aktive AFPer18. Selv om effektiviteten til hyperaktive AFPer er godt dokumentert, er deres evne til å binde seg til flere isfly fortsatt ikke forstått.

Den opprinnelige metoden for å bestemme AFP-bundet isfly ble utviklet av Charles Knight13,19. I denne metoden er en makroskopisk enkelt iskrystall montert på en hul metallstang (kald finger) og dannet til en halvkule ved å senke den ned i en halvkuleformet kopp fylt med avgasset vann. Deretter senkes halvkulen ned i en fortynnet løsning av AFPer, og et lag med is dyrkes fra AFP-løsningen på iskrystallhalvøya over flere timer styrt av temperaturen på etylenglykolen som sirkulerer gjennom den kalde fingeren. Iskrystallen fjernes fra løsningen, løsnes fra den kalde fingeren og plasseres i et -10 til -15 °C fryserom. Overflaten skrapes med et skarpt blad for å fjerne den frosne overflatefilmen av frostvæskeproteinoppløsning, og iskrystallen får lov til å sublimere i minst 3 timer. Etter sublimering kan isplanene bundet av AFPer ses på som hvite etsede mønstre avledet fra restprotein. Ishalvøya kan orienteres mot sin c-akseog a-akser, for å lokalisere basal- og prismeplanene til is, og bestemme Miller-indeksene til de etsede flekkene.

Her beskriver vi en modifikasjon av den opprinnelige metoden for å bestemme AFP-bundne isplan, en metode vi refererer til som fluorescensbasert isplanaffinitet (FIPA)11. AFP-ene er fluorescerende merket med enten en chimerisk tag, for eksempel grønt fluorescerende protein (GFP)11,16,17,20, eller med et fluorescerende fargestoff som er kovalent bundet til AFP5,21. De fluorescerende merkede AFP-ene adsorbert til en enkelt iskrystall og overgrodd ved hjelp av samme eksperimentelle prosedyre som de originale isetsingsforsøkene. Omfanget av AFP-binding til den voksende ishalvøya kan overvåkes gjennom hele eksperimentet ved hjelp av en ultrafiolett (UV) lampe. Etter at eksperimentet er fullført, kan halvkulen tas direkte av den kalde fingeren og avbildes uten sublimering. Men om ønskelig kan halvkulen overlates til subklimatisering for å visualisere en tradisjonell is etsning. Modifikasjoner introdusert til FIPA-metodikken forkorter den tradisjonelle isetsingsprotokollen med flere timer. I tillegg er det potensial for samtidig avbildning av flere AFPer, hver med en annen fluorescerende etikett, for å visualisere de overlappende mønstrene til AFP-bundet isplan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voksende enkeltiskrystaller

  1. Ta en ren metallpanne (15 cm diameter, 4,5 cm høy) som passer inn i, og kan flyte på, et etylenglykolkjølebad.
  2. Forbered polyvinylklorid (PVC) sylindriske former, (4,5 cm diameter, 3-4 cm høy, 4 mm tykk), ved å sage seksjoner fra et rør.
    1. Klipp et hakk (1 mm bredt, 2 mm høyt) på den ene siden (figur 1A).
    2. Forbered så mange former som kan passe komfortabelt inn i pannen (figur 1B).
      Merk: En studie viste at polyvinylalkohol (PVA) kan påvirke iskjernedannelse22. Men i vårt åpne PVC-system har vi ikke støtt på problemer med atypisk isdannelse.
  3. Påfør en lysfilm med vakuumfett på den nederste overflateringen av hver form, som er overflaten med hakket kuttet ut. Forsegle denne smurte, hakkede overflaten på en metallpanne med hakkene orientert bort fra midten av pannen. Pass på at du ikke fyller eller hindrer hakkene med fett.
  4. Tilsett 0,22 μm filtrert og avgasset / avionisert vann til midten av pannen, men utenfor formene, og la vannet sakte komme inn i formene gjennom hakkene. Vær forsiktig så du ikke introduserer noen bobler. Vannlaget skal være ca. 5 mm dypt.
  5. Plasser pannen i et temperaturkontrollert etylenglykolbad avkjølt til -0,5 °C. Pannen skal være perfekt i vater. Tilsett ballastvekter på sidene av pannen om nødvendig.
  6. Etter at pannen og vannet har nådd -0,5 °C, tilsett et lite stykke is til midten av pannen, utenfor formene.
    1. Dette vil kjerne isvekst i det superkjølte vannet over pannen og inn i formene. Det lille hakket på bunnen av hver mugg tillater bare en iskrystall å forplante seg gjennom, noe som resulterer i en enkelt iskrystall i hver form.
    2. Inkuber over natten for å danne et lag med is.
  7. I løpet av de neste tre dagene tilsett 13 ml 4 °C avgasset/deionisert vann til hver form en gang om dagen og slipp temperaturen på etylenglykolbadet etter hvert tillegg til -0,8 °C på dag én, til -1,1 °C på dag to og til -1,5 °C på dag tre.
    1. Inkuber ved de temperaturene over natten.
    2. På dag fire skal formene være helt fylt med is.
  8. Trekk formene av pannen, skyv iskrystallene ut av formene, og oppbevar på et rent underlag, for eksempel en veiebåt, i en -20 °C fryser i ca. 1 time før håndtering.
  9. I stedet for å forberede mange små enkeltiskrystaller, kan en stor enkelt iskrystall flere liter i volum fremstilles i en konstant temperaturinkubator som beskrevet av Knight23. Den store iskrystallen kan lagres i et år eller mer hvis den holdes dekket i en -15 til -20 °C fryser. Deler av enkeltkrystall kan kuttes fra isblokken med en sag etter behov.

2. Bestemme singularitet og orientering av iskrystallen

  1. Bestem om isen som utvises fra formen er en enkelt krystall ved å observere i et fryserom, mellom to kryssede polaroider (figur 1D).
    1. Hvis iskrystallen er enkel, bør ingen sprekker eller diskontinuiteter ses, og lysretningen bør ikke endres i iskrystallen.
      Merk: Hvis et fryserom ikke er tilgjengelig, kan et kaldt rom brukes i stedet i alle nødvendige trinn, være forsiktig med å jobbe raskt og håndtere isen sparsomt.
  2. På grunn av isen birefringence, kan man bestemme orientering av c-aksen samtidig. Bruk følgende informasjon til å bestemme retningen:
    1. Når c-aksener nøyaktig parallell med hendelseslyset, vil det i teorien ikke passere noe lys gjennom de kryssede polaroidene. Hvis hendelseslyset har tittelen litt parallelt med c-aksen, overføres et jevnt flerfarget lysspekter gjennom krystallen når det roteres mellom de kryssede polaroidene. Denne ensartede overføringen oppstår fra den optiske inaktiviteten til isen Ih langs c-aksen24. Basalplanet til iskrystallen er normalt for c-aksen.
    2. Når c-aksener lenger fra parallell til hendelseslyset og iskrystallen roteres mellom de kryssede polaroidene, vil det overførte lyset veksle mellom 0-100% overføring med hver 90° rotasjon av krystallen.
    3. Vanligvis vil c-aksenvære normal for det sirkulære planet til den sylindriske iskrystallen.
  3. Bestem retningen på a-aksene ved is pitting25 som gjøres ved å pakke iskrystallen tett i aluminiumsfolie, stikke et lite hull med en nål gjennom folien inn i isen på basalplanet (normalt til c-aksen), og plassere den under vakuum i 20 minutter.
    1. Denne behandlingen vil produsere en etsning med sekskantet symmetri på basalplanet, hvor a-aksene går gjennom toppunktene til den sekssidige stjernen (figur 2A).
    2. Om ønskelig kan iskrystallen kuttes med en sag enten parallell eller vinkelrett på den ene siden av sekskanten for å montere den med et primært eller sekundært prismeplan vinkelrett på henholdsvis den kalde fingeren (figur 3).

3. Adsorpsjon av fluorescerende merket frostvæskeproteiner til en enkelt iskrystall

  1. Monter en enkelt iskrystall på den kalde fingeren (figur 1C) ved først å kjede et hulrom inn i toppen av krystallen. For å gjøre dette, bytt smelting av isen med to aluminiumsstenger med litt forskjellig diameter, men ligner diameteren på den kalde fingeren, for å danne hulrommet som den kalde fingeren kan passe inn i.
  2. Avkjøl den kalde fingeren til -0,5 °C, plasser den i ishulen og hold iskrystallen på plass til den fryser til metallet (figur 2B). Unngå luftbobler når du fester krystallen til fingeren, da de hindrer effektiv overføring av varme fra fingeren til stangen.
  3. Fyll en halvkuleformet kopp som er omtrent dobbelt så stor diameter som iskrystallen med filtrert deionisert vann eller buffer, avkjølt til ca. 4 °C. Senk den kalde fingerbundne iskrystallen ned i koppen og fjern overflødig vann eller buffer slik at toppen av iskrystallen er omtrent på nivå med væskelaget og isen ikke berører koppveggene.
    1. Dekk koppen med isolasjon og senk temperaturen til -5 °C.
    2. Vent ca. 1 time til iskrystallen dannes på en halvkule, og kontroller statusen omtrent hvert 20.
    3. Isen vil ta formen på den halvkuleformede koppen ved å smelte og dyrke iskrystallen, men den bør aldri vokse for mye for å berøre koppveggene. Det skal være minst 1 cm mellomrom mellom veggen og halvkule, og den kalde fingeren skal ikke stikke ut fra isen.
  4. Fjern koppen fra iskrystallen og tilsett fluorescerende proteinoppløsning til et sluttvolum på 25-30 ml og ønsket analysekonsentrasjon, og vær forsiktig med å holde det totale væskevolumet i koppen uendret. En typisk AFP-konsentrasjon er 0,1 mg/ml.
    1. Sett iskrystallen inn i koppen igjen slik at toppen av iskrystallen er på nivå med væsken og iskrystallen ikke berører koppveggene (figur 2D).
    2. Slipp den kalde fingertemperaturen til -8 °C og la proteinoppløsningen fryse inn i iskrystallen i 2-3 timer, og rør ofte løsningen. Isen som dannes av proteinløsningen bør være minst 5 mm før isveksten stoppes.
  5. Fjern iskrystallen fra koppen mens den fortsatt er festet til den kalde fingeren. Løsne isen fra sistnevnte ved å varme kjølevæsken gjennom den kalde fingeren til litt over 0 °C og vent til iskrystallen smelter av.
  6. Plasser den krystall flate siden ned på en ren overflate, for eksempel en veiefat, vær forsiktig så du ikke berører den nydannede isen og oppbevarer den ved -20 °C i minst 20 minutter før du overleverer.

4. Visualisering av frostvæskeproteinbundne isplan

  1. Visualisering av fluorescens gjøres i en mørk fryser eller kaldt rom, ved å plassere iskrystallen flat side ned under lamper med bølgelengdespesifikke eksitasjonsfiltre for å begeistre fluorescite etiketten og kamerautslippsfiltrene for å blokkere andre ikke-spesifikke lys. Basert på mønsteret kan isplanene som er bundet av AFPer, estimeres (figur 4).
  2. Hvis bølgelengdespesifikke lys ikke er tilgjengelige, kan en UV-lysboks brukes i stedet.
  3. Tradisjonelle is etser kan også utføres ganske enkelt ved å la ishalvdelen subklimatisere seg ved -20 °C i minst 3 timer, hvoretter restproteinpulver kan bli synlig på isoverflaten (figur 5).
  4. Trinn 2.3 kan gjentas for å bestemme retningen på a-aksene på den ferdige ishalvøya.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forberedelse og montering av den enkle iskrystallen er de to trinnene i FIPA-prosedyren der feil oftest gjøres. Avgjøre om den tilberedte iskrystallen er enkel, gjøres ved å undersøke den gjennom kryssede polaroider (figur 1D), som beskrevet i trinn 2.1 i protokolldelen. Hvis en multikrystallinsk iskrystall brukes til FIPA-analysen, vil resultatet bli diskontinuerlig binding av AFP-ene på halvkule uten et sammenhengende bindingsmønster (figur 6B). Hvis iskrystallgrensesnittene er plassert rundt isplanene som AFP binder det endelige resultatet til, kan det hende at de ikke kan tolkes. Av denne grunn bør iskrystallen kontrolleres nøye for singularitet før den går videre til de neste trinnene. For å øke sannsynligheten for å ha enkeltiskrystaller for FIPA-analysen bør flere gjøres samtidig.

En annen vanlig feil er feilaktig justering av krystallflatene med den kalde fingeren under montering. For å montere de primære eller sekundære prismeflatene vinkelrett på den kalde fingeren, må den enkle iskrystallen først orienteres ved is pitting, deretter kuttes basert på retningen av den stjerneformede etselen (figur 2A og 3), som beskrevet i trinn 2.3 i protokolldelen. Hvis iskrystallen er montert feiljustert, vil det endelige resultatet gi en halvkule der ekvatoriatoren på halvkule ikke stemmer overens med symmetrien til isplanene (figur 6C). Selv om dette er et tolkbart resultat, vil det være mindre informativt enn en riktig justert iskrystall siden den største omkretsen av halvkule er ved ekvator (figur 4).

Figure 1
Figur 1. Utstyr for dyrking og montering av enkle iskrystaller. A) PVC-former. B) Panorer i etylenglykolbad med PVC-former. C) Kald finger med strømning av etylenglykol vist med den hvite pilen. Den hvite stiplede linjen angir den indre veggen på den kalde fingeren. D) Diagram over kryssede polaroider for orientering av en enkelt iskrystall. Lyskilden er gul, kryssede polaroider er grå og den enkle iskrystallen er hvit. Retningen til polaroidene (grå piler) og iskrystallretning (røde piler) er indikert. Fra venstre til høyre er iskrystallen orientert slik at c-aksener vinkelrett på bunnpoloiden, 45° til bunnpoloiden og parallelt med hendelseslyset. Lyset som passerer gjennom de kryssede polaroidene og isen vil se mørkt, lyst eller svakt flerfarget gjennom den øverste polaroiden, avhengig av iskrystallens orientering. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 2
Figur 2. Forbereder iskrystall for FIPA. A) Bestemme akser orienteringer ved is etsning med sekskantet symmetri. Krystallens basalplan er parallell med sideplanet. B) Montere den enkle iskrystallen på den kalde fingeren. C) Is etter å ha dannet seg til halvkule. D) Ishalvdel nedsenket i halvkuleformet kopp fylt med proteinoppløsning. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 3
Figur 3. Montering av iskrystall basert på orientering. A) Diagram over montering av is med (i) basalplanet, (ii) et primært prismeplan og (iii) et sekundært prismeplan vinkelrett på den kalde fingeren. For orienteringer (ii) og (iii) må iskrystallen kuttes i to, som vist på figuren. B) FIPA-resultater av Pacific blåmerket type III nfeAFP8 etter montering av iskrystaller med (i) basalplanet og (ii) et primært prismeplan vinkelrett på den kalde fingeren. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 4
Figur 4. Tolke AFP-bundne plan fra FIPA-analyseresultater. A) Representasjon av de bundne flyene til Ih is; og B) det tilsvarende FIPA-analyseresultatet når den enkle iskrystallen er montert med et primært prismeplan vinkelrett på den kalde fingeren. Paneler representerer (i) basalplan, (ii) primært prismeplan, (iii) sekundært prismeplan, (iv) pyramideplan justert etter a-aksene, og (v) pyramideplan forskjøvet til a-aksene. C) Morfologi av en enkelt iskrystall når den vokser i løsning av AFPer som binder pyramidale plan i) justert til a-akser og ii) offset fra a-aksene. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 5
Figur 5. Sammenligning av tradisjonelle is etser versus FIPA. A) (i) Den tradisjonelle etsjen av type I AFP (HPLC6 isoform) produsert av vinterflunderen (Pseudopleuronectes americanus) er vist som opprinnelig produsert av Knight et al., (1991). (ii) Tilsvarende FIPA-analyse av samme protein merket med TRITC. B) (i) Tradisjonell etsning av en firedoblet IBS-mutant (V9Q/V19L/G20V/I41V) av type III nfeAFP11 (fra den japanske ålen pout Zoarces elongatuskner)21. (ii) Tilsvarende FIPA-analyse av samme protein merket med TRITC. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 6
Figur 6. Halvkule som følge av vanlige FIPA-analysefeil. Analyser ble utført på GFP-merket type III HPLC12-A16H. A) Et optimalt FIPA-resultat for sammenligning. Iskrystallen ble montert med sitt primære prismeplan vinkelrett på den kalde fingeren. B) FIPA-analyse som utilsiktet ble utført ved hjelp av en ishalvdel som består av mer enn én krystall. C) FIPA-analyse som ble utført på en feiljustert enkeltiskrystall. Det sekundære prismeplanet ble ikke montert nøyaktig vinkelrett på den kalde fingeren. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 7
Figur 7. Bruke FIPA-analyse til å sammenligne isbindende mønstre fra ulike AFI-er. Pacific blue-labeled type III nfeAFP8 ble kombinert med TRITC-merket type I AFP og en enkelt FIPA-analyse ble utført. A) Visualisering bare av type III nfeAFP8. B) Visualisering bare av type I AFP. C) Visualisering av type III nfeAFP8 og type I AFP sammen. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 8
Figur 8. FIPA for moderat aktive og hyperaktive AFPer. A) FIPA-analyse av tre forskjellige moderat aktive fiske-AFPer; (i) TRITC-merket type I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus), (ii) TRITC-merket type II AFP(Ca2+-uavhengig isoform, Longsnout poacher), (iii) Pacific-blue-labeled type III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B) FIPA-analyse av tre forskjellige hyperaktive AFPer; (i) GFP-merket MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (ii) TRITC-merket sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (iii) GFP-merket TmAFP (Tenebrio molitor). I alle bilder er c-aksenvinkelrett på sideplanet. Klikk her for å vise større bilde.

Figure 9
Figur 9. Forholdet mellom fluorescerende mønster produsert av FIPA-analyse til iskrystallmorfologi av forskjellig type III AFP-isoformer og mutanter11,21. A) (i) FIPA-analyse av GFP-merket QAE-A16H. (ii) Iskrystallmorfologi produsert av QAE-A16H. B) (i) FIPA-analyse av TRITC-merket nfeAFP11-V9Q. (ii) Iskrystallmorfologi produsert av nfeAFP11-V9Q. C) (i) FIPA-analyse av TRITC-merket wild-type nfeAFP11. (ii) Iskrystallmorfologi produsert av wild-type nfeAFP11. D) (i) FIPA-analyse av TRITC-merket wild-type nfeAFP6. (ii) Iskrystallmorfologi produsert av wild-type nfeAFP6. C-akseretninger og skaleringslinjer er som angitt. Klikk her for å vise større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Charles Knights utvikling av isetsingsmetoden for bestemmelse av AFP-bundne isfly avanserte i stor grad studier på mekanismen for isbinding av AFPer. Mens strukturer av AFPer kunne løses ved røntgenkrystallografi26,27 var det ingen åpenbar metode for å utlede den komplementære overflaten på is som AFP bundet til. Da type I AFP fra vinterflunder i utgangspunktet ble karakterisert, ble det hypoteset å binde seg til de primære prismeplanene av is28. Imidlertid viste Knights banebrytende isetsingsforsøk av type I AFP at de binder seg til pyramidale plan av is13. Dette resultatet stimulerte AFP-forskersamfunnet til å revurdere mekanismen for AFP-isbinding og mer nøyaktig bestemme det isbindende ansiktet til AFPs9. Knights originale isetsingsforsøk ble gjort ved hjelp av innfødte AFPer renset fra AFP-produserende organismer. Med utviklingen av rekombinante AFPer og den økende bruken av GFP-tagger, var det en mulighet til å utvide disse studiene til mange andre AFPer29.

Ideen om å inkorporere kovalente fluorescerende proteinfarger, som tetrametylrhodamin-5-(og 6)-isothiocyanat (TRITC), kom først etter suksessen til GFP-fusjonerte AFP FIPA-analyser11. De chimeriske fluorescerende proteinmerkene og de kjemiske modifikasjonene av kovalente fargestoffer har blitt observert for ikke å påvirke AFPs isbindende mønstre (figur 5). Med førstnevnte er GFP smeltet sammen til enten N- eller C-terminalendene til AFP-ene, som ofte er godt fjernet fra IBS. En fleksibel kobling kan også settes inn mellom GFP og AFP, slik at taggen kan skyves bort fra isoverflaten. Med sistnevnte merkingsstrategi er de ladede sidekjedene som reagerer med de kovalente fargestoffene vanligvis på overflater borte fra IBS. Hvis strategiene som presenteres her for fluorescerende merking av AFPer ikke fungerer, er innføring av en cystein vekk fra IBS for reaksjon med tiolreaktive fargestoffer et annet alternativ30. Ved å treffe tiltak for å sikre at fluorescerende etiketter ikke påvirker AFP-isbindingen, slik det vurderes av termisk hystereseaktivitet og iskrystallmorfologi, er vi sikre på at FIPA-analysen viser sann representasjon av AFP isbindende mønstre, som det gjorde i den opprinnelige isetsingsmetoden.

Det er flere fordeler med fluorescerende merking av AFP-ene for FIPA-analysen. Mindre tid er nødvendig for prosedyren siden sublimering av is for visualisering av AFP-bundne fly ikke er nødvendig. Inkorporering av merket protein på halvkule kan overvåkes under isens vekst for å vurdere eksperimentell ferdigstillelse, og AFP-bindende mønster kan registreres når som helst. Dette forhindrer unødvendig lange eksperimenter, eller for tidlig fullføring av isvekst. Fluorescerende merking tillater klarere AFP-bindende mønstervisualisering enn tidligere mulig med etsning, som det ses i sammenligningen av resultater fra begge metodene som brukes på type I og type III AFPer (figur 5). En isetsing etter FIPA kan imidlertid enkelt gjennomføres ved å plassere halvkulen i en fryser i flere timer, noe som betyr at begge analysene kan gjøres på samme prøve siden lignende AFP-konsentrasjoner er nødvendige for begge metodene. En verdifull fordel med FIPA er evnen til å visualisere mer enn én AFP som er merket på samme ishalvdel (figur 7). Dette er nyttig for å illustrere forskjeller i AFP isbindingsfly sett med forskjellige AFP-typer, isoformer og aktivitetsmutanter.

FIPA-analyse er allerede brukt i flere AFP-studier. Det har blitt brukt til å støtte hypotesen om at basalplanbinding er unik for hyperaktive AFPer og nødvendig for deres høye aktivitet18. Moderat aktive AFPer ble funnet å ikke binde basalplanet (figur 8A), men mange hyperaktive AFPer dekker helt ishalvøya, inkludert basalplanet av is (figur 8B)5,20,31. FIPA-analyse har også blitt brukt til å studere funksjonen til spesifikke isbindende rester. For eksempel ble FIPA-analyse utført på flere type III-isoformer og mutanter, hvorav noen forhindrer isvekst, og noen av dem har vist seg å bare forme is11,21,32. Fra studiene ble det funnet at spesielle rester er viktige for innlemmelse av AFP-ene i is, og andre er viktige i isplanspesifisitet (figur 9).

Andre metoder for å studere AFP-bindende mønstre på enkeltiskrystaller inkluderer direkte observasjon ved fluorescensmikroskopi16,33 og mikrofluidikk34. Disse metodene har fordelen av følsomhet for dynamikken i AFP-tilknytningen til is og overvåking av isforming samtidig med AFP-affiniteten til isen, men er mindre robuste sammenlignet med FIPA-metoden for å bestemme affiniteten til isplanene. Molekylær dynamikk brukes også til å forutsi isplanbindingsspenheten til AFPer12,20,21,30,35. Ved hjelp av FIPA-analyse, sammen med de andre tilgjengelige teknikkene, lærer vi isplanbindingsmønstrene til hver AFPer, betydningen av sammensetningen av IBS i valg av isplan, og hvordan binding av spesifikke fly er relatert til AFP-aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter er erklært.

Acknowledgments

PLD har Canada Research Chair i Protein Engineering. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra Canadian Institutes of Health Research til PLD. Dette arbeidet ble også støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr. 23310171) og fra Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Vi er takknemlige til Dr. Chris Marshall og Mike Kuiper for banebrytende arbeid som førte til FIPA. Vi er også takknemlige til Dr. Sakae Tsuda for å tilby fasiliteter for noe av dette arbeidet og til Dr. Laurie Graham for å sette opp fluorescerende lyseksitasjons- og utslippsfiltre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Tags

Kjemi Utgave 83 Materialer Biovitenskap Optikk frostvæskeproteiner Is adsorpsjon Fluorescerende merking Isgitterplan isbindende proteiner Enkel iskrystall
Bestemme isbindende fly av frostvæskeproteiner ved fluorescensbasert isplanaffinitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter