Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Antifriz proteinleri (AFP'ler) buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için belirli buz düzlemlerine bağlanır. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin belirlenmesi için orijinal buz aşındırma yönteminin bir modifikasyonudur. AFP'ler floresan olarak etiketlenir, makroskopik tek buz kristallerine dahil edilir ve UV ışığı altında görselleştirilir.

Abstract

Antifriz proteinleri (AFP'ler), iç buz büyümesini önlemek veya yavaşlatmak için çeşitli soğuk sert organizmalarda ifade edilir. AP'ler buz bağlayıcı yüzeylerinden belirli buz düzlemlerine bağlanırlar. Floresan bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA) analizi, AP'lerin bağlandığı buz düzlemlerini belirlemek için kullanılan değiştirilmiş bir tekniktir. FIPA, AFP'ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal buz aşındırma yöntemine dayanmaktadır. Kısaltılmış deneysel sürede daha net görüntüler üretir. FIPA analizinde, AFP'ler floresan olarak bir kimerik etiket veya kurvalent boya ile etiketlenir, daha sonra yavaşça bir yarımküreye önceden biçimlendirilmiş ve a ve ceksenlerini belirlemeye yönelik makroskopik tek bir buz kristaline dahil edilir. AFP'ye bağlı buz yarımküresi, spesifik olmayan ışığı engellemek için filtreler kullanarak AFP'ye bağlı düzlemleri görselleştirmek için UV ışığı altında görüntülenir. AFP'lerin floresan etiketlemesi, AFP adsorpsiyonunun buza gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Etiketlerin, AFP'lerin bağlandığı uçakları etkilemediği bulunmuştur. FIPA analizi ayrıca, bağlama düzlemlerini ayırt etmeye yardımcı olmak için aynı tek buz kristaline birden fazla farklı etiketli AFP bağlama seçeneği sunar. FIPA'nın bu uygulamaları, AFP'lerin büyümesini durdurmak için buza nasıl bağlanıp bağlanmasını ve birçok AFP üreten organizmanın neden birden fazla AFP izoformunu ifade ettiğini anlamamızı ilerletmeye yardımcı oluyor.

Introduction

Antifriz proteinlerinin (AFP) üretimi, buz yüklü ortamlarda yaşayan bazı organizmaların önemli bir hayatta kalma mekanizmasıdır. Yakın zamana kadar, AFP'lerin tek işlevinin dolaşımı engelleyecek, doku hasarına ve ozmotik strese neden olacak iç buz kristallerinin büyümesini önlemek veya yavaşlatmak olduğu düşünülüyordu. Balık gibi herhangi bir donma derecesini tolere edemeyen organizmalar, buz kristali büyümesini tamamen engellemek için AFP'leri ifade eder1. Çim gibi diğerleri, donmaya karşı dayanıklıdır ve dokularında büyük buz kristallerinin oluşumunu azaltan buz rekristalizasyonunu inhibe etmek için AFP'leri ifade eder2. Düşük sıcaklıktaki membranların stabilizasyonu, AFP'ler için önerilen başka bir işlevdir3. Son zamanlarda, bir Antarktika bakterisinin AFP'si için yeni bir rol önerildi, Marinomonas primoryensis, buzla kaplı acı göllerden4. Bu AFP, oksijen ve besin maddelerine daha iyi erişim için bakteriyi buza tutturdığı düşünülen çok daha büyük bir adhesinproteini 5'inbir parçasıdır 6 . Diğer mikropların, içinde yaşadıkları buzun yapısını değiştirebilecek AP'leri salgıladığı bilinmektedir7.

AFP'ler bazı balıklarda, böceklerde, bitkilerde, alglerde, bakterilerde, diatomlarda ve mantarlarda bulunmuştur. Çeşitli durumlarda farklı soydaşlardan evrimleriyle tutarlı son derece farklı dizilere ve yapılara sahiptirler; ve yine de hepsi buza bağlanır ve adsorpsiyon-inhibisyon mekanizması ile büyümesini engeller8. AP'lerin her biri, buz bağlama bölgesi (IBS) görevi görür. Bunlar tipik olarak9-11yüzey kalıntılarının bölgeye yönlendirilmiş mutajenisi ile tanımlanmıştır. IBS, su moleküllerini belirli buz düzlemleriyle eşleşen buz benzeri bir desende düzenlemek için hipotezlenmiştir. Böylece AFP ligandını bağlamadan önce oluşturur5, 12. Buz uçakları Miller endeksleri tarafından tanımlanabilir ve farklı AFP'ler farklı düzlemlere bağlanabilir. Bu nedenle, kış flounder'ından tip I AFP, 20-21 piramit düzlemlerinebağlanır 13, tip III AFP, bileşik bir buz bağlayıcı yüzey11,14kullanarak hem birincil prizma hem de piramit düzlemlerini bağlar, hiperaktif bir AFP olan ladin budworm AFP ise hem birincil hem de bazal uçaklara aynı andabağlanır 15,16. MpAFP gibi diğer hiperaktif AFP'ler, tek buz kristali yarımkürelerinin tam kapsamı ile gösterildiği gibi birden fazla buz düzlemine bağlanır5,17. Hiperaktif AFP'lerin bazal düzlemi ve diğer uçakları bağlama yeteneğinin, orta derecede aktif AFP'ler18üzerinde 10 kat daha yüksek aktivitelerini hesaba katabileceği varsayılmaktadır. Hiperaktif AFP'lerin verimliliği iyi belgelenmiş olsa da, birden fazla buz düzlemine bağlanma yetenekleri hala anlaşılamamıştır.

AFP'ye bağlı buz uçaklarını belirlemek için orijinal yöntem Charles Knight13,19tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntemde, makroskopik tek bir buz kristali içi boş bir metal çubuğa (soğuk parmak) monte edilir ve gazsız suyla dolu yarım küreye batırılarak yarımküreye oluşturulur. Daha sonra, yarımküre seyreltilmiş bir AFP çözeltisine batırılır ve AFP çözeltisinden buz kristali yarımküresine soğuk parmaktan dolaşan etilen glikolün sıcaklığı tarafından kontrol edilen birkaç saat içinde bir buz tabakası yetiştirilir. Buz kristali çözeltiden çıkarılır, soğuk parmaktan ayrılır ve -10 ila -15 ° C dondurucu odasına yerleştirilir. Yüzey, antifriz protein çözeltisinin donmuş yüzey filmini çıkarmak için keskin bir bıçakla kazınmıştır ve buz kristalinin en az 3 saat boyunca yüce olmasına izin verilir. Süblimasyondan sonra, AFP'ler tarafından bağlanan buz düzlemleri, artık proteinden elde edilen beyaz kazınmış desenler olarak görülebilir. Buz yarımküre, buzun bazal ve prizma düzlemlerini bulmak ve kazınmış yamaların Miller endekslerini belirlemek için ceksenine ve bir-eksenlerine yönlendirilebilir.

Burada, FLORESAN bazlı buz düzlemi benzeşimi (FIPA)11olarak adlandırdığımız bir yöntem olan AFP'ye bağlı buz düzlemlerini belirlemek için orijinal yöntemin bir değişikliğini açıklıyoruz. AFP'ler, yeşil floresan protein (GFP)11,16,17,20gibi bir kimerik etiketle veya AFP5,21'eyaygın olarak bağlı bir floresan boya ile floresan olarak etiketlenmiştir. Floresan etiketli AFP'ler tek bir buz kristaline adsorbe edilir ve orijinal buz aşındırma deneyleriyle aynı deneysel prosedür kullanılarak büyür. AFP'nin büyüyen buz yarımküreye bağlanmasının boyutu, deney boyunca ultraviyole (UV) lamba kullanılarak izlenebilir. Deney tamamlandıktan sonra, yarımküre doğrudan soğuk parmaktan çıkarılabilir ve süblimasyon olmadan görüntülenebilir. Bununla birlikte, istenirse, yarımküre geleneksel bir buz kazımasını görselleştirmek için yüce bırakılabilir. FIPA metodolojisine getirilen değişiklikler, geleneksel buz aşındırma protokolünü birkaç saat kısaltır. Ayrıca, AFP'ye bağlı buz düzlemlerinin çakışan desenlerini görselleştirmek için her biri farklı bir floresan etikete sahip birkaç AFP'yi aynı anda görüntüleme potansiyeli vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Büyüyen Tek Buz Kristalleri

  1. Etilen glikol soğutma banyosuna uyan ve üzerinde yüzebilen temiz bir metal tava (15 cm çapında, 4,5 cm yüksekliğinde) alın.
  2. Bir borudan kesitler keserek polivinil klorür (PVC) silindirik kalıplar (4,5 cm çapında, 3-4 cm yüksekliğinde, 4 mm kalınlığında) hazırlayın.
    1. Bir tarafta (1 mm genişliğinde, 2 mm yüksekliğinde) bir çentik kesin (Şekil 1A).
    2. Tavaya rahatça sığabilecek kadar kalıp hazırlayın (Şekil 1B).
      Not: Bir çalışma polivinil alkolün (PVA) buz çekirdeğini etkileyebileceğini göstermiştir22. Ancak açık kalıp PVC sistemimizde atipik buz oluşumu sorunları ile karşılaşmadık.
  3. Çentik kesilmiş yüzey olan her kalıbın alt yüzey halkasına hafif bir vakum gresi filmi uygulayın. Bu yağlanmış, çentikli yüzeyi, çentikler tavanın merkezinden uzağa yönlendirilmiş metal bir tavaya kapatın. Çentikleri gresle doldurmamaya veya engellememeye dikkat edin.
  4. Tava ortasına, ancak kalıpların dışına 0,22 μm filtrelenmiş ve gazsız/deiyonize su ekleyin ve suyun çentiklerden kalıplara yavaşça girmesini sağlar. Herhangi bir kabarcık tanıtmamaya dikkat edin. Su tabakası yaklaşık 5 mm derinliğinde olmalıdır.
  5. Tavayı -0,5 °C'ye kadar soğutulmuş sıcaklık kontrollü etilen glikol banyosuna yerleştirin. Tava mükemmel seviyede olmalı. Gerekirse tava kenarlarına balast ağırlıkları ekleyin.
  6. Tava ve su -0,5 °C'ye ulaştıktan sonra, tava ortasına kalıpların dışına küçük bir buz parçası ekleyin.
    1. Bu, tava boyunca ve kalıplara aşırı solumuş suda buz büyümesini çekirdekleyecektir. Her kalıbın altındaki küçük çentik, sadece bir buz kristalinin yayılmasına izin verir ve bu da her kalıpta tek bir buz kristali ile sonuçlanır.
    2. Bir buz tabakası oluşturmak için bir gecede kuluçkaya yaslanın.
  7. Sonraki üç gün boyunca her kalıba günde bir kez 13 ml 4 °C gazsız/deiyonize su ekleyin ve etilen glikol banyosunun sıcaklığını ilk gün -0,8 °C'ye, ikinci günde -1,1 °C'ye ve üçüncü günde -1,5 °C'ye düşürün.
    1. Gece boyunca bu sıcaklıklarda kuluçkaya yaslanın.
    2. Dördüncü güne kadar, kalıplar tamamen buzla doldurulmalıdır.
  8. Kalıpları tavadan çekin, buz kristallerini kalıplardan dışarı itin ve tartım teknesi gibi temiz bir yüzeyde, elleçlemeden önce yaklaşık 1 saat boyunca -20 ° C dondurucuda saklayın.
  9. Birçok küçük tek buz kristali hazırlamak yerine, knight23tarafından açıklandığı gibi sabit bir sıcaklık inkübatöründe hacim olarak birkaç litrelik büyük bir tek buz kristali hazırlanabilir. Büyük buz kristali -15 ila -20 ° C dondurucuda tutulursa bir yıl veya daha fazla saklanabilir. Tek kristalin kısımları gerektiğinde bir testere ile buz bloğundan kesilebilir.

2. Buz Kristalinin Tekilliğinin ve Yönünün Belirlenmesi

  1. Kalıptan atılan buzun, iki çapraz polaroid arasında bir dondurucu odasında gözlemleyerek tek bir kristal olup olmadığını belirleyin (Şekil 1D).
    1. Buz kristali tek ise, çatlak veya süreksizlik görülmemeli ve ışık yönü buz kristali içinde değişmemelidir.
      Not: Dondurucu oda yoksa, bunun yerine soğuk bir oda gerekli tüm adımlarda kullanılabilir, hızlı çalışmak ve buzları idareli bir şekilde işlemek için dikkatli olun.
  2. Buz birefringence nedeniyle, kişi aynı anda cekseninin yönünü belirleyebilir. Yönlendirmeyi belirlemek için aşağıdaki bilgileri kullanın:
    1. Cekseni olay ışığına tam olarak paralel olduğunda, teoride, çapraz polaroidlerden hiçbir ışık geçmeyecek. Olay ışığı ceksenine paralel olarak hafifçe başlıklandırılırsa, çapraz polaroidler arasında döndürüldüğünde kristalden tek tip çok renkli bir ışık spektrumu iletilir. Bu düzgün geçirgenlik, cekseni24boyunca buz Ih'nin optik hareketsizliğinden kaynaklanır. Buz kristalinin bazal düzlemi ceksenine göre normaldir.
    2. Cekseni olay ışığına paralel olarak daha uzak olduğunda ve buz kristali çapraz polaroidler arasında döndürüldüğünde, iletilen ışık kristalin her 90° dönüşüyle% 0-100 geçirgenlik arasında değişir.
    3. En yaygın olarak, cekseni silindirik buz kristalinin dairesel düzlemine normal olacaktır.
  3. Buzkristalini alüminyum folyoya sıkıca sararak, bazal düzlemdeki buza bir iğne ile küçük bir delik açarak (ceksenine normal) ve 20 dakika boyunca vakumun altına yerleştirerek yapılan25 numaralı buz çukurluğu ile a -baltaların yönünü belirleyin.
    1. Bu tedavi, a -eksenlerin altı taraflı yıldızın köşelerinden geçtiği bazal düzlemde altıgen simetri ile birkazık üretecektir (Şekil 2A).
    2. İstenirse, buz kristali sırasıyla soğuk parmağa dik birincil veya ikincil prizma düzlemi ile monte etmek için altıgen bir tarafa paralel veya dik bir testere ile kesilebilir (Şekil 3).

3. Floresan Etiketli Antifriz Proteinlerinin Tek Bir Buz Kristaline Adsorpsiyonu

  1. Önce kristalin tepesine bir boşluk sıkarak soğuk parmağa (Şekil 1C) tek bir buz kristali monte edin. Bunu yapmak için, buzun biraz farklı çapta iki alüminyum çubukla eritmesini değiştirin, ancak soğuk parmağın çapına benzer, soğuk parmağın sığabileceği boşluğu oluşturmak için.
  2. Soğuk parmağı -0,5 °C'ye soğutun, buz boşluğuna yerleştirin ve buz kristalini metale donana kadar yerinde tutun (Şekil 2B). Kristali parmağa bağlarken hava kabarcıklarından kaçının, çünkü parmaktan çubuğa etkili ısı transferini engeller.
  3. Buz kristalinin çapının yaklaşık iki katı olan yarım küre bir kabı filtrelenmiş deiyonize su veya tamponla doldurun, yaklaşık 4 °C'ye soğutun. Soğuk parmakla bağlanmış buz kristalini bardağa batırın ve fazla suyu veya tamponu, buz kristalinin üst kısmının sıvı tabaka ile yaklaşık olarak düz olması ve buzun fincan duvarlarına dokunmaması için çıkarın.
    1. Kabı yalıtımla örtün ve sıcaklığı -5 °C'ye düşürin.
    2. Buz kristalinin bir yarımküreye oluşması için yaklaşık 1 saat bekleyin ve durumunu yaklaşık her 20 dakikada bir kontrol edin (Şekil 2C).
    3. Buz, buz kristalini eriterek ve büyüterek yarım küre kabının şeklini alacaktır, ancak fincan duvarlarına dokunmak asla aşırı büyümemelidir. Duvar ve yarımküre arasında en az 1 cm boşluk olmalı ve soğuk parmak buzdan çıkıntı yapmamalı.
  4. Kabı buz kristalinden çıkarın ve floresan protein çözeltisini 25-30 ml'lik son hacme ve istenen analiz konsantrasyonuna ekleyin, fincandaki toplam sıvı hacmini değiştirmemeye dikkat edin. Tipik bir AFP konsantrasyonu 0.1 mg/ml'dir.
    1. Buz kristalini bardağa yeniden yerleştirin, böylece buz kristalinin üstü sıvı ile aynı seviyededir ve buz kristali fincan duvarlarına dokunmaz (Şekil 2D).
    2. Soğuk parmak sıcaklığını -8 °C'ye bırakın ve protein çözeltisinin 2-3 saat boyunca buz kristaline donmasını ve çözeltiyi sık sık karıştırmasını bırakın. Protein çözeltisinden oluşan buz, buz büyümesini durdurmadan önce en az 5 mm olmalıdır.
  5. Buz kristalini soğuk parmağa bağlıyken bardaktan çıkarın. Soğutucuyu soğuk parmaktan 0 °C'nin hemen üzerine ısıtarak buzu ikincisinden ayırın ve buz kristali eriyene kadar bekleyin.
  6. Kristal düz tarafı, yeni oluşan buza dokunmamaya dikkat ederek tartım kabı gibi temiz bir yüzeye yerleştirin ve teslim etmeden önce en az 20 dakika boyunca -20 ° C'de saklayın.

4. Antifriz proteinine bağlı Buz Düzlemlerinin Görselleştirilmesi

  1. Floresan görselleştirme, karanlık bir dondurucuda veya soğuk bir odada, buz kristali düz tarafını, floresan etiketi ve kamera emisyon filtrelerini diğer spesifik olmayan ışıkları engellemek için heyecanlandırmak için dalga boyuna özgü uyarılma filtrelerine sahip lambaların altına yerleştirerek yapılır. Desene göre, AFP'lere bağlı buz düzlemleri tahmin edilebilir (Şekil 4).
  2. Dalga boyuna özgü ışıklar mevcut değilse, bunun yerine bir UV ışık kutusu kullanılabilir.
  3. Geleneksel buz etches, buz yarımküresinin en az 3 saat boyunca -20 °C'de yüce olmasına izin vererek de gerçekleştirilebilir, bundan sonra artık protein tozu buz yüzeyinde görülebilir hale gelebilir (Şekil 5).
  4. 2.3. adım, tamamlanmış buz yarımkürenin a-eksenlerinin yönünü belirlemek için tekrarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tek buz kristalinin hazırlanması ve montajı, hataların en sık yapıldığı FIPA prosedürünün iki adımıdır. Hazırlanan buz kristalinin tek olup olmadığının belirlenmesi, protokol bölümünün 2.1. FIPA analizi için çok kanallı bir buz kristali kullanılırsa, sonuç, tutarlı bir bağlama deseni olmadan yarımküredeki AFP'lerin süreksiz bağlanması olacaktır (Şekil 6B). Buz kristali arayüzleri, AFP'nin bağlandığı buz düzlemlerinin etrafında bulunuyorsa, nihai sonuç yorumlanabilir olmayabilir. Bu nedenle, buz kristali bir sonraki adımlara geçmeden önce tekillik açısından dikkatlice kontrol edilmelidir. FIPA analizi için tek bir buz kristaline sahip olma olasılığını artırmak için aynı anda birkaç tane yapılmalıdır.

Bir diğer yaygın hata, montaj sırasında kristal yüzleri soğuk parmakla yanlış hizalamaktır. Birincil veya ikincil prizma yüzlerini soğuk parmağa dik olarak monte etmek için, tek buz kristali önce buz çukurluğu ile yönlendirilmeli, daha sonra protokol bölümünün 2.3 adımında belirtildiği gibi yıldız şeklindeki kazığın (Şekil 2A ve 3)yönüne göre kesilmelidir. Buz kristali yanlış hizalanmışsa, nihai sonuç, yarımkürenin ekvatorunun buz düzlemlerinin simetrisiyle hizalanmayacağı bir yarımküre üretecektir (Şekil 6C). Bu yorumlanabilir bir sonuç olmasına rağmen, yarımkürenin en büyük çevresi ekvatorda olduğu için doğru hizalanmış bir buz kristalinden daha az bilgilendirici olacaktır (Şekil 4).

Figure 1
Şekil 1. Tek buz kristalleri yetiştirmek ve monte etmek için ekipman. A)PVC kalıplar. B) ETILEN glikol banyosunda PVC kalıplarla tava yapın. C) Beyaz okla gösterilen etilen glikol akışına sahip soğuk parmak. Beyaz kesik çizgi soğuk parmağın iç duvarını gösterir. D) Tek bir buz kristalini yönlendirmek için çapraz polaroidlerin şeması. Işık kaynağı sarı, çapraz polaroidler gri ve tek buz kristali beyazdır. Polaroidlerin (gri oklar) ve buz kristali yönünün (kırmızı oklar) yönü belirtilir. Soldan sağa buz kristali, cekseninin alt polaroide, 45 ° alt polaroide dik ve olay ışığına paralel olacak şekilde yönlendirilir. Çapraz polaroidler ve buz olsa da geçen ışık, buz kristalinin yönüne bağlı olarak üst polaroidden karanlık, açık veya hafifçe çok renkli görünecektir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 2
Şekil 2. FIPA için buz kristali hazırlanıyor. A)Altıgen simetri ile buz kazığı ile eksen yönelimlerinin belirlenmesi. Kristalin bazal düzlemi sayfanın düzlemine paraleldir. B)Tek buz kristalinin soğuk parmağa montesi. C) Yarımküreye oluştuktan sonra buz. D) Buz yarımküre protein çözeltisi ile dolu yarım küre kabına batırılmıştır. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 3
Şekil 3. Oryantasyona göre buz kristali montajı. A)(i) bazal düzlem ile buz montaj şeması, (ii) birincil prizma düzlemi ve (iii) soğuk parmağa dik ikincil prizma düzlemi. Oryantasyonlar için (ii) ve (iii) buz kristali şekilde gösterildiği gibi ikiye kesilmelidir. B)(i) bazal düzlem ve (ii) soğuk parmağa dik bir birincil prizma düzlemi ile buz kristallerini monte ettikten sonra Pasifik mavi etiketli tip III nfeAFP8'in FIPA sonuçları. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 4
Şekil 4. FIPA analiz sonuçlarından AFP'ye bağlı düzlemler yorumluyor. A)Ih buzunun bağlı düzlemlerinin temsili; ve B) tek buz kristali soğuk parmağa dik bir birincil prizma düzlemi ile monte edildiğinde karşılık gelen FIPA analiz sonucu. Paneller (i) bazal düzlemi, (ii) birincil prizma düzlemini, (iii) ikincil prizma düzlemini, (iv) a-eksenlerle hizalanmış piramit düzlemini ve (v) a-eksenlerine piramit düzlem uzaklığını temsil eder. C) Piramit düzlemlerini bağlayan AFP'lerin çözeltisinde yetiştirildiğinde tek bir buz kristalinin morfolojisi i) a-eksenlere hizalanmış ve ii) a-eksenlerden uzaklık. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 5
Şekil 5. Geleneksel buz etches ile FIPA karşılaştırması. A) (i) Kış flounder(Pseudopleuronectes americanus)tarafından üretilen I AFP (HPLC6 isoform) tipi geleneksel gravür, başlangıçta Knight ve ark.,(1991) tarafından üretilmiş olarak gösterilmiştir. (ii) TRITC ile etiketlenmiş aynı proteinin ilgili FIPA analizi. B) (i) III nfeAFP11 tipine (Japon yılan balığı somurtması Zoarces elongatuskner'dan)dörtlü IBS mutantının (V9Q / V19L / G20V / I41V) geleneksel gravürü21. (ii) TRITC ile etiketlenmiş aynı proteinin ilgili FIPA analizi. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 6
Şekil 6. Yaygın FIPA analiz hatalarından kaynaklanan yarım küreler. Analizler GFP etiketli tip III HPLC12-A16H üzerinde yapılmıştır. A)Karşılaştırma için en uygun FIPA sonucu. Buz kristali, soğuk parmağa dik birincil prizma düzlemi ile monte edildi. B)Birden fazla kristalden oluşan bir buz yarımküre kullanılarak yanlışlıkla yapılan FIPA analizi. C) Yanlış hizalanmış tek bir buz kristali üzerinde yapılan FIPA analizi. İkincil prizma düzlemi soğuk parmağa tam olarak dik monte edilmiş değildi. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 7
Şekil 7. Farklı AFP'lerin buz bağlama desenlerini karşılaştırmak için FIPA analizini kullanma. Pasifik mavi etiketli tip III nfeAFP8, TRITC etiketli tip I AFP ile birleştirildi ve tek bir FIPA analizi yapıldı. A)Yalnızca III nfeAFP8 tipi görselleştirme. B)Yalnızca I AFP türünün görselleştirilmesi. C) III nfeAFP8 tipinin görselleştirilmesi ve I AFP tipi birlikte. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 8
Şekil 8. Orta derecede aktif ve hiperaktif AP'lerin FIPA'sı. A)Üç farklı orta derecede aktif balık ABA'sının FIPA analizi; (i) TRITC etiketli tip I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus),(ii) TRITC etiketli tip II AFP(Ca2+-bağımsız isoform, Longsnout kaçak avcı), (iii) Pasifik mavi etiketli tip III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B)Üç farklı hiperaktif AFP'nin FIPA analizi; (i) GFP etiketli MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (ii) TRITC etiketli sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (iii) GFP etiketli TmAFP (Tenebrio molitor). Tüm görüntülerde, c eksenisayfanın düzlemine diktir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Figure 9
Şekil 9. FIPA analizi ile üretilen floresan desenin farklı tip III AFP izoformları ve mutantlarının buz kristali morfolojisi ile ilişkisi11,21. A) (i) GFP etiketli QAE-A16H'nin FIPA analizi. (ii) QAE-A16H tarafından üretilen buz kristali morfolojisi. B) (i) TRITC etiketli nfeAFP11-V9Q'nun FIPA analizi. (ii) nfeAFP11-V9Q tarafından üretilen buz kristali morfolojisi. C) (i) TRITC etiketli vahşi tip nfeAFP11'in FIPA analizi. (ii) Vahşi tip nfeAFP11 tarafından üretilen buz kristali morfolojisi. D) (i) TRITC etiketli vahşi tip nfeAFP6'nın FIPA analizi. (ii) Vahşi tip nfeAFP6 tarafından üretilen buz kristali morfolojisi. Cekseni yönelimleri ve ölçek çubukları belirtildiği gibidir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

AFP'ye bağlı buz uçaklarının belirlenmesi için Charles Knight tarafından buz aşındırma yönteminin geliştirilmesi, AFP'ler tarafından buz bağlama mekanizması üzerinde büyük ölçüde ileri çalışmalar. AFP'lerin yapıları X-ışını kristalografisi26,27 ile çözülebilirken, AFP'nin bağlı olduğu buz üzerindeki tamamlayıcı yüzeyi çıkarmak için belirgin bir yöntem yoktu. Kış flounder tip I AFP başlangıçta karakterize edildiğinde, buz birincil prizma düzlemleri bağlamak için hipotezedildi 28. Bununla birlikte, Knight'ın I AFP tipinin çığır açan buz aşındırma deneyleri, piramit buz13uçaklarına bağlandıklarını gösterdi. Bu sonuç, AFP araştırma topluluğunu AFP buz bağlama mekanizmasını yeniden düşünmeye veAFP'lerinbuz bağlayıcı yüzünü daha doğru bir şekilde belirlemeye teşvik etti 9 . Knight'ın orijinal buz aşındırma deneyleri, AFP üreten organizmalardan arındırılmış yerel AFP'ler kullanılarak yapıldı. Rekombinant AFP'lerin geliştirilmesi ve GFP etiketlerinin artan kullanımı ile, bu çalışmaları diğer birçok AFP'ye genişletme fırsatı vardı29.

Tetrametrinhodamin-5-(ve 6)-izotiyosiyanat (TRITC) gibi kovalent floresan protein boyalarını analize dahil etme fikri, ancak GFP ile kaynaşmış AFP FIPA analizlerinin başarısından sonra geldi11. Kimerik floresan protein etiketleri ve katalizyonel boyalar tarafından yapılan kimyasal modifikasyonların AFP'lerin buz bağlayıcı kalıplarını etkilemediği görülmüştür (Şekil 5). İlkiyle, GFP, genellikle IBS'den iyi çıkarılan AFP'lerin N veya C- terminal uçlarına kaynaşır. Ayrıca, GFP ve AFP arasına esnek bir bağlayıcı takılarak etiketin buz yüzeyinden uzağa itilmesine izin verilebilir. İkinci etiketleme stratejisi ile, katvalent boyalarla reaksiyona sokan yüklü yan zincirler genellikle IBS'den uzak yüzeylerdedir. Burada floresan olarak etiketlenen AFP'ler için sunulan stratejiler işe yaramazsa, tiyol reaktif boyalarla reaksiyon için IBS'den uzakta bir sistein tanıtımı başka bir seçenektir30. Floresan etiketlerin, termal histerezis aktivitesi ve buz kristali morfolojisi ile değerlendirildiği gibi, AFP buz bağlamayı etkilememesini sağlamak için önlemler alarak, FIPA analizinin orijinal buz aşındırma yönteminde olduğu gibi AFP buz bağlama desenlerinin gerçek temsilini gösterdiğinden eminiz.

FIPA analizi için AFP'leri floresan etiketlemenin çeşitli yararları vardır. AFP'ye bağlı düzlemlerin görselleştirilmesi için buzun süblimasyonuna gerek olmadığından prosedür için daha az zaman gerekir. Etiketli proteinin yarımküreye dahil edilmesi, deneysel tamamlanmayı değerlendirmek için buzun büyümesi sırasında izlenebilir ve AFP bağlayıcı desen herhangi bir noktada kaydedilebilir. Bu, gereksiz yere uzun deneyleri veya buz büyümesinin erken tamamlanmasını önler. Floresan etiketleme, her iki yöntemden gelen sonuçların tip I ve tip III AFP'lere (Şekil 5)karşılaştırılmasında görüldüğü gibi, gravür ile daha önce mümkün olandan daha net AFP bağlama deseni görselleştirmesine izin verir. Bununla birlikte, FIPA sonrası buz kazığı, yarımküreyi birkaç saat boyunca bir dondurucuya yerleştirerek kolayca yapılabilir, yani her iki yöntem için de benzer AFP konsantrasyonlarına ihtiyaç duyulduğundan, her iki analiz de aynı numune üzerinde yapılabilir. FIPA'nın değerli bir avantajı, aynı buz yarımküresinde birden fazla farklı etiketli AFP'yi görselleştirme yeteneğidir (Şekil 7). Bu, farklı AFP tipleri, izoformları ve aktivite mutantları ile görülen AFP buz bağlayıcı düzlemlerdeki farklılıkları göstermek için yararlıdır.

FIPA analizi zaten çeşitli AFP çalışmalarında kullanılmıştır. Bazal düzlem bağlamanın hiperaktif AFP'lere özgü olduğu ve yüksek aktiviteleri için gerekli olduğu hipotezini desteklemek için kullanılmıştır18. Orta derecede aktif AFP'lerin bazal düzlemi bağlamadığı bulunmuştur (Şekil 8A) ancak birçok hiperaktif AFP, bazal buz düzlemi de dahil olmak üzere buz yarımküresini tamamen kaplar (Şekil 8B)5,20,31. FIPA analizi, belirli buz bağlayıcı kalıntıların işlevini incelemek için de kullanılmıştır. Örneğin, FIPA analizi, bazıları buz büyümesini önleyen ve bazıları sadece buz11,21,32şekillendirdiği tespit edilen çeşitli tip III izoformlar ve mutantlar üzerinde yapılmıştır. Çalışmalardan, AFP'lerin buza dahilinde belirli kalıntıların önemli olduğu ve diğerlerinin buz düzlemi özgüllüğünde önemli olduğu bulunmuştur (Şekil 9).

Tek buz kristalleri üzerinde AFP bağlayıcı desenleri incelemek için diğer yöntemler floresan mikroskopi16,33 ve mikroakışkanlar34ile doğrudan gözlem içerir. Bu yöntemler, AFP'nin buza bağlanma dinamiği ve AFP'nin buza yakınlığı ile buz şekillendirme simültaneitesinin izlenmesine karşı duyarlılık avantajına sahiptir, ancak buz düzlemlerine olan yakınlığı belirlemede FIPA yöntemine kıyasla daha az sağlamdır. Moleküler dinamikler ayrıca12,20,21,30,35AFP'lerin buz düzlemi bağlama özgüllüğünü tahmin etmek için de kullanılmaktadır. FIPA analizini kullanarak, mevcut diğer tekniklerle birlikte, her BIR AFP'nin buz düzlemi bağlama kalıplarını, buz uçaklarının seçilmesinde IBS'nin bileşiminin önemini ve belirli uçakların bağlanmasının AFP etkinliğiyle nasıl ilişkili olduğunu öğreniyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Acknowledgments

PLD, Protein Mühendisliğinde Kanada Araştırma Başkanı'na sahiptir. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden PLD'ye verilen bir hibe ile finanse edildi. Bu çalışma ayrıca Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (No. 23310171) ve Japonya Biyo-odaklı Teknoloji Araştırma İlerleme Kurumu'ndan (BRAIN) bilimsel araştırmalar için bir Grant-in-Aid tarafından desteklendi. Dr. Chris Marshall ve Mike Kuiper'e FIPA'ya yol açan öncü çalışmalar için minnettarız. Ayrıca, bu çalışmaların bazıları için olanak sağladığı için Dr. Sakae Tsuda'ya ve floresan ışık ekscitasyon ve emisyon filtrelerini kurduğu için Dr. Laurie Graham'a minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Tags

Kimya Sayı 83 Malzemeler Yaşam Bilimleri Optik antifriz proteinleri Buz adsorpsiyonu Floresan etiketleme Buz kafes düzlemleri buz bağlayıcı proteinler Tek buz kristali
Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter