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Immunology and Infection

感染するためのプロトコル Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
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1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

線虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための新しい遺伝モデルとして登場しました。ここでは、 温度を感染させるためのプロトコルを記述サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるために二重鎖のRNAi干渉法と結合ネズミチフス菌とエレガンス 。

Abstract

過去10年間で、C.虫は、グラム陰性菌、ネズミチフス菌に対する宿主防御を含め、ホストと病原体との相互作用を研究する無脊椎生物として浮上している。サルモネラはCの腸内で持続感染を確立虫や感染した動物の早期死亡をもたらす。免疫機構の数はCで同定されているサルモネラ感染に対して防御する虫 。オートファジー、進化的に保存されたリソソーム分解経路は、C.におけるサルモネラの複製を制限することが示されている虫と哺乳類における。ここで、プロトコルは、C.に感染することが記載されているヒトにおけるサルモネラ感染と同様のワームが、限られた時間のサルモネラに暴露されたネズミチフス菌 、 線虫と、 サルモネラ感染が著しくC.の寿命を短くする虫</ EM>。一例として、必須の自食作用遺伝子ベック-1を使用して、我々はC.、この感染法を組み合わせたRNAiは、 線虫のアプローチを供給し、このプロトコルはC.の機能を調べるために使用することができる示しサルモネラ感染に対する防御において宿主遺伝子エレガンス 。 C.以来虫全ゲノムのRNAiライブラリが利用可能であり、このプロトコルは、包括的で物をスクリーニングすることが可能になるサルモネラおよびゲノムワイドのRNAiライブラリを使用して、他の腸内の病原体から守る遺伝子エレガンス 。

Introduction

自由生活土壌線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、多くの生物学的な質問を研究するために使用されるシンプルかつ遺伝的に扱いやすいモデル生物である。C.虫が支配的自己施肥雌雄同体として存在する。雄配偶子形成を自発的に1,2の間にX染色体の非論理和によって生成される。豊富な食べ物、Cの存在下で虫は継続的に、成人に4幼虫の段階を経て発達する。温度も影響を与えるC.虫の開発;迅速な開発は、より高い温度で観察される。研究室では、C.エレガンスは、食品1,2播種し、細菌大腸菌 （菌株OP50）を含む寒天プレート上で20℃の標準温度で培養する。

過去10年間で、C.虫は宿主-病原体相互作用3-5を研究する無脊椎生物として浮上している。自然界では、C.虫は nutrienなどの細菌を食べるトン源1,2。その通常の細菌の実験室フード、OP50は、容易C.間の相互作用を調べるために他の病原体で置換することができる虫や任意の選択された病原体。これらの条件下で、腸の感染の主要部位である。実際に、細菌性病原体の広い範囲が致死的にC.に感染することが示されている虫 3-5。

グラム陰性菌のサルモネラは、世界中の6,7人の食中毒の原因となる胃腸病原体である。C.この細菌は、複製し、持続的な腸の感染症8月10日を示すもの虫はネズミチフス菌のための優れたモデルホストです。 でエレガンスは、新規の両方を識別するために使用されていると以前から知られているサルモネラ病原性は、11因子 。興味深いことに、C.虫の免疫系は正常にサルモネラの複製が制限されます。それはそのInhibが以前に報告されているオートファジー遺伝子のitionはCで増加サルモネラの複製をレンダリング虫 、感染したワーム10の早い死に至る。マクロオートファジーは、（本明細書オートファジーと呼ばれる）12分解のためにリソソームへの送達のための細胞質および細胞小器官を隔離する細胞内膜の転位を伴う動的プロセスである。オートファジーは、C.においてサルモネラの複製を制限することが報告されている虫や哺乳類10,13中。

C.虫のゲノムを配列決定し最初の多細胞真核生物ゲノムた。それは、RNAi治療14〜16に応答する。また、RNAiは、RNAiが16,17に供給として知られている標的遺伝子の二本鎖RNAを含む細菌を摂取するワームを施すことにより効果的に投与することができる。全ゲノムのRNAi送りライブラリは、ゲノムワイドなRNAiは16,18をスクリーニングするために生成されている。ここでは、 サルモネラ感染症のプロトコールは、RNAiがC.をテストできるように、給紙に結合されているサルモネラ感染に対して防御する能力について、目的の遺伝子エレガンス 。

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Protocol

1。XLD（キシロースリジンデソキシコール）寒天プレート

XLD寒天はXLD寒天プレート上で黒色コロニーとして現れるサルモネラ、のための選択的成長培地である。汚染の心配がない場合は、正規のLBプレートは、置換されていてもよい。

  1. 5ミリリットルの脱イオン水に5.5グラムのXLD寒天再懸濁を量る。
  2. すべての寒天が濡れてまでよく混ぜる。すべての塊がなくなっているとメディアが完全に再懸濁されるまで脱イオン水を95ミリリットルを追加します。
  3. （オートクレーブしないでください）​​、完全に溶解する媒体が沸騰。
  4. 50℃の室温で培地を冷却
  5. 各95×15ミリメートル（直径×高さ）プレート（パラフィルムでシールしたプレートを1ヶ月まで4℃で保存することができる）中の25mlの寒天を注ぐ。

2。線虫増殖培地（NGM）RNAiは、プレートの餌付け

Cの準備エレガンス NGMプレートは、以前に記載されている19ここでの手順を簡単にするRNAi送り板を作るためにNGM培地に抗生物質アンピシリンおよびRNAi化学誘導物質イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することが記載されている。

  1. 3グラムのNaClおよび1 Lの脱イオン水に2.5グラムバクトペプトンを溶かす。
  2. メディアへの17グラムバクト寒天を追加します。
  3. 45分間オートクレーブし、メディアを水浴中で50℃に媒体を冷却する。
  4. を1mlのコレステロール（95％エタノール中5 mg / ml）を1 mlの1 MのCaCl 2、1 mlの1 MのMgSO 4、および25 mlの1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）：以下の溶液を加える。よく混ぜる。
  5. 1ミリリットルの1M IPTGおよび500μlのアンピシリン（滅菌水に100ミリグラム/ ml）を追加します。
  6. よく溶液を混合し、滅菌手順に従ってピペットで援助と25ミリリットルの血清学的ピペットを用いて60×15ミリメートル（直径×高さ）ペトリ皿に注ぐ。 12ミリリットル寒天で各プレートを埋める。プレートを、1ヶ月まで4℃で保存することができる。

ベック-1オートファジー必須遺伝子はサルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の機能を調べるために例として使用される。実験手順は、 図1および表1に示されている。感染についてのRNAi処理動物を調製するためのプロトコルは、括弧内に与えられた各実験手順の日に、続く。

  1. BEC-1のRNAi摂食に接種し、100 mg / mlのアンピシリン（1日目 ）を補足した2ミリリットルのLB培地には-80℃で凍結した細菌フレークを配置することによって、空のベクターL4440のRNAi摂食細菌を制御します。新鮮なRNAiの細菌を持っている全体の実験中に週一回、この手順を繰り返します。使用しない場合は4℃の冷蔵庫に文化を保存してください。
  2. RNAiのプレート上で一晩のRNAi細菌培養の100ミリリットルをシード。 3 BEC-1 RNAiおよび3コントロールの空のVを準備RNAiのプレートをエクター。 37℃で一晩（2日目 ）でプレートをインキュベートする。
  3. 37℃のインキュベーターからのRNAiプレートを取り外し、それらをベンチに室温まで冷却する。よく葉L4野生型N2雌雄同体をピックアップし、RNAiを1にBECと空ベクターのRNAiプレートを制御するためにそれらを転送します。三連のプレートに、プレート当たり3ワームを配置します。ステップ3.2（3日目 ）に記載したのと同じ日に、RNAiのプレートを準備します。
  4. 36〜40時間、20℃のインキュベーター内のワームとのRNAiプレートをインキュベートし、ステップ3.3で作成新鮮対応のRNAiプレートにワームを転送します。ワームが転送された後、64時間（4日目 ）、20℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートする。

4。感染のサルモネラを準備

  1. ストリークサルモネラ -80℃で凍結した1 XLD寒天プレート上の在庫と一晩（5日目 、37℃でプレートをインキュベート
  2. よく孤立黒サルモネラコロニーを採取し、（6日目 ）で一晩振とうしながら37℃で2 mlのLB培地中で、それを接種。
  3. 1 Cの種子80ミリリットルサルモネラ一晩培養虫 60×15ミリメートル（直径×高さ）NGM寒天プレート、計6枚を準備。 6時間室温で培養する。細菌培養プレート（7日目 ）に芝生を乾燥させ、形成すべきである。

5。 サルモネラとのRNAi治療ワームに感染

  1. BEC-1のRNAi処理を移し、 サルモネラプレートに空のベクターのRNAi治療L4のN2雌雄同体（ステップ3で設定したワームの子孫）を制御する。各グループの3プレートにプレート当たり40ワームを配置します。 48時（7日目 ）、20℃でワームのプレートをインキュベートする。
  2. ステップ3.1および3.2（7日目で説明したように、新鮮なRNAiプレートの1セットを準備し、
  3. 48時間の感染後、ステップ5.2で作成、対応するRNAiプレートにサルモネラ菌に感染したワームを転送し、20℃（9日目 ）でインキュベートする。

6。生存アッセイ

  1. 日々のワームの生存をスコアと産卵期間中に新鮮な対応のRNAiプレートにワームを転送します。ステップ3.1および3.2で説明したように前に各ワーム転送に新鮮なRNAiプレートのセットを準備します。エンド平坦化白金線で軽くワーム本体（頭部、中間部と尾）をタッチします。ワームの体の動きが全く観察されない場合にワームが死んだとして採点される。
  2. 日々のワームの生存または一日おきのスコア、およびワームが産卵を停止した後に週二回、新鮮対応するRNAiプレートにワームを転送します。
  3. すべてのワームが死んだ後、1​​データセットとして三重プレートからの生存データをプールする。例えば、グラフパッドPなどの適切な統計ソフトウェアへの入力の各群の生存データを生存曲線を生成し、Kaplan-Meier生存分析を実行するRISM。全実験は結論を確認するために、少なくとも1回繰り返される。

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Representative Results

20℃では、野生型N2ワームの中央値は寿命が17日間（ 図2Aおよび表2）である。 サルモネラ感染が有意に10.5日（P = 0.0002、log-rank検定）にN2ワームの中央値の寿命を低下させる（ 図2（a） ）。

C.もし線虫遺伝子はサルモネラ感染に対する防御において重要な役割を果たし、それはその阻害はサルモネラ感染に対する感受性を付与することが予測される。実際、 サルモネラ感染制御のRNAi治療のN2動物と比較して、 サルモネラ感染BEC-1のRNAi治療N2ワームの中央値は寿命が9日間（P <0.0001、log-rank検定）（ 図 10.5日から減少している図2Bおよび表2）。最大寿命を劇的に（24日から10日間、 図2Bおよび表2に）14日に短縮されている。また、 もC-1 RNAiは、 サルモネラ感染症は、BEC-1ではないことをRNAi処理を示す、 サルモネラ （P = 0.2593、log-rank検定）（ 図2Cおよび表2）に感染していないN2虫の寿命に明らかな効果がありませんサルモネラ感染BEC-1のRNAi治療ワームの寿命を低下させる。また、BEC-1はCで必須の遺伝子であるサルモネラ感染に対する虫防御 。

図1
図1。実験作業フローチャート。

図2
図2。RNAiによるBEC-1遺伝子の阻害は、SUSを付与Cのサルモネラ感染に対するceptibility 虫 20℃でのサルモネラ菌や病原性大腸菌（Escherichia coli）への2日間の暴露後のコントロールの空のベクターRNAiまたはBEC-1遺伝子のRNAiのいずれかで処理した野生型N2動物の交流）生存曲線の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。この図。

表1
表1。 サルモネラ感染プロトコル時間枠。

表2
表2。の統計分析図2のデータを寿命。

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Discussion

線虫は、栄養源としてバクテリアを食べて、単純な遺伝的モデル生物である。従って、C.間の相互作用を調査するために、腸病原体にその正常細菌食品を代用することは容易である虫および選択した病原体。本明細書プロトコルは、 サルモネラ感染およびC.を組み合わせることが記載されているRNAiは、 サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるために治療を供給エレガンス 。以前の感染プロトコルはC.を公開一生の20時にサルモネラなどの病原性細菌にワームエレガンス 。この議定書では、 サルモネラは 2日間の期間中にワームに感染します。その後、ワームは、 サルモネラにさらされなくなりました。このサルモネラ感染が著しくC.の寿命を低下させる野生型動物エレガンス 。このように、 サルモネラ内部ワームを複製し、動物10を殺す侵攻サルモネラ感染によって引き起こされる人間の食品由来の病気を理解するために有用な情報を発見するのに役立つべきであるサルモネラ模倣人間のサルモネラ感染への暴露のこの短い期間。さらに、このプロトコルは、遺伝的変異体が利用できない場合は特に、それが可能なサルモネラ感染に対する宿主防御に関与している可能性のある候補遺伝子を試験すること、 サルモネラ感染症のRNAi給紙処理を組み合わせる。 BEC-1サルモネラ感染に対する防御に関与することが知られてオートファジー遺伝子が、本研究では一例として使用されている。BEC-1変異は、成人におけるサルモネラ感染に対する防御における役割をテストして防止する、致死21です。現在のプロトコルを使用して、それがRNAiによるベック-1の阻害はC.にサルモネラ感染に対する感受性をもたらすことが示された虫 。本研究では、N2野生型線虫FEL4440菌とDはOP50を与えた動物と同様の寿命がある。動物は6日目の周りに死に始めると最大寿命は約4週間である。 サルモネラ菌に感染したN2ワームは短く、数日を生きる。両群で死亡する動物のための開始日が離れてわずか数日です（ 図2）が、これとは対照的に、 サルモネラ菌に感染してBEC-1のRNAi治療のワームは、約2倍の速さ、コントロール動物よりも死亡している。実験全体を約1ヶ月持続します。

RNAiの処理L4段雌雄同体はサルモネラ感染に供されるように、このプロトコルでは、RNAiの給紙とサルモネラ製剤の調整が必要である。著者らの研究室で使用されるプロトコルの典型的な時間枠を表1に記載されている。RNAiを供給する細菌を毎週調製し、使用しない場合に、細菌培養物を4℃で保存されている。注目すべきは、7日目に、感染が開始されます60; サルモネラ一晩培養物をNGMプレート上に置かれている時間後。この6時間の期間中に、RNAi処理されたL4のN2雌雄同体は、BEC-1の対応からピックアップし、空ベクターのRNAiプレートを制御している。非感染ワームは、BEC-1 RNAi処理は、ウォームの寿命に影響がある場合、 サルモネラ感染は、感染したワームの寿命を短くした場合に確認するために対照として使用する。

Cの現在、生存感染後の虫は、一般的に病原体の病原性3-5を測定するために使用されている。ただし、特定のCの RNAiを阻害エレガンス遺伝子は寿命低下をもたらす。データを解釈するとき、したがって、人は注意する必要があります。このような状況に遭遇したときに、RNAi誘導剤IPTG異なる濃度の、唯一の動物の寿命に影響を与えることなく、病原体感染に対する宿主応答に影響を与える所望の濃度を同定するために試験することができる。既報の通り<商標> 10、1nMのIPTG濃度が正常C.におけるIGFシグナル伝達媒介性病原体抵抗性におけるオートファジーの役割を調べるために使用した虫 。

与えられたもので虫のゲノムを配列決定し、C.されましたRNAiは、ライブラリーの供給エレガンス 16,18が生成されており、それはサルモネラ感染に対する防御に関与するすべての宿主遺伝子を同定するためにゲノムワイドなRNAiスクリーニングを行うことが記載されたプロトコルを修正することができる。たとえば、代わりにサルモネラ菌の毒性を測定するための生存期間の中央値を使用するのではなく、最大の生存が使用される。さらに、感染したワームはフルオロ、DNA合成阻害剤でプレートを補うことによって滅菌することができる。このため、感染したワームの転送は限り食品が飢餓からワームを防ぐために供給される必要はありません。これらの改変は、途方もなくハイスループットスクリーニングのための作業負荷を軽減します。大規模な研究のこのタイプのかもしれないサルモネラ感染に対する人間の反応を理解する上でHED光Cのような多くの生物学的経路虫は進化的にヒトで保存されている。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Acknowledgments

私たちは、原稿の重要な読書のために博士ダイアンBaronas-ローウェルに感謝します。この作品は、FAUチャールズ·E.シュミット大学科学のシード·グラントとKJのエリソン医学財団からエージング奨学金によってサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

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References

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