Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En protokol til at inficere Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans har vist sig som en ny genetisk model til at studere vært-patogen interaktioner. Her beskriver vi en protokol til at inficere C. elegans med Salmonella typhimurium kombineret med den dobbelt-strenget RNAi interferens teknik til at undersøge, hvilken rolle værtsgener i forsvaret mod Salmonella infektion.

Abstract

I det sidste årti, C. elegans er opstået som et invertebrat organisme for at studere samspillet mellem værter og patogener, herunder værtens forsvar mod gram-negativ bakterie Salmonella typhimurium. Salmonella etablerer vedvarende infektion i tarmen C. elegans og resulterer i tidlig død af inficerede dyr. Der er identificeret en række immunitetsstandarder mekanismer i C. elegans at forsvare sig mod Salmonella-infektioner. Autophagy en evolutionært bevaret lysosomale nedbrydningsvej, har vist sig at begrænse Salmonella replikation i C. elegans og pattedyr. Her er en protokol beskrevet at inficere C. elegans med Salmonella typhimurium, hvor ormene udsættes for Salmonella i en begrænset tid, svarende til salmonellainfektion hos mennesker. Salmonella infektion betydeligt forkorter levetiden for C. elegans </ Em>. Brug af afgørende autofagi genet BEC-1 som et eksempel, kombinerede vi denne infektion metode med C. elegans RNAi fodring tilgang og viste denne protokol kan bruges til at undersøge funktionen af C. elegans værtsgener i forsvaret mod Salmonella infektion. Da C. elegans hele genomet RNAi biblioteker er tilgængelige, protokollen gør det muligt at foretage omfattende screene for C. elegans gener, der beskytter mod salmonella og andre tarmpatogener hjælp genom-dækkende RNAi biblioteker.

Introduction

Den fritlevende jord rundorm Caenorhabditis elegans er en enkel og genetisk medgørlig model organisme bruges til at studere mange biologiske spørgsmål. C. elegans findes overvejende som selvstændige befrugtende hermafroditter. Hanner spontant dannes af ikke-disjunktion af X-kromosomet under gametogenese 1,2. Ved tilstedeværelse af rigelig mad, C. elegans løbende at udvikle gennem fire larvestadier til voksen. Temperatur også indflydelse C. elegans udvikling; hurtigere udvikling er observeret ved højere temperaturer. I laboratoriet C. elegans er dyrkes ved en standard temperatur på 20 ° C på agarplader med seedede bakterie Escherichia coli (stamme OP50) som fødevarer 1,2.

I det sidste årti, C. elegans har vist sig som en hvirvelløse organisme for at studere vært-patogen interaktioner 3-5. I naturen C. elegans spiser bakterier sin nutrient kilde 1,2. Dens normale bakterielle laboratorium mad, OP50, let kan erstattes med andre patogener til at undersøge samspillet mellem C. elegans og helst valgt patogen. Under disse betingelser, tarmen er det primære sted for infektionen. Faktisk har vist en bred vifte af bakterielle patogener, letalt inficere C. elegans 3-5.

Gram-negative bakterie Salmonella er en gastrointestinal patogen, der forårsager menneskelig fødevarebåren sygdom på verdensplan 6,7. C. elegans er en god model vært for Salmonella typhimurium, da denne bakterie replikater og udviser vedvarende tarminfektioner 8-10. C. elegans er blevet anvendt til at identificere både hidtil ukendt og tidligere kendt Salmonella virulensfaktorer 11. Interessant C. elegans immunsystemet succes begrænser Salmonella replikation. Det er blevet rapporteret tidligere at inhibition af autophagy gener gør øget Salmonella replikation i C. elegans, hvilket resulterer i tidlig død af inficerede orme 10. Macroautophagy (herefter kaldet autophagy) er en dynamisk proces, der involverer omlægning af subcellulære membraner til at udskille cytoplasma og organeller til levering til lysosomet for nedbrydningen 12. Autophagy er blevet rapporteret at begrænse Salmonella replikation i C. elegans og pattedyr 10,13.

C. elegans genomet var det første flercellede eukaryote genom sekventeret; det er lydhør over for RNAi behandling 14-16. Desuden kan RNAi administreres effektivt ved at udsætte orme at indtage bakterier indeholdende dobbeltstrenget RNA af målgenet, kaldet RNAi fodring 16,17. Hele genomet RNAi fodring biblioteker er blevet genereret for genom-dækkende RNAi screening 16,18. Heri en salmonellainfektion protocol kobles med RNAi fodring at tillade test C. elegans gener af interesse for deres evne til at beskytte mod Salmonella infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. XLD (Xylose lysin desoxycholat) agarplader

XLD agar er et selektivt vækstmedium for Salmonella, der vises som sorte kolonier på XLD agarplader. Men hvis der ikke er nogen bekymring for forurening, en regelmæssig LB-plade kan være substitueret.

  1. Afvejes 5,5 g XLD agar og resuspender i 5 ml deioniseret vand.
  2. Bland grundigt, indtil al agar er våd. Tilføj 95 ml deioniseret vand, indtil alle klumper er væk, og mediet er helt resuspenderet.
  3. Kog mediet opløses fuldstændigt (må ikke autoklaveres).
  4. Afkøl medium ved stuetemperatur til 50 ° C.
  5. Hæld 25 ml agar i hver 95 x 15 mm (diameter x højde) plade (plader, forseglet med Parafilm kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned).

2.. Nematodevækst Medium (NGM) RNAi Fodring Plader

Fremstilling af C. elegans NGM plader er blevet beskrevet tidligere 19.. Her en procedure beskrives kort for at tilføje antibiotikummet ampicillin og RNAi kemiske inducer isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) i NGM medier at gøre RNAi fodring plader.

  1. Opløses 3 g NaCI og 2,5 g Bacto-pepton i 1 deioniseret vand.
  2. Tilføj 17 g Bacto agar i medierne.
  3. Autoklaver mediet i 45 minutter og afkøle mediet til 50 ° C i et vandbad.
  4. Tilføj følgende løsninger: 1 ml kolesterol (5 mg / ml i 95% ethanol), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, og 25 ml 1 M kaliumphosphatpuffer (pH 6,0). Bland godt.
  5. Tilsæt 1 ml 1 M IPTG og 500 pi ampicillin (100 mg / ml i sterilt vand).
  6. Bland opløsningen godt og hæld i 60 x 15 mm (diameter x højde) petriskåle ved hjælp af en Pipet Aid og 25 ml serologisk pipette efter sterile procedurer. Fyld hver plade med 12 ml agar. Plader kan lagres ved 4 ° C i op til 1 måned.

Det væsentlige autophagy gen bec-1 anvendes som et eksempel for at undersøge funktionen af et væld gen i forsvaret mod Salmonella infektion. De eksperimentelle procedurer er illustreret i figur 1 og tabel 1. Protokollen til fremstilling af RNAi-behandlede dyr infektion følger med i hver eksperimentel trin anført i parentes.

  1. Podes BEC-1 RNAi fodring og styre tom vektor L4440 RNAi fodring bakterier ved at placere en flage -80 ° C frosne bakterier i 2 ml LB-medium suppleret med 100 mg / ml ampicillin (dag 1). Gentag dette trin, en gang om ugen under hele forsøget at have friske RNAi bakterier. Kulturen opbevares i 4 ° C køleskab, når den ikke bruges.
  2. Frø 100 ml natten over RNAi bakteriekultur på RNAi plader. Forbered tre bec-1 RNAi og tre kontrol tom vECTOR RNAi plader. Pladerne inkuberes ved 37 ° C natten over (dag 2).
  3. Fjern RNAi plader fra 37 ° C inkubator og lad dem køle ned til stuetemperatur på bænken. Saml velnærede L4 vildtype N2 hermafroditter og overføre dem til BEC-1 RNAi og styre tomme vektor RNAi plader. Placer tre orme per plade, på tredobbelte plader. På den samme dag, forberede RNAi plader som beskrevet i trin 3.2 (dag 3).
  4. Inkuberes RNAi plader med orme i 20 ° C inkubator for 36-40 timers og overføre orme til friske tilsvarende RNAi plader forberedt i trin 3.3. Efter orme overføres inkuberes pladerne i 20 ° C inkubator for 64 time (dag 4).

4.. Forbered salmonella for infektion

  1. Streak Salmonella -80 ° C frossen lager 1. XLD agar pladen og inkuber pladen ved 37 ° C natten over (Dag 5
  2. Pick et godt isoleret sort Salmonella koloni og pode den i 2 ml LB-medium ved 37 ° C med omrystning natten (dag 6).
  3. Frø 80 ml ​​Salmonella overnatskultur 1. C. elegans 60 x 15 mm (diameter x højde) NGM agarplade og forberede 6 plader i alt. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 6 timer. Bakteriekulturen skal tørre og danne en plæne på pladen (dag 7).

5. Infect RNAi-behandlede Worms med Salmonella

  1. Overfør bec-1 RNAi-behandlede og styre tomme vektor RNAi-behandlede L4 N2 hermafroditter (afkom af orme, der er oprettet i trin 3) til Salmonella plader. Placer 40 orme per plade på 3 plader for hver gruppe. Inkubér ormen pladerne ved 20 ° C i 48 timer (dag 7).
  2. Forbered et sæt friske RNAi plader som beskrevet i trin 3.1 og 3.2 (dag 7 og
  3. Efter 48 timers infektion, overføre Salmonella-inficerede orme til de tilsvarende RNAi plader fremstillet i trin 5.2 og inkuberes ved 20 ° C (dag 9).

6.. Overlevelse Assay

  1. Score overlevelse orme dagligt og overføre orme til friske tilsvarende RNAi plader under æglægning tid. Forbered et sæt friske RNAi plader før hver orm overførsel som beskrevet i trin 3.1 og 3.2. Tryk ormen krop (hoved, midterste del og hale) forsigtigt med en ende-fladtrykt platintråd. En orm er scoret som dødt, hvis der observeres nogen bevægelse af ormen krop.
  2. Score overlevelsen af ​​orme dagligt eller hver anden dag, og overføre orme til friske tilsvarende RNAi plader to gange om ugen efter orme op med at lægge æg.
  3. Efter alle orme dø, pool overlevelsesdata fra tredobbelte plader som et datasæt. Input data for hver gruppe overlevelse i relevant statistisk software såsom GraphPad Prism at generere overlevelseskurver og udføre Kaplan-Meier overlevelse analyse. Hele forsøget gentages mindst én gang for at bekræfte konklusionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved 20 ° C, den mediane levetid vildtype N2 orme er 17 dag (figur 2a og tabel 2). Salmonella infektion signifikant nedsætter medianen levetid N2 orme til 10,5 dage (p = 0,0002, log-rank test) (figur 2A ).

Hvis en C. elegans genet spiller en vigtig rolle i forsvaret mod Salmonella infektion, forventes det, at dens hæmning vil give modtagelighed for salmonellainfektion. I virkeligheden, i forhold til salmonella-inficerede kontrol RNAi-behandlede N2 dyr, er medianen levetid Salmonella-inficerede bec-1 RNAi-behandlede N2 orme faldet fra 10,5 dage til 9 dage (p <0,0001, log-rank test) (Figur 2B og tabel 2). Den maksimale levetid dramatisk forkortet med 14 dage (fra 24 dage til 10 dage, 2B og tabel 2). Desuden erc-1 RNAi har nogen indlysende effekt på levetiden for N2 orm, der ikke er inficeret med Salmonella (p = 0,2593, log-rank test) (figur 2C og tabel 2), hvilket indikerer, at Salmonella infektion, ikke BEC-1 RNAi behandling, nedsætter levetiden for salmonella-inficerede bec-1 RNAi-behandlede orme. Også BEC-1 er et essentielt gen i C. elegans forsvar mod Salmonella infektion.

Figur 1
Fig. 1. Rutediagram af de eksperimentelle procedurer.

Figur 2
Figur 2. Inhibering af BEC-1-genet af RNAi giver susceptibility til salmonellainfektion i C. elegans. AC) Overlevelseskurver af vildtype N2 dyr behandlet med enten kontrol tom vektor RNAi eller bec-1-genet RNAi efter en 2 dages eksponering for Salmonella typhimurium eller patogene Escherichia coli ved 20 ° C. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Tabel 1
Tabel 1.. Salmonella infektion protokol tidsramme.

Tabel 2
Tabel 2. Statistisk analyse aftelefonens levetid data i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans er en simpel genetisk model organisme, der spiser bakterier som sin næringskilde. Således er det nemt at sætte sin normale bakterielle mad med en tarm patogen til at undersøge samspillet mellem C. elegans og det valgte patogen. Heri beskrives en protokol er beskrevet at kombinere salmonellainfektion og C. elegans RNAi fodring behandling for at undersøge, hvilken rolle værtsgener i forsvaret mod Salmonella infektion. Tidligere infektion protokoller eksponere C. elegans orme til sygdomsfremkaldende bakterier, herunder Salmonella i løbet af deres levetid 20. I den nuværende protokol, Salmonella inficerer orme i en to-dages periode. Efter at ormene er ikke længere udsat for Salmonella. Denne salmonellainfektion signifikant nedsætter levetiden for C. elegans vildtypedyr. Således invaderede Salmonella replikere inde orme og dræbe dyrene 10 Salmonella efterligner menneskelig Salmonella infektion, som skal bidrage til at afdække nyttige oplysninger til at forstå den menneskelige fødevarebåren sygdom forårsaget af Salmonella infektion. Desuden er denne protokol kombinerer RNAi fodring behandling med Salmonella infektion, der gør det muligt at teste alle kandidatgener, der kan være involveret i vært forsvar mod Salmonella infektion, især når de genetiske mutanter er ikke tilgængelige. Den autophagy gen bec-1 er kendt for at være involveret i forsvaret mod Salmonella infektion er brugt som eksempel i den foreliggende undersøgelse. Bec-1-mutationer er dødelige 21, hvilket forhindrer at teste sin rolle i forsvaret mod Salmonella infektion hos voksne. Brug den nuværende protokol, blev det påvist, at hæmning af bec-1 af RNAi giver følsomhed over for salmonella-infektion i C. elegans. I nærværende undersøgelse, N2 vildtype orme fed med L4440 bakterier har en lignende levetid som dyr fodret med OP50. Dyrene begynder at dø omkring dag 6 og den maksimale levetid er omkring fire uger. N2 orme inficeret med Salmonella leve et par dage kortere. Derimod bec-1 RNAi-behandlede orm inficeret med Salmonella dør omkring to gange hurtigere end kontroldyr selv startdatoen for dyr til at dø i begge grupper er kun et par dage fra hinanden (figur 2). Hele forsøget varer omkring 1 måned.

I denne protokol, er koordineringen af RNAi fodring og Salmonella nødvendige forberedelser, således at RNAi-behandlede L4 stage hermafroditter udsættes for Salmonella infektion. En typisk tidsramme på den anvendte protokol i forfatternes lab er beskrevet i tabel 1.. Er RNAi fodring bakterier forberedt ugentligt og bakteriekulturen opbevares ved 4 ° C, når den ikke bruges. Notatet, på dag 7, vil infektionen starter 60; timer efter Salmonella overnatskulturer er placeret på NGM plader. I løbet af denne 6 timers periode, er RNAi-behandlede L4 N2 hermafroditter plukket fra tilsvarende bec-1 og styre tomme vektor RNAi plader. De ikke-inficerede orme anvendes som kontroller for at fastslå, om salmonellainfektion forkorter levetiden af inficerede orme og hvis bec-1 RNAi behandling har nogen indflydelse på orm levetid.

I øjeblikket overlevelse C. elegans efter infektion er almindeligt anvendt til at måle patogenet virulens 3-5. Men RNAi hæmning af visse C. elegans gener resultere i nedsat levetid. Derfor bør man være forsigtig, når tolkningen af ​​data. Når denne situation ses, forskellige koncentrationer af RNAi inducer IPTG, kan afprøves for at identificere den ønskede koncentration, der kun påvirker værtens respons på de patogene infektioner uden indvirkning på dyrets levetid. Som tidligere rapporteret <sup> 10, 1 nM IPTG-koncentrationen blev med succes anvendt til at undersøge, hvilken rolle autophagy i IGF signalering medieret patogenresistens i C. elegans.

Eftersom C. elegans genomet er blevet sekventeret og C. elegans RNAi fodring biblioteker er blevet genereret 16,18, er det muligt at revidere den beskrevne protokol til at udføre en genom-dækkende RNAi screening for at identificere alle værtsgener involveret i forsvaret mod Salmonella infektion. For eksempel, i stedet for at anvende den gennemsnitlige overlevelse for at måle virulensen af Salmonella er den maksimale overlevelse anvendes. Desuden kan inficerede orme steriliseres ved at supplere plader med fluordeoxyuridin, en DNA-syntese-inhibitor. Således overførsel af inficerede orme er unødvendig, så længe maden leveres til forhindre orme fra sult. Disse ændringer vil reducere arbejdsbyrden for en high-throughput skærm voldsomt. Denne type af storstilet undersøgelse kan sHED lys på forståelse af menneskelige reaktion på salmonellainfektion så mange biologiske veje i C. elegans er evolutionært konserveret i mennesker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Diane Baronas-Lowell for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant og en aldrende stipendium fra Ellison Medical Foundation til KJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

Tags

Immunologi , Autophagy infektion patogen vært RNAi
En protokol til at inficere<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to… More

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter