Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

एलिगेंस मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक नए आनुवांशिक मॉडल के रूप में उभरा है. यहाँ हम सी. संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में मेजबान जीन की भूमिका की जांच करने के लिए डबल कतरा आरएनएआई हस्तक्षेप तकनीक के साथ मिलकर साल्मोनेला के साथ एलिगेंस.

Abstract

पिछले दशक में, सी. एलिगेंस ग्राम नकारात्मक जीवाणु साल्मोनेला के खिलाफ मेजबान बचाव सहित, मेजबान और रोगजनकों के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक अकशेरुकी जीव के रूप में उभरा है. साल्मोनेला सी. की आंत में लगातार संक्रमण स्थापित एलिगेंस और संक्रमित पशुओं की जल्दी मौत में परिणाम है. उन्मुक्ति तंत्र के एक नंबर सी में पहचान की गई है साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ की रक्षा के लिए एलिगेंस. भोजी, एक evolutionarily संरक्षित lysosomal गिरावट मार्ग, सी में साल्मोनेला प्रतिकृति को सीमित करने के लिए दिखाया गया है एलिगेंस और स्तनधारियों में. इधर, एक प्रोटोकॉल सी. संक्रमित करने के लिए वर्णित है कीड़े मानव में साल्मोनेला के संक्रमण के लिए इसी तरह की एक सीमित समय के लिए साल्मोनेला के संपर्क में हैं जो में साल्मोनेला, साथ एलिगेंस. साल्मोनेला संक्रमण काफी सी. के जीवन shortens एलिगेंस </ Em>. एक उदाहरण के रूप में आवश्यक भोजी जीन बीईसी-1 का उपयोग करना, हम सी. के साथ इस संक्रमण विधि संयुक्त एलिगेंस आरएनएआई दृष्टिकोण खिलाने और इस प्रोटोकॉल सी. के समारोह की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता पता चला साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में एलिगेंस मेजबान जीनों. चूंकि सी. एलिगेंस पूरे जीनोम आरएनएआई पुस्तकालयों में उपलब्ध हैं, इस प्रोटोकॉल व्यापक सी. लिए स्क्रीन के लिए यह संभव बनाता है जीनोम चौड़ा आरएनएआई पुस्तकालयों का उपयोग साल्मोनेला और अन्य आंतों रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा है कि एलिगेंस जीन.

Introduction

मुक्त रहने वाले मिट्टी निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस कई जैविक सवालों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक सरल और आनुवंशिक रूप से विनयशील मॉडल जीव है. सी. एलिगेंस मुख्यतः स्वयं fertilizing hermaphrodites के रूप में मौजूद है. पुरुषों अनायास gametogenesis 1,2 दौरान एक्स गुणसूत्र के गैर अलगाव से उत्पन्न कर रहे हैं. प्रचुर मात्रा में भोजन, सी. की उपस्थिति में एलिगेंस लगातार वयस्क के लिए चार लार्वा चरणों के माध्यम से विकसित करना. तापमान भी सी. प्रभावित करती है एलिगेंस विकास; तेजी से विकास के उच्च तापमान पर मनाया जाता है. प्रयोगशाला में, सी. एलिगेंस खाद्य 1,2 के रूप में वरीयता प्राप्त कोलाई (तनाव OP50) के साथ अगर प्लेट पर 20 डिग्री सेल्सियस के मानक के तापमान पर सुसंस्कृत है.

पिछले दशक में, सी. एलिगेंस मेजबान रोगज़नक़ बातचीत 3-5 अध्ययन करने के लिए एक अकशेरुकी जीव के रूप में उभरा है. प्रकृति में, सी. एलिगेंस अपने nutrien के रूप में बैक्टीरिया खातीटी स्रोत 1,2. अपनी सामान्य जीवाणु प्रयोगशाला खाद्य, OP50, आसानी सेल्सियस के बीच बातचीत की जांच करने के लिए अन्य रोगजनकों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता एलिगेंस और किसी भी चुना रोगज़नक़. इन शर्तों के तहत, आंत के संक्रमण के प्राथमिक साइट है. दरअसल, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की एक विस्तृत श्रृंखला घातक सी. संक्रमित करने के लिए दिखाया गया है एलिगेंस 3-5.

ग्राम नकारात्मक जीवाणु साल्मोनेला दुनिया भर में 6,7 मानव खाद्य जनित बीमारी का कारण बनता है कि एक जठरांत्र रोगज़नक़ है. सी. इस जीवाणु replicates और लगातार आंतों में संक्रमण 8-10 दर्शाती रूप एलिगेंस साल्मोनेला के लिए एक अच्छा मॉडल मेजबान है. सी. एलिगेंस उपन्यास दोनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और पहले से ज्ञात साल्मोनेला डाह 11 कारकों. दिलचस्प है, सी. एलिगेंस प्रतिरक्षा प्रणाली को सफलतापूर्वक साल्मोनेला प्रतिकृति सीमा. ऐसा लगता है कि inhib पहले से सूचित कर दिया गया हैभोजी जीन की ition सी. में वृद्धि साल्मोनेला प्रतिकृति renders एलिगेंस, संक्रमित कीड़े 10 की जल्दी मृत्यु हो जाती है. (यहां पर भोजी के रूप में) Macroautophagy गिरावट 12 के लिए लाइसोसोम को प्रसव के लिए कोशिका द्रव्य और organelles पृथक subcellular झिल्ली के पुनर्निर्माण से जुड़े एक गतिशील प्रक्रिया है. भोजी सी. में साल्मोनेला प्रतिकृति को सीमित करने के लिए सूचित कर दिया गया है एलिगेंस और स्तनधारियों 10,13 में.

सी. एलिगेंस जीनोम अनुक्रम पहले बहुकोशिकीय यूकेरियोटिक जीनोम था; यह आरएनएआई उपचार 14-16 के लिए उत्तरदायी है. इसके अलावा, आरएनएआई आरएनएआई 16,17 खिलाने के रूप में जाना लक्ष्य जीन की डबल असहाय आरएनए युक्त बैक्टीरिया निगलना करने के लिए कीड़े subjecting द्वारा प्रभावी ढंग से प्रशासित किया जा सकता है. पूरे जीनोम आरएनएआई खिला पुस्तकालयों जीनोम चौड़ा आरएनएआई 16,18 स्क्रीनिंग के लिए उत्पन्न किया गया है. इस के साथ साथ, एक साल्मोनेला संक्रमण समर्थकtocol आरएनएआई परीक्षण सी. अनुमति देने के लिए भोजन के साथ युग्मित है साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ की रक्षा करने की क्षमता के लिए ब्याज की एलिगेंस जीन.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. XLD (सिलोज़ लाइसिन Desoxycholate) अगर प्लेट

XLD अगर XLD अगर प्लेट पर काले रंग की कालोनियों के रूप में प्रकट होता है जो साल्मोनेला, के लिए एक चयनात्मक मध्यम विकास है. संदूषण की कोई चिंता कर रहे हैं हालांकि, अगर एक नियमित लेग थाली प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

  1. 5 एमएल विआयनीकृत पानी में 5.5 जी XLD अगर और resuspend वजन.
  2. सब अगर गीला है जब तक अच्छी तरह से मिलाएं. सभी गांठ चले गए हैं और मध्यम पूरी तरह से resuspended है जब तक पानी विआयनीकृत 95 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. पूरी तरह से (आटोक्लेव नहीं है) को भंग करने के लिए मध्यम उबाल लें.
  4. 50 डिग्री सेल्सियस के कमरे के तापमान पर मध्यम कूल
  5. प्रत्येक 95 x 15 मिमी (व्यास x ऊँचाई) प्लेट (Parafilm के साथ बंद प्लेटों को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है) में 25 मिलीलीटर अगर डालो.

2. निमेटोड विकास मध्यम (एन जी एम) आरएनएआई प्लेट्स दूध पिलाने

सी. की तैयारी एलिगेंस एन जी एम प्लेटों पहले से वर्णित किया गया है 19. यहाँ एक प्रक्रिया संक्षेप आरएनएआई खिला प्लेटें बनाने के लिए एन जी एम मीडिया में एंटीबायोटिक एम्पीसिलीन और आरएनएआई रासायनिक inducer isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) जोड़ने के लिए वर्णित है.

  1. 3 जी NaCl और 1 एल विआयनीकृत पानी में 2.5 जी Bacto peptone भंग.
  2. मीडिया में 17 ग्राम Bacto अगर जोड़ें.
  3. 45 मिनट के लिए मीडिया आटोक्लेव और एक पानी के स्नान में 50 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया शांत.
  4. 1 मिलीग्राम कोलेस्ट्रॉल (95% इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल), 1 मिलीलीटर एम 1 2 CaCl, 1 एमएल 1 एम MgSO 4, और 25 एमएल 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (6.0 पीएच): निम्नलिखित समाधान जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं.
  5. 1 एमएल 1 एम IPTG और 500 μl एम्पीसिलीन (बाँझ पानी में 100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें.
  6. अच्छी तरह से समाधान मिश्रण और एक pipet सहायता का उपयोग और बाँझ प्रक्रियाओं का पालन 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट 60 x 15 मिमी (व्यास x ऊँचाई) पेट्री प्लेटों में डाल देना. 12 मिलीलीटर अगर साथ एक थाली भरें. प्लेट्स को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

आवश्यक भोजी जीन बीईसी -1 साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में एक मेजबान जीन के कार्य की जांच के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं चित्रा 1 और 1 तालिका में सचित्र हैं. संक्रमण के लिए आरएनएआई इलाज जानवरों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल कोष्ठक में दिए गए प्रत्येक प्रयोगात्मक कदम के दिन के साथ, इस प्रकार है.

  1. बीईसी -1 आरएनएआई खिला टीका लगाना और 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन दिवस (1) के साथ पूरक 2 मिलीलीटर लेग माध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस जमी बैक्टीरिया की एक परत रखकर खाली वेक्टर L4440 आरएनएआई बैक्टीरिया खिला नियंत्रित करते हैं. ताजा आरएनएआई बैक्टीरिया है करने के लिए पूरे प्रयोग के दौरान सप्ताह में एक बार इस चरण को दोहराएँ. आदत नहीं जब 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में संस्कृति स्टोर.
  2. आरएनएआई प्लेटों पर रातोंरात आरएनएआई जीवाणु संस्कृति की 100 मिलीलीटर बीज. तीन बीईसी -1 आरएनएआई और तीन नियंत्रण खाली वी की तैयारीआरएनएआई प्लेटें Ector. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात (2 दिन) प्लेटें सेते हैं.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से आरएनएआई प्लेटें निकालें और उन्हें बेंच पर कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति देते हैं. अच्छी तरह से खिलाया L4 जंगली प्रकार N2 hermaphrodites उठाओ और उन्हें आरएनएआई 1 BEC और खाली वेक्टर आरएनएआई प्लेटों को नियंत्रित करने के लिए स्थानांतरण. तीन प्रतियों प्लेटों पर, प्लेट प्रति तीन कीड़े रखें. 3.2 कदम (3 दिन) के रूप में वर्णित उसी दिन, आरएनएआई प्लेटें तैयार करते हैं.
  4. 3.3 कदम से तैयार ताजा इसी आरएनएआई प्लेटों को 36-40 घंटा और हस्तांतरण कीड़े के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कीड़े के साथ आरएनएआई प्लेटें सेते हैं. कीड़े का तबादला हो जाने के बाद, 64 घंटा (4 दिन) के लिए 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं.

4. संक्रमण के लिए साल्मोनेला की तैयारी

  1. स्ट्रीक साल्मोनेला -80 डिग्री सेल्सियस जमी 1 XLD अगर प्लेट पर स्टॉक और रातोंरात (5 दिन 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते
  2. एक अच्छी तरह से पृथक काला साल्मोनेला कॉलोनी उठाओ और दिवस (6) रात भर झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर लेग माध्यम में यह टीका लगाना.
  3. 1 सी. पर बीज 80 मिलीलीटर साल्मोनेला रातोंरात संस्कृति एलिगेंस 60 x 15 मिमी (व्यास x ऊँचाई) एन जी एम अगर प्लेट और कुल 6 प्लेटें तैयार करते हैं. 6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें सेते हैं. जीवाणु संस्कृति प्लेट (7 दिन) पर एक लॉन सूखी और फार्म चाहिए.

साल्मोनेला के साथ 5. संक्रमित आरएनएआई इलाज कीड़े

  1. स्थानांतरण बीईसी -1 आरएनएआई इलाज और साल्मोनेला प्लेटों को खाली वेक्टर आरएनएआई इलाज L4 एन 2 hermaphrodites (चरण 3 में स्थापित कीड़े की संतान) नियंत्रित करते हैं. प्रत्येक समूह के लिए 3 प्लेटों पर प्लेट प्रति 40 कीड़े रखें. 48 घंटा (7 दिन) के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़ा प्लेटें सेते हैं.
  2. कदम 3.1 और 3.2 (7 दिवस में वर्णित के रूप में ताजा आरएनएआई प्लेटों का एक सेट तैयार है और
  3. 48 घंटा संक्रमण के बाद, कदम 5.2 में तैयार इसी आरएनएआई प्लेटों के लिए साल्मोनेला से संक्रमित कीड़े हस्तांतरण और 20 डिग्री सेल्सियस (9 दिन) पर सेते हैं.

6. जीवन रक्षा परख

  1. दैनिक कीड़े के अस्तित्व स्कोर और अंडे बिछाने समय के दौरान ताजा इसी आरएनएआई प्लेटों के लिए कीड़े हस्तांतरण. कदम 3.1 और 3.2 में वर्णित के रूप में पूर्व प्रत्येक कीड़ा हस्तांतरण के लिए नए सिरे से आरएनएआई प्लेटों का एक सेट तैयार करते हैं. धीरे एक अंत चपटा प्लैटिनम तार के साथ कीड़ा शरीर (सिर, मध्य भाग और पूंछ) स्पर्श. कीड़ा शरीर का कोई आंदोलन मनाया जाता है एक कीड़ा मर के रूप में रन बनाए है.
  2. दैनिक कीड़े या हर दूसरे दिन के अस्तित्व के स्कोर, और कीड़े के अंडे बिछाने रोक के बाद दो बार एक सप्ताह ताजा इसी आरएनएआई प्लेटों के लिए कीड़े हस्तांतरण.
  3. सभी कीड़े मर जाते हैं, के बाद एक डेटा सेट के रूप में तीन प्रतियों प्लेटों से अस्तित्व डेटा पूल. ऐसे GraphPad पी के रूप में उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में प्रत्येक समूह के इनपुट अस्तित्व डेटाअस्तित्व घटता उत्पन्न करने के लिए और कापलान Meier अस्तित्व विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए Rism. पूरे प्रयोग के निष्कर्ष की पुष्टि करने के लिए कम से कम एक बार दोहराया है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

20 डिग्री सेल्सियस पर, जंगली प्रकार N2 कीड़े की औसत उम्र. साल्मोनेला संक्रमण काफी 10.5 दिनों तक N2 कीड़े की औसत उम्र कम हो जाती है 17 दिन (2A चित्रा और तालिका 2) है (पी = 0.0002, लॉग रैंक परीक्षण) (चित्रा 2A ).

यदि एक सी. एलिगेंस जीन साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, यह अपने निषेध साल्मोनेला के संक्रमण के लिए संवेदनशीलता प्रदान करेगा कि भविष्यवाणी की है. वास्तव में, साल्मोनेला से संक्रमित नियंत्रण आरएनएआई इलाज N2 जानवरों की तुलना में, साल्मोनेला से संक्रमित बीईसी -1 आरएनएआई इलाज N2 कीड़े की औसत उम्र (चित्रा 9 दिनों (पी <0.0001, लॉग रैंक परीक्षण) के लिए 10.5 दिनों से कमी आई है 2 बी और 2 तालिका). अधिकतम उम्र नाटकीय रूप से (24 दिनों से 10 दिनों, चित्रा 2B और तालिका 2) के लिए 14 दिनों से छोटा है. इसके अलावा, होसी -1 आरएनएआई, साल्मोनेला के संक्रमण, BEC -1 नहीं कि आरएनएआई उपचार का संकेत है, साल्मोनेला (पी = 0.2593, लॉग रैंक परीक्षण) (चित्रा -2 और 2 तालिका) से संक्रमित नहीं कर रहे हैं कि 2 एन कीड़े के जीवन पर कोई स्पष्ट प्रभाव पड़ता है साल्मोनेला से संक्रमित बीईसी -1 आरएनएआई इलाज कीड़े की उम्र कम हो जाती है. इसके अलावा, बीईसी -1 सी में एक आवश्यक जीन है साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ एलिगेंस रक्षा.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का चार्ट प्रवाह.

चित्रा 2
आरएनएआई द्वारा बीईसी -1 जीन का चित्रा 2. निषेध SUS प्रदानसी. में साल्मोनेला के संक्रमण के लिए ceptibility एलिगेंस. 20 डिग्री सेल्सियस पर साल्मोनेला या nonpathogenic कोलाई के लिए एक दिन में 2 प्रदर्शन के बाद नियंत्रण खाली वेक्टर आरएनएआई या बीईसी -1 जीन आरएनएआई के साथ या तो इलाज जंगली प्रकार N2 जानवरों की एसी) जीवन रक्षा घटता का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.

तालिका 1
तालिका 1. साल्मोनेला संक्रमण प्रोटोकॉल समय सीमा.

तालिका 2
तालिका 2. के सांख्यिकीय विश्लेषणचित्रा 2 में डेटा उम्र.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एलिगेंस अपने पोषक स्रोत के रूप में बैक्टीरिया खाती है कि एक सरल आनुवंशिक मॉडल जीव है. इस प्रकार, यह सी. के बीच बातचीत की जांच के लिए एक पेट रोगज़नक़ के साथ अपनी सामान्य जीवाणु खाद्य स्थानापन्न करने के लिए आसान है एलिगेंस और चुना रोगज़नक़. इस के साथ साथ एक प्रोटोकॉल साल्मोनेला के संक्रमण और सी. गठबंधन करने के लिए वर्णित है एलिगेंस आरएनएआई साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में मेजबान जीन की भूमिका की जांच करने के लिए उपचार खिला. पिछले संक्रमण प्रोटोकॉल सी. बेनकाब एलिगेंस अपने जीवनकाल 20 के दौरान साल्मोनेला सहित रोगजनक बैक्टीरिया को कीड़े. वर्तमान प्रोटोकॉल में, साल्मोनेला एक दो दिन की अवधि में कीड़े को संक्रमित करता है. उसके बाद, कीड़े साल्मोनेला के संपर्क में नहीं रह रहे हैं. इस साल्मोनेला संक्रमण काफी सी. की उम्र कम हो जाती है जंगली जानवरों की एलिगेंस. इस प्रकार, साल्मोनेला के अंदर कीड़े को दोहराने और पशु 10 को मारने पर हमला साल्मोनेला mimics साल्मोनेला के संक्रमण के कारण मानव खाद्य जनित बीमारी को समझने के लिए उपयोगी जानकारी को उजागर करने के लिए मदद करनी चाहिए जो मानव साल्मोनेला के संक्रमण के लिए जोखिम की इस छोटी सी अवधि. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक म्यूटेंट उपलब्ध नहीं हैं, खासकर जब यह संभव साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ मेजबान बचाव में शामिल हो सकता है कि किसी भी उम्मीदवार जीन परीक्षण करने के लिए कर रही है, साल्मोनेला के संक्रमण के साथ आरएनएआई खिला उपचार को जोड़ती है. भोजी जीन बीईसी -1 साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में शामिल हो जाना जाता वर्तमान अध्ययन में एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है. बीईसी -1 म्यूटेशन वयस्कों में साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में अपनी भूमिका के परीक्षण से बचाता है, जो घातक 21 हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह आरएनएआई द्वारा BEC-1 के निषेध सी. में साल्मोनेला के संक्रमण के लिए संवेदनशीलता है कि पैदावार में दिखाया गया था एलिगेंस. वर्तमान अध्ययन में, एन 2 जंगली प्रकार के कीड़े फ़ेL4440 बैक्टीरिया के साथ डी OP50 के साथ खिलाया जानवरों के रूप में एक ऐसी ही देता है. जानवरों के दिन 6 के आसपास मरने के लिए शुरू और अधिकतम उम्र लगभग चार सप्ताह है. साल्मोनेला से संक्रमित N2 कीड़े कुछ दिनों में कम रहते हैं. दोनों समूहों में मरने के लिए जानवरों के लिए शुरुआत की तारीख कुछ दिनों के अलावा केवल चित्रा (2) है, हालांकि इसके विपरीत, साल्मोनेला से संक्रमित बीईसी -1 आरएनएआई इलाज कीड़े के बारे में दो गुना तेजी से नियंत्रण जानवरों से मर जाते हैं. पूरे प्रयोग के बारे में 1 महीने तक रहता है.

आरएनएआई इलाज L4 मंच hermaphrodites साल्मोनेला के संक्रमण के अधीन हैं, इसलिए है कि इस प्रोटोकॉल में, आरएनएआई खिला और साल्मोनेला तैयारी के समन्वय की आवश्यकता है. लेखक 'प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का एक विशिष्ट समय सीमा तालिका 1 में वर्णित है. आरएनएआई खिला बैक्टीरिया साप्ताहिक तैयार कर रहे हैं और उपयोग नहीं किया जाता है जब जीवाणु संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जाता है. ध्यान से, 7 दिन, संक्रमण 6 शुरू होगा0; साल्मोनेला रातोंरात संस्कृतियों एन जी एम प्लेटों पर रखा जाता है के बाद घंटा. इस 6 घंटा अवधि के दौरान, आरएनएआई इलाज L4 एन 2 hermaphrodites बीईसी-1 इसी से उठाया और खाली वेक्टर आरएनएआई प्लेटों को नियंत्रित कर रहे हैं. नियंत्रण का पता लगाने के रूप में साल्मोनेला के संक्रमण संक्रमित कीड़े के जीवन shortens और बीईसी -1 आरएनएआई उपचार कीड़ा जीवन पर कोई प्रभाव पड़ता है अगर. अगर गैर संक्रमित कीड़े उपयोग किया जाता है

सी. वर्तमान में, अस्तित्व संक्रमण के बाद एलिगेंस सामान्यतः रोगज़नक़ डाह 3-5 मापने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, कुछ सी. के आरएनएआई निषेध एलिगेंस जीन की कमी हुई उम्र में परिणाम. डेटा की व्याख्या इसलिए, जब एक सावधान रहना चाहिए. इस स्थिति का सामना करना पड़ा है, जब आरएनएआई inducer, IPTG के विभिन्न सांद्रता, केवल पशु जीवन पर प्रभाव के बिना रोगज़नक़ संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया को प्रभावित करती है कि वांछित एकाग्रता की पहचान के लिए परीक्षण किया जा सकता है. जैसा कि पहले बताया <समर्थन> 10, 1 एनएम IPTG एकाग्रता सफलतापूर्वक सी. में IGF संकेतन मध्यस्थता रोगज़नक़ प्रतिरोध में भोजी की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था एलिगेंस.

यह देखते हुए कि सी. एलिगेंस जीनोम अनुक्रम और सी. गया है एलिगेंस आरएनएआई खिला पुस्तकालयों यह साल्मोनेला के संक्रमण के खिलाफ रक्षा में शामिल सभी मेजबान जीन की पहचान करने के लिए एक जीनोम चौड़ा आरएनएआई स्क्रीनिंग प्रदर्शन करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए संभव है, 16,18 उत्पन्न किया गया है. उदाहरण के लिए, बजाय साल्मोनेला की डाह को मापने के लिए बीच का अस्तित्व उपयोग कर के, अधिकतम अस्तित्व प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, संक्रमित कीड़े fluorodeoxyuridine, एक डीएनए संश्लेषण अवरोध के साथ प्लेटें सप्लीमेंट द्वारा निष्फल किया जा सकता है. इस प्रकार, संक्रमित कीड़े के हस्तांतरण के रूप में लंबे समय के भोजन भुखमरी से कीड़े को रोकने के लिए आपूर्ति की है के रूप में अनावश्यक है. इन संशोधनों के काफी एक उच्च throughput स्क्रीन के लिए काम का बोझ कम हो जाएगा. बड़े पैमाने पर अध्ययन के इस प्रकार मईसाल्मोनेला के संक्रमण के लिए मानव प्रतिक्रिया को समझने पर Hed प्रकाश सी. में के रूप में कई जैविक रास्ते एलिगेंस evolutionarily मानव में संरक्षित कर रहे हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. डायने Baronas-लोवेल धन्यवाद. इस काम विज्ञान बीज अनुदान की एक FAU चार्ल्स ई. श्मिट कॉलेज और के.जे. को एलिसन मेडिकल फाउंडेशन से एक एजिंग छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 88, भोजी संक्रमण रोगज़नक़ मेजबान आरएनएआई
संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; साथ<em&gt; साल्मोनेला</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to… More

Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter