Summary
חלבונים נגד קיפאון (AFPs) נקשרים למישורי קרח ספציפיים כדי למנוע או להאט את צמיחת הקרח. ניתוח זיקה למישור קרח (FIPA) המבוסס על פלואורסצנטיות הוא שינוי בשיטת תחריט הקרח המקורית לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP. AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי, משולבים בגבישי קרח בודדים מקרוסקופיים, ומוצגים תחת אור UV.
Abstract
חלבונים נגד קיפאון (AFPs) באים לידי ביטוי במגוון אורגניזמים קרים-קשים כדי למנוע או להאט את צמיחת הקרח הפנימית. AFPs להיקשר למישורים ספציפיים של קרח דרך משטחי הקרח שלהם מחייבים. ניתוח זיקה למישור קרח (FIPA) המבוסס על פלואורסצנטיות הוא טכניקה מותאמת המשמשת לקביעת מישורי הקרח שאליהם נקשרים ה- AFPs. FIPA מבוסס על שיטת תחריט הקרח המקורית לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP. היא מייצרת תמונות ברורות יותר בזמן ניסיוני מקוצר. בניתוח FIPA, AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי עם תג כימרי או צבע קוולנטי ואז משולבים לאט לתוך גביש קרח יחיד מקרוסקופי, אשר כבר preformed לתוך חצי הכדור ומכוון לקבוע את צירי a- ו- c. חצי הכדור הקרח הקשור ל- AFP נראה תחת אור UV כדי לדמיין מטוסים הקשורים ל- AFP באמצעות מסננים כדי לחסום אור לא ספציפי. תיוג פלואורסצנטי של AFPs מאפשר ניטור בזמן אמת של ספיחה AFP לקרח. התוויות נמצאו לא להשפיע על המטוסים שאליהם AFPs לאגד. ניתוח FIPA גם מציג את האפשרות לאגד יותר מ- AFP מתויג באופן שונה על אותו גביש קרח יחיד כדי לעזור להבדיל בין מישורי הכריכה שלהם. יישומים אלה של FIPA עוזרים לקדם את ההבנה שלנו כיצד AFPs להיקשר לקרח כדי לעצור את הצמיחה שלה ומדוע אורגניזמים רבים המייצרים AFP להביע איזופורמים AFP מרובים.
Introduction
הייצור של חלבונים נגד קיפאון (AFPs) הוא מנגנון הישרדות חשוב של אורגניזמים מסוימים שחיים בסביבות עמוסות קרח. עד לאחרונה, הוא חשב כי הפונקציה היחידה של AFPs היה למנוע או להאט את הצמיחה של גבישי קרח פנימיים שיחסמו את זרימת הדם, לגרום נזק לרקמות, ומתח אוסמוטי. אורגניזמים שאינם יכולים לסבול כל מידה של הקפאה, כגון דגים, מבטאים AFPs כדי לעכב לחלוטין את צמיחת גביש הקרח1. אחרים, כגון דשא, הם סובלניים להקפיא ולבטא AFPs כדי לעכב recrystallization קרח אשר מפחית את היווצרות גבישי קרח גדולים ברקמות שלהם2. ייצוב של ממברנות בטמפרטורה נמוכה היא עוד פונקציה שהוצעה עבור AFPs3. לאחרונה הוצע תפקיד חדש לסוכנות הידיעות הצרפתית AFP של חיידק אנטארקטיקה, מרינומונס פרימוריאנסיס, מאגמים מליחים מכוסי קרח4. זה AFP הוא חלק חלבון אדזיה הרבה יותר גדול5 כי הוא חשב לחבר את החיידק לקרח לגישה טובה יותר חמצן וחומרים מזינים6. מיקרואורגניזמים אחרים ידועים להפריש AFPs, אשר עשוי לשנות את המבנה של הקרח שבו הםחיים 7.
AFPs נמצאו כמה דגים, חרקים, צמחים, אצות, חיידקים, דיאטומים, ופטריות. יש להם רצפים ומבנים שונים להפליא התואמים את התפתחותם מאבותיהם השונים בהזדמנויות שונות; ובכל זאת כולם נקשרים לקרח ומעכבים את צמיחתו על ידי מנגנון עיכוב הספיחת8. לכל אחד מה- AFPs יש משטח ספציפי המשמש כאתר מחייב הקרח (IBS). אלה זוהו בדרך כלל על ידי mutagenesis מכוון האתר של שאריות פני השטח9-11. IBS הוא שיערו לארגן מולקולות מים בתבנית דמוית קרח שתואם מישורים ספציפיים של קרח. לכן AFP יוצר ligand שלה לפני מחייב אותו5, 12. מטוסי קרח יכולים להיות מוגדרים על ידי מדדי מילר שלהם, ו- AFPs שונים יכולים להיקשר למישורים שונים. לפיכך, סוג I AFP מ flounder החורף נקשר 20-21 מטוסים פירמידליים13, סוג III AFP קושר הן פריזמה ראשונית מטוסים פירמידליים באמצעות משטח קרח מורכב מחייב11,14, בעוד התולעת אשוחית AFP, AFP היפראקטיבי, נקשר בו זמנית הן המטוסים העיקריים הבסיסיים15,16. AFPs היפראקטיביים אחרים, כגון MPAFP, נקשרים למספר מטוסי קרח כפי שמוצג על ידי הכיסוי המלא שלהם של ההמיספרות של גבישי קרח יחיד5,17. זה המשוערות, כי היכולת של AFPs היפראקטיבי לקשור את המישור הבסיסי, כמו גם מטוסים אחרים, עשוי להסביר את הפעילות הגבוהה פי 10 שלהם על AFPs פעיל בינוני18. למרות היעילות של AFPs היפראקטיבי מתועד היטב, היכולת שלהם להיקשר למטוסי קרח מרובים עדיין לא מובן.
השיטה המקורית לקביעת מטוסי הקרח הקשורים ל-AFP פותחה על ידי צ'ארלס נייט13,19. בשיטה זו, גביש קרח יחיד מקרוסקופי מותקן על מוט מתכת חלול (אצבע קרה) ונוצר בחצי הכדור על ידי שקיעתו לתוך חצי הכדור מלא במים דלים. לאחר מכן, ההמיספרה שקועה בתמיסה מדוללת של AFPs ושכבת קרח גדלה מתמיסת AFP אל חצי הכדור של גביש הקרח במשך מספר שעות הנשלטת על ידי הטמפרטורה של האתילן גליקול במחזור דרך האצבע הקרה. גביש הקרח מוסר מהתמיסה, מנותק מהאצבע הקרה, ומונח בחדר מקפיא של -10 עד 15 מעלות צלזיוס. פני השטח מגרדים בלהב חד כדי להסיר את סרט פני השטח הקפואים של תמיסת חלבון נגד קיפאון וקריסטל הקרח מותר סובלימציה לפחות 3 שעות. לאחר סובלימציה, ניתן לראות את מישורי הקרח הכפופים ל- AFPs כתבניות חרוטות לבנות הנגזרות משורי חלבון. ניתן לכוון את חצי הכדור הקרח לציר cולצירים, לאתר את מישורי הבזל והמנסרה של הקרח, ולקבוע את מדדי מילר של הכתמים החרוטים.
כאן אנו מתארים שינוי של השיטה המקורית לקביעת AFP הקשורים מישורי קרח, שיטה שאנו מכנים זיקה מטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות (FIPA)11. AFPs מסומנים באופן פלואורסצנטי עם תג כימרי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)11,16,17,20, או עם צבע פלואורסצנטי קשור בקובאליות AFP5,21. AFPs שכותרתו פלואורסצנטית הם נספגים גביש קרח אחד מגודל באמצעות אותו הליך ניסיוני כמו הניסויים המקוריים תחריט קרח. ניתן לעקוב אחר היקף ה-AFP המחייב את חצי הכדור הקרח הגדל לאורך כל הניסוי באמצעות מנורת אולטרה סגול (UV). לאחר השלמת הניסוי, ניתן להוריד את חצי הכדור ישירות מהאצבע הקרה ולצלם אותה, ללא סובלימציה. עם זאת, אם תרצה, ניתן להשאיר את חצי הכדור לעובר כדי לדמיין תחריט קרח מסורתי. שינויים שהוכנסו למתודולוגיית FIPA מקצרים את פרוטוקול תחריט הקרח המסורתי בכמה שעות. בנוסף, קיים פוטנציאל להדמיית מספר AFPs בו זמנית, כל אחד עם תווית פלואורסצנטית שונה, כדי לדמיין את הדפוסים החופפים של מישורי קרח הקשורים ל- AFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול גבישי קרח בודדים
- קח מחבת מתכת נקייה (קוטר 15 ס"מ, 4.5 ס"מ גבוה) שמתאים, והוא יכול לצוף על, אמבט קירור אתילן גליקול.
- הכינו תבניות גליליות פוליוויניל כלוריד (PVC) (קוטר 4.5 ס"מ, גובה 3-4 ס"מ, עובי 4 מ"מ), על ידי ניסור קטעים מצינור.
- חותכים חריץ (רוחב 1 מ"מ, גובה 2 מ"מ) בצד אחד (איור 1A).
- הכינו כמה שיותר תבניות שיכולות להתאים בנוחות למחבת (איור 1B).
הערה: מחקר הראה כי אלכוהול פוליוויניל (PVA) יכול להשפיע על גרעיני קרח22. עם זאת, במערכת PVC עובש פתוח שלנו לא נתקלנו בבעיות של היווצרות קרח לא טיפוסי.
- החל סרט אור של שומן ואקום על טבעת המשטח התחתון של כל עובש, שהוא פני השטח עם חריץ לגזור. אטום משטח משומן וחריץ זה על מחבת מתכת עם החריצים המכוונים הרחק ממרכז המחבת. היזהר לא למלא או לחסום את החריצים עם שומן.
- מוסיפים 0.22 מיקרומטר מים מסוננים ופגומים/deionized למרכז המחבת, אבל מחוץ לתבניות, ולאפשר למים לאט להיכנס לתוך התבניות דרך החריצים. היזהר לא להציג בועות. שכבת המים צריכה להיות בעומק של כ-5 מ"מ.
- מניחים את המחבת באמבט אתילן גליקול מבוקר טמפרטורה מקורר ל-0.5 מעלות צלזיוס. המחבת צריכה להיות ברמה מושלמת. מוסיפים משקולות נטל לצדי המחבת במידת הצורך.
- לאחר המחבת והמים הגיעו -0.5 מעלות צלזיוס, מוסיפים חתיכת קרח קטנה לאמצע המחבת, מחוץ לתבניות.
- זה יהיה גרעין צמיחת קרח במים supercooled על פני המחבת לתוך התבניות. החריץ הקטן בתחתית כל תבנית מאפשר רק גביש קרח אחד להתפשט דרכו, וכתוצאה מכך גביש קרח אחד בכל תבנית.
- דגירה לילה כדי ליצור שכבה של קרח.
- במהלך שלושת הימים הבאים להוסיף 13 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס מים degassed / deionized לכל עובש פעם ביום ולהפיל את הטמפרטורה של אמבט אתילן גליקול לאחר כל תוספת -0.8 מעלות צלזיוס ביום הראשון, כדי -1°C ביום השני, ו -1 °C (69 °F) ביום השלישי.
- דגירה בטמפרטורות אלה בן לילה.
- עד היום הרביעי, התבניות צריכות להיות מלאות לחלוטין בקרח.
- מוציאים את התבניות מהמחבת, דוחפים את גבישי הקרח מהתבניות ומאחסנים על משטח נקי, כגון סירת שקילה, במקפיא של -20 מעלות צלזיוס כשעה לפני הטיפול.
- במקום להכין גבישי קרח בודדים קטנים רבים, גביש קרח אחד גדול מספר ליטרים בנפח ניתן להכין באינקובטור טמפרטורה קבוע כמתואר על ידי אביר23. גביש הקרח הגדול יכול להיות מאוחסן במשך שנה או יותר אם נשמר מכוסה במקפיא -15 עד -20 מעלות צלזיוס. חלקים של גביש יחיד ניתן לחתוך מגוש הקרח עם מסור כנדרש.
2. קביעת הייחודיות וההתמצאות של גביש הקרח
- קבעו אם הקרח שסולק מהתבנית הוא גביש יחיד על ידי התבוננות בחדר מקפיא, בין שני פולארוידים מוצלבים (איור 1D).
- אם גביש הקרח הוא יחיד, אז אין סדקים או הפסקות צריך להיראות, ואת כיוון האור לא צריך להשתנות בתוך גביש הקרח.
הערה: אם חדר מקפיא אינו זמין, ניתן להשתמש במקום זאת בחדר קר בכל הצעדים הנדרשים, תוך זהירות לעבודה מהירה ולטפל בקרח במשורה.
- אם גביש הקרח הוא יחיד, אז אין סדקים או הפסקות צריך להיראות, ואת כיוון האור לא צריך להשתנות בתוך גביש הקרח.
- בשל בירפרינגנס הקרח, ניתן לקבוע את הכיוון של ציר cבו זמנית. השתמש במידע הבא כדי לקבוע את כיוון ההדפסה:
- כאשר ציר cמקביל בדיוק לאור האירוע, בתיאוריה, שום אור לא יעבור דרך הפולארוידים החוצים. אם אור האירוע נקרא מעט מקביל לציר c,ספקטרום אור צבעוני אחיד מועבר דרך הגביש כאשר הוא מסתובב בין הפולארוידים החוצים. שידור אחיד זה נובע חוסר הפעילות האופטית של קרח אניh לאורך ציר cשלה24. מישור הבסיס של גביש הקרח תקין לציר c.
- כאשר ציר cרחוק יותר מהמקביל לאור האירוע וקריסטל הקרח מסתובב בין הפולארוידים החוצים, האור המועבר יתחלף בין 0-100% שידור עם כל 90° סיבוב של הגביש.
- לרוב, ציר cיהיה נורמלי למישור המעגלי של גביש הקרח הגלילי.
- לקבוע את הכיוון של -ציריםעל ידי קרח pitting25 אשר נעשה על ידי עטיפת גביש הקרח בחוזקה בנייר אלומיניום, לתקוע חור קטן עם מחט דרך הרדיד לתוך הקרח על מישור הבסיס (נורמלי c -ציר),והנחת אותו תחת ואקום במשך 20 דקות.
- טיפול זה יפיק תחריט עם סימטריה משושה במישור הבסיס, שבו הגרזנים עוברים דרך הקודקודים של הכוכב בעל ששת הצדדים (איור 2A).
- אם תרצה, ניתן לחתוך את גביש הקרח עם מסור מקביל או ניצב לצד אחד של המשושה כדי להרכיב אותו במישור מנסרה ראשי או משני הניצב לאצבע הקרה, בהתאמה (איור 3).
3. ספיחה של חלבונים נגד קיפאון שכותרתו פלואורסצנטית לקריסטל קרח יחיד
- הר גביש קרח אחד על האצבע הקרה (איור 1C) על ידי משעמם תחילה חלל לחלק העליון של הגביש. כדי לעשות זאת, לסירוגין להמיס את הקרח עם שני מוטות אלומיניום בקוטר שונה במקצת, אבל בדומה לקוטר של האצבע הקרה, כדי ליצור את החלל שבו האצבע הקרה יכולה להתאים.
- מצננים את האצבע הקרה ל-0.5 מעלות צלזיוס, מניחים בחלל הקרח ומחזיקים את גביש הקרח במקומו עד שהוא קופא למתכת (איור 2B). הימנע בועות אוויר בעת חיבור הגביש לאצבע כפי שהם לעכב העברה יעילה של חום מהאצבע אל המוט.
- מלאו חצי כדורית בקוטר של כפליים מקריסטל הקרח במים מסוננים או חיץ, מקורר לכ-4 מעלות צלזיוס. לטבול את גביש הקרח הקר הקשור לאצבע לתוך הכומתה ולהסיר מים עודפים או חיץ כך החלק העליון של גביש הקרח הוא בערך ברמה עם שכבת הנוזל והקרח אינו נוגע בקירות ה מכוס.
- מכסים את הכיפה בבידוד ומורידים את הטמפרטורה ל-5 מעלות צלזיוס.
- המתן כשעה עד שקריסטל הקרח יתגבש בחצי הכדור, ובדוק את מצבו בערך כל 20 דקות (איור 2C).
- הקרח ייקח את הצורה של hemispherical על ידי המסה וגידול גביש הקרח, אבל זה אף פעם לא צריך לגדול יתר על הים לגעת בקירות הכוויה. צריך להיות לפחות 1 ס"מ רווח בין הקיר וחצי הכדור ואת האצבע הקרה לא צריך לבלט מן הקרח.
- מוציאים את ה מגביש הקרח ומוסיפים את תמיסת החלבון הפלואורסצנטית לנפח סופי של 25-30 מל וריכוז ניתוח רצוי, תוך הקפדה על שמירה על נפח הנוזלים הכולל בכמות ללא שינוי. ריכוז AFP טיפוסי הוא 0.1 מ"ג / מ"ל.
- מכניסים מחדש את גביש הקרח לתוך התספל כך שחלקו העליון של גביש הקרח נמצא ברמה גבוהה עם הנוזל וקריסטל הקרח אינו נוגע בקירות הכוויה (איור 2D).
- הורידו את טמפרטורת האצבע הקרה ל-8 מעלות צלזיוס ותנו לתמיסת החלבון לקפוא לתוך גביש הקרח למשך 2-3 שעות, תוך ערבוב הפתרון לעתים קרובות. הקרח שנוצר מתמיסת החלבון צריך להיות לפחות 5 מ"מ לפני עצירת צמיחת הקרח.
- מוציאים את גביש הקרח מהספל בעודם מחוברים לאצבע הקרה. נתק את הקרח מהאחרון על ידי חימום הקירור דרך האצבע הקרה לקצת מעל 0 מעלות צלזיוס ומחכה עד שקריסטל הקרח יימס.
- מניחים את הצד השטוח של הגביש על משטח נקי, כגון צלחת שקילה, נזהרים שלא לגעת בקרח בצורתו החדשה ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות לפני המסירה.
4. הדמיה של מישורי קרח הקשורים לחלבון נגד קפיאה
- הדמיה של פלואורסצנטיות נעשית במקפיא חשוך או בחדר קר, על ידי הצבת הצד השטוח של גביש הקרח מתחת למנורות עם מסנני עירור ספציפיים לאורך הגל כדי לרגש את התווית הפלואורסצנטית ומסנני פליטת המצלמה כדי לחסום כל אור לא ספציפי אחר. בהתבסס על התבנית, ניתן להעריך את מישורי הקרח המאוגדים על-ידי AFPs (איור 4).
- אם נוריות ספציפיות לאורך הגל אינן זמינות, ניתן להשתמש במקום זאת בתיבת אור UV.
- אטצ'ים מסורתיים של קרח יכולים להתבצע פשוט על ידי מתן אפשרות לחצי הכדור קרח לבצע נשגב ב -20 מעלות צלזיוס לפחות 3 שעות, ולאחר מכן אבקת חלבון שיורית עשויה להיות גלויה על משטח הקרח (איור 5).
- שלב 2.3 יכול לחזור על עצמו על מנת לקבוע את הכיוון של צירי -שלחצי הכדור הקרח השלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכנה והרכבה של גביש הקרח הבודד הם שני השלבים של הליך FIPA שבו שגיאות נעשות בדרך כלל. קביעה אם גביש הקרח המוכן הוא יחיד נעשית על ידי בחינתו באמצעות פולארוידים מוצלבים (איור 1D),כמתואר בשלב 2.1 של סעיף הפרוטוקול. אם נעשה שימוש בגביש קרח רב-קריסטלי לניתוח FIPA, התוצאה תהיה כריכה רציפה של AFPs בחצי הכדור ללא תבנית כריכה עקבית (איור 6B). אם ממשקי גביש הקרח ממוקמים סביב מישורי הקרח שאליהם נקשרת סוכנות הידיעות הצרפתית, ייתכן שהתוצאה הסופית לא תהיה ניתנת לפרשנות. מסיבה זו, גביש הקרח צריך להיבדק בקפידה עבור סינגולריות לפני המעבר לשלבים הבאים. כדי להגדיל את ההסתברות שיש גבישי קרח בודדים עבור ניתוח FIPA כמה צריך להיעשות בו זמנית.
שגיאה נפוצה נוספת היא יישור שגוי של פני הגביש עם האצבע הקרה במהלך ההרכבה. כדי לעלות על פני פריזמה ראשונית או משנית בניצב לאצבע הקרה, גביש הקרח הבודד חייב להיות מכוון תחילה על ידי pitting קרח, ולאחר מכן לחתוך על סמך הכיוון של תחריט בצורת כוכב (איורים 2A ו 3), כמתואר בשלב 2.3 של סעיף הפרוטוקול. אם גביש הקרח מותקן בצורה לא מיושרת, התוצאה הסופית תייצר חצי כדור שבו קו המשווה של חצי הכדור אינו מתיישר עם הסימטריה של מישורי הקרח (איור 6C). למרות שמדובר בתוצאה ניתנת לפרשנות, היא תהיה פחות אינפורמטיבית מגביש קרח מיושר כהלכה, שכן ההיקף הגדול ביותר של חצי הכדור נמצא בקו המשווה (איור 4).
איור 1. ציוד לגידול והרכבה של גבישי קרח בודדים. A)תבניות PVC. B) פאן באמבט אתילן גליקול עם תבניות PVC. C) אצבע קרה עם זרימה של אתילן גליקול המוצג על ידי החץ הלבן. הקו המקווקו הלבן מציין את הקיר הפנימי של האצבע הקרה. D) תרשים של פולארוידים מוצלבים לכוון גביש קרח אחד. מקור האור צהוב, פולארוידים מוצלבים הם אפורים וקריסטל הקרח היחיד לבן. כיוון הפולארוידים (חצים אפורים) וכיוון גביש הקרח (חצים אדומים) מסומנים. משמאל לימין גביש הקרח מכוון כך שציר c-צב לקוטב התחתון, 45° לפולארויד התחתון, ומקביל לאור האירוע. האור החולף למרות הפולארוידים והקרח החוצים ייראה כהה, בהיר או צבעוני קלוש דרך הפולארויד העליון בהתאם לכיוון גביש הקרח. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 2. מכין גביש קרח ל-FIPA. A) קביעת כיוונים צירים על ידי תחריט קרח עם סימטריה משושה. מישור הבסיס של הגביש מקביל למישור הדף. B) הרכבה על גביש קרח יחיד על האצבע הקרה. ג)קרח לאחר היווצרות לתוך חצי הכדור. D) חצי כדור קרח שקוע בהמיספרה מלאה בתמיסת חלבון. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 3. הרכבה גביש קרח על בסיס אוריינטציה. A) תרשים של קרח הרכבה עם (i) מישור הבסיס, (ii) מישור פריזמה ראשי, ו-(iii) מישור מנסרה משני הניצב לאצבע הקרה. עבור אוריינטציות (ii) ו-(iii) יש לחתוך את גביש הקרח לשניים, כפי שמוצג באיור. B) תוצאות FIPA של סוג III nfeAFP8 המסומן בכחול האוקיינוס השקט לאחר הרכבה של גבישי קרח עם (i) מישור הבסיס ו-(ii) מישור מנסרה ראשי הניצב לאצבע הקרה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 4. פירוש מטוסים הקשורים ל- AFP מתוצאות ניתוח FIPA. א)ייצוג המישורים הכרוכים בקרח; ו- B) תוצאת ניתוח FIPA המתאימה כאשר גביש הקרח הבודד מותקן עם מישור פריזמה ראשי בניצב לאצבע הקרה. לוחות מייצגים (i) מישור בסיסי, (ii) מישור פריזמה ראשי, (iii) מישור פריזמה משני, (iv) מישור פירמידלי מיושר עם צירי-, ו (v) מישור פירמידלי לקזז אתצירי-. ג)מורפולוגיה של גביש קרח יחיד כאשר גדל בתמיסה של AFPs שקושרים מישורים פירמידליים i) מיושרים ל- a-axes ו- ii) מקוזזים מהצירים. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 5. השוואה של etches קרח מסורתי לעומת FIPA. A) (i) התחריטים המסורתיים מסוג I AFP (HPLC6 isoform) המיוצרים על ידי פלונדר החורף(Pseudopleuronectes americanus)מוצגים כפי שיוצרו במקור על ידי Knight et al., (1991). (ii) ניתוח FIPA המתאים של אותו חלבון שכותרתו TRITC. B) תחריט מסורתי של מוטציית IBS מרובעת (V9Q/V19L/G20V/I41V) מסוג III nfeAFP11 (מהצולק היפני Zoarces elongatuskner)21. (ii) ניתוח FIPA המתאים של אותו חלבון שכותרתו TRITC. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 6. ההמיספרות נובעות משגיאות ניתוח FIPA נפוצות. ניתוחים נערכו על סוג GFP מתויג III HPLC12-A16H. A) תוצאת FIPA אופטימלית להשוואה. גביש הקרח היה רכוב עם מישור המנסרה העיקרי שלו בניצב לאצבע הקרה. B) ניתוח FIPA שנערך בשוגג באמצעות חצי כדור קרח המורכב מיותר מגביש אחד. C) ניתוח FIPA שנערך על גביש קרח יחיד לא מיושר. מישור המנסרה המשני לא היה מותקן בדיוק בניצב לאצבע הקרה. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 7. שימוש בניתוח FIPA להשוואת דפוסי כריכת קרח של AFPs שונים. סוג III nfeAFP8 בעל התווית הכחולה הפסיפית שולבה עם סוג I AFP עם תווית TRITC וניתוח FIPA יחיד נערך. A) תצוגה חזותית של סוג III nfeAFP8 בלבד. ב)הדמיה מסוג I AFP בלבד. ג)הדמיה של סוג III nfeAFP8 וסוג I AFP יחד. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 8. FIPA של AFPs פעילים והיפראקטיביים בינוניים. A) ניתוח FIPA של שלושה AFPs דגים פעילים בינוני שונים; (i) TRITC שכותרתו סוג I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes אמריקנוס), (ii) TRITC שכותרתו סוג II AFP(Ca2 +-isoform עצמאי, צייד Longsnout), (iii) סוג פסיפיק-כחול שכותרתו III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B) ניתוח FIPA של שלושה AFPs היפראקטיביים שונים; (i) GFPמתויג Mp AFP_RIV (מרינומונס primoryensis), (ii) TRITC שכותרתו sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (iii) GFP מתויג TmAFP (Tenebrio molitor). בכל התמונות, ציר cהוא בניצב למישור העמוד. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 9. היחס של דפוס פלואורסצנטי המיוצר על ידי ניתוח FIPA מורפולוגיה גביש קרח מסוג אחר III AFP isoforms ומוטנטים11,21. A) (i) ניתוח FIPA של QAE-A16H מתויג GFP. (ii) מורפולוגיה של גביש קרח המיוצרת על ידי QAE-A16H. B) (i) ניתוח FIPA של nfeAFP11-V9Q בעל תווית TRITC. (ii) מורפולוגיה של גביש קרח המיוצרת על ידי nfeAFP11-V9Q. C) (i) ניתוח FIPA של nfeAFP11 מסוג בר עם תווית TRITC. (ii) מורפולוגיה של גביש קרח המיוצרת על ידי nfeAFP11 מסוג פראי. D) (i) ניתוח FIPA של nfeAFP6 מסוג בר בעל תווית TRITC. (ii) מורפולוגיה של גביש קרח המיוצרת על ידי nfeAFP6 מסוג פראי. כיווני ציר Cופסי קנה מידה הם כפי שצוין. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתוח שיטת תחריט הקרח על ידי צ'ארלס נייט לקביעת מטוסי קרח הקשורים ל- AFP קידם מאוד מחקרים על מנגנון כריכת הקרח על ידי AFPs. בעוד מבנים של AFPs יכול להיפתר על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן26,27 לא היתה שיטה ברורה להסיק את פני השטח המשלימים על הקרח שאליו AFP קשור. כאשר סוג I AFP מ flounder החורף היה מאופיין בתחילה, זה היה המשוערות להיקשר למישורי פריזמה העיקריים של קרח28. עם זאת, ניסויי תחריט הקרח פורצי הדרך של נייט מסוג I AFP הראו כי הם נקשרים למישורים פירמידליים של קרח13. תוצאה זו עוררה את קהילת המחקר AFP לחשוב מחדש על המנגנון של כריכת הקרח AFP ולקבוע בצורה מדויקת יותר את הפנים מחייב הקרח של AFPs9. ניסויי תחריט הקרח המקוריים של נייט נעשו באמצעות AFPs מקומיים שטוהרו מהאורגניזמים המייצרים AFP. עם התפתחות AFPs רקומביננטי והשימוש הגובר בתגי GFP, הייתה הזדמנות להרחיב את המחקרים האלה ל- AFPs רבים אחרים29.
הרעיון של שילוב צבעי חלבון פלואורסצנטי קוולנטי, כגון tetramethylrhodamine-5-(ו 6)-isothiocyanate (TRITC), לתוך הניתוח הגיע רק לאחר ההצלחה של ניתוחי FIPA AFP התמזגו GFP11. תגי החלבון הפלואורסצנטיים הכימריים והשינויים הכימיים על ידי צבעים קוולנטיים נצפו שלא ישפיעו על דפוסי כריכת הקרח של AFPs (איור 5). עם הראשון, GFP הוא התמזגו או N- או C- קצוות מסוף של AFPs, אשר לעתים קרובות הוסרו היטב מן IBS. כמו כן, ניתן להכניס מקשר גמיש בין ה- GFP ל- AFP המאפשר לדחוף את התג מפני הקרח. עם אסטרטגיית התיוג האחרונה, שרשראות הצד הטעונות שמגיבות עם צבעי הקוולנטיות נמצאות בדרך כלל על משטחים הרחק מ- IBS. אם האסטרטגיות המוצגות כאן עבור תיוג פלואורסצנטי AFPs לא עובד, מבוא של ציסטאין הרחק IBS לתגובה עם צבעים תגובתי תיול היא אפשרות נוספת30. על ידי נקיטת צעדים כדי להבטיח את תוויות פלורסנט אינם משפיעים על כריכת קרח AFP, כפי שנשפט על ידי פעילות היסטרזיס תרמית מורפולוגיה גביש קרח, אנו בטוחים כי ניתוח FIPA מראה ייצוג אמיתי של דפוסי קשירה קרח AFP, כפי שעשה בשיטת תחריט הקרח המקורית.
ישנם מספר יתרונות פלואורסצנטי תיוג AFPs עבור ניתוח FIPA. פחות זמן נדרש עבור ההליך מאז סובלימציה של קרח להדמיה של מטוסים הקשורים AFP אין צורך. שילוב של חלבון שכותרתו לתוך חצי הכדור ניתן לפקח במהלך הצמיחה של הקרח כדי להעריך את השלמת הניסוי ואת דפוס מחייב AFP ניתן לרשום בכל נקודה. זה מונע ניסויים ארוכים שלא לצורך, או השלמה מוקדמת של צמיחת קרח. התיוג הפלואורסצנטי מאפשר הדמיה ברורה יותר של תבנית מחייבת AFP מבעבר עם תחריט, כפי שניתן לראות בהשוואה לתוצאות משתי השיטות שהוחלו על סוג I וסוג III AFPs (איור 5). עם זאת, לאחר FIPA קרח תחריט יכול להתבצע בקלות על ידי הצבת חצי הכדור במקפיא במשך כמה שעות, כלומר, שני ניתוחים ניתן לעשות על אותה מדגם מאז ריכוזים דומים AFP נדרשים עבור שתי השיטות. יתרון חשוב של FIPA הוא היכולת לדמיין יותר מ- AFP אחד בעל תווית שונה על אותה חצי כדור קרח (איור 7). אפשרות זו שימושית להמחשת הבדלים במישורים המחייבים קרח AFP שנראו עם סוגים שונים של AFP, isoforms ומוטנטים של פעילות.
ניתוח FIPA כבר נעשה שימוש במספר מחקרים AFP. זה שימש כדי לתמוך בהשערה כי מחייב מטוס בסיס הוא ייחודי AFPs היפראקטיבי ונחוץ לפעילותם הגבוהה18. AFPs פעילים למדי נמצאו לא לקשור את המישור הבסיסי (איור 8A) אבל AFPs היפראקטיביים רבים מכסים לחלוטין את חצי הכדור הקרח, כולל מישור הבסיס של קרח (איור 8B)5,20,31. ניתוח FIPA שימש גם כדי ללמוד את הפונקציה של שאריות קרח מחייבות ספציפיות. לדוגמה, ניתוח FIPA נערך על מספר איזופורמים ומוטנטים מסוג III, שחלקם מונעים צמיחת קרח, וחלקם נמצאו רק לעצב קרח11,21,32. מהמחקרים נמצא כי שאריות מסוימות חשובות לשילוב ה-AFPs בקרח ואחרות חשובות בספציפיות מישור הקרח (איור 9).
שיטות אחרות לחקר דפוסי קשירה AFP על גבישי קרח יחיד כוללים תצפית ישירה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית16,33 ו microfluidics34. לשיטות אלה יש את היתרון של רגישות לדינמיקה של ההתקשרות של AFP לקרח וניטור של קרח בעיצוב בו זמנית עם הזיקה של AFP לקרח, אך הן פחות חזקות בהשוואה לשיטת FIPA בקביעת הזיקה למישורי הקרח. דינמיקה מולקולרית משמשת גם כדי לחזות את הספציפיות מחייבת מטוס הקרח של AFPs12,20,21,30,35. באמצעות ניתוח FIPA, יחד עם טכניקות זמינות אחרות, אנו לומדים את דפוסי מחייב מטוס הקרח של כל AFPs, את החשיבות של הרכב IBS בבחירת מישורי קרח, וכיצד מחייב של מטוסים ספציפיים קשורה לפעילות AFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
PLD מחזיקה בכיסא המחקר הקנדי להנדסת חלבונים. עבודה זו מומנה על ידי מענק מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות ל- PLD. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק בסיוע למחקר מדעי של האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מס '23310171) ומהמוסד היפני לקידום מחקר טכנולוגי (BRAIN). אנו מודים לד"ר כריס מרשל ומייק קויפר על עבודה חלוצית שהובילה ל-FIPA. אנו גם מודים לד"ר סאקה טסודה על שסיפקה מתקנים לחלק מהעבודה הזו ולט"ר לורי גרהאם על שהקימה את מסנני עירור האור והפליטה הפלואורסצנטיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
