Summary
C. elegans har vuxit fram som en ny genetisk modell för att studera värd-patogen interaktioner. Här beskriver vi ett protokoll för att infektera C. elegans med Salmonella typhimurium i kombination med dubbel-strängen RNAi störnings teknik för att undersöka betydelsen av värdgener i försvar mot salmonellainfektion.
Abstract
Under det senaste decenniet, C. elegans har vuxit fram som en ryggradslös organism att studera interaktioner mellan värdar och patogener, inklusive värdförsvaret mot gramnegativa bakterien Salmonella typhimurium. Salmonella etablerar ihärdig infektion i tarmen av C. elegans och leder till tidig död av infekterade djur. Ett antal immunitetsmekanismerna har identifierats i C. elegans för att försvara sig mot salmonellainfektioner. Autophagy, ett evolutionärt bevarat pathway lysosomal nedbrytning, har visats för att begränsa Salmonella replikering i C. elegans och i däggdjur. Här används ett protokoll som beskrivits för att infektera C. elegans med Salmonella typhimurium, där maskarna utsätts för salmonella under en begränsad tid, liknande Salmonella infektion hos människa. salmonellainfektion förkortar avsevärt livslängden på C. elegans </ Em>. Använda väsentliga autophagy genen bec-1 som ett exempel, vi kombinerat denna infektion metod med C. elegans RNAi utfodring förhållningssätt och visade detta protokoll kan användas för att undersöka funktionen av C. elegans värdgener i försvar mot salmonellainfektion. Sedan C. elegans hela genom RNAi biblioteken är tillgängliga, möjliggör detta protokoll att på ett heltäckande screena för C. elegans gener som skyddar mot Salmonella och andra tarm patogener med hjälp av genomet hela RNAi bibliotek.
Introduction
Den fritt levande jord nematoden Caenorhabditis elegans är en enkel och genetiskt tractable modellorganism för att studera många biologiska frågor. C. elegans dominant existerar som själv gödsling hermafroditer. Hanarna är spontant genereras av icke-disjunktion av X-kromosomen under gametogenes 1,2. I närvaro av riklig mat, C. elegans utvecklar kontinuerligt genom fyra larvstadier till vuxna. Temperaturen påverkar också C. elegans utveckling; snabbare utveckling observeras vid högre temperaturer. I laboratoriet, C. elegans odlas vid en standardtemperatur av 20 ° C på agarplattor med seeded bakterien Escherichia coli (stam OP50) som föda 1,2.
Under det senaste decenniet, C. elegans har vuxit fram som en ryggradslös organism att studera värd-patogen interaktioner 3-5. I naturen, C. elegans äter bakterier som dess nutrient käll 1,2. Dess normala bakterielaboratorium mat, OP50, kan lätt ersättas med andra patogener för att undersöka samspelet mellan C. elegans och valfri patogen. Under dessa förhållanden är tarmen den primära platsen för infektionen. I själva verket har ett stort utbud av bakteriella patogener visat sig dödligt infektera C. elegans 3-5.
Den gramnegativa bakterien Salmonella är en mag-patogen som orsakar livsmedelsburna sjukdomar i hela världen 6,7. C. elegans är en bra modell värd för Salmonella typhimurium som denna bakterie replikerar och uppvisar ihållande tarminfektioner 8-10. C. elegans har använts för att identifiera både nya och tidigare kända Salmonella virulensfaktorer 11. Intressant, C. elegans immunförsvar framgångsrikt begränsar Salmonella replikering. Det har tidigare rapporterats att inhibUtgåva av autophagy gener gör ökad Salmonella replikering i C. elegans, vilket leder till tidig död av infekterade maskar 10. Macroautophagy (nedan kallat autophagy) är en dynamisk process som innebär omfördelning av subcellulära membran att binda cytoplasma och organeller för leverans till lysosomen för nedbrytning 12. Autophagy har rapporterats att begränsa Salmonella replikering i C. elegans och i däggdjur 10,13.
The C. elegans genomet var den första flercelliga eukaryota genomet sekvenserat; är mottaglig för RNAi behandling 14-16. Dessutom kan RNAi administreras på ett effektivt sätt genom att utsätta maskar som äter bakterier innehållande dubbelsträngat RNA av målgenen, kallad RNAi utfodring 16,17. Hela genom RNAi bibliotek utfodrings har genererats för genomet hela RNAi screening 16,18. Häri en salmonellainfektion proffsprotokoll är kopplad med RNAi utfodring för att låta testa C. elegans gener av intresse för deras förmåga att skydda mot salmonellainfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. XLD (Xylos Lysin Desoxycholate) agarplattor
XLD-agar är ett selektivt odlingsmedium för salmonella, som visas som svarta kolonier på XLD agarplattor. Men om det inte finns någon oro för kontaminering, ett regelbundet LB-platta kan vara substituerade.
- Väg upp 5,5 g XLD agar och återsuspendera i 5 ml avjoniserat vatten.
- Blanda väl tills all agar är blöt. Lägg till 95 ml avjoniserat vatten tills alla klumpar är borta och mediet är helt återsuspenderade.
- Koka mediet för att lösa upp helt (inte autoklav).
- Kyl mediet vid rumstemperatur till 50 ° C.
- Häll 25 ml agar på vardera 95 x 15 mm (diameter x höjd) platta (plattor förseglade med Parafilm kan lagras vid 4 ° C i upp till 1 månad).
2. Nematoder Growth Medium (NGM) RNAi Feeding Plattor
Beredning av C. elegans NGM plattor har beskrivits tidigare en9. Här ett förfarande som beskrivs kortfattat att lägga till antibiotikumet ampicillin och den RNAi kemiska induceraren isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) i NGM medier att göra de RNAi matningsplattorna.
- Lös 3 g NaCl och 2,5 g Bacto-pepton i 1 L avjoniserat vatten.
- Lägg 17 g Bacto agar i medierna.
- Autoklavera media för 45 min och kylning av medium till 50 ° C i ett vattenbad.
- Lägg till följande lösningar: 1 ml kolesterol (5 mg / ml i 95% etanol), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4, och 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffert (pH 6,0). Blanda väl.
- Tillsätt 1 ml 1 M IPTG och 500 | il ampicillin (100 mg / ml i sterilt vatten).
- Blanda lösningen väl och häll i 60 x 15 mm (diameter x höjd) petriplattor med hjälp av en pipett Aid och 25 ml serologisk pipett följande sterila procedurer. Fyll varje platta med 12 ml agar. Plattorna kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad.
Den väsentliga autophagy gen bec-1 används som exempel för att undersöka funktionen hos en värd gen i försvar mot salmonellainfektion. De experimentella förfaranden som illustreras i Figur 1 och Tabell 1. Protokollet för framställning av RNAi-behandlade djur för infektion på följande sätt, med dagen för varje experiment steg anges inom parentes.
- Inokulera bec-1 RNAi utfodring och styra tom vektor L4440 RNAi utfodring bakterier genom att placera en flinga av -80 ° C frusna bakterier i 2 ml LB-medium kompletterat med 100 mg / ml ampicillin (Dag 1). Upprepa det här steget en gång i veckan under hela experimentet för att ha färska RNAi bakterier. Förvara kultur i 4 ° C kylskåp när de inte används.
- Seed 100 ml över natten RNAi bakteriekultur på RNAi plattor. Förbered tre bec-1 RNAi och tre kontroll tom vector RNAi plattor. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten (dag 2).
- Ta bort RNAi plattor från 37 ° C inkubator och låt dem svalna till rumstemperatur på bänken. Plocka upp välnärda L4 vildtyp N2 hermafroditer och överföra dem till bec-1 RNAi och styra tomma vektor RNAi plattor. Placera tre maskar per platta, på trippelplattor. Samma dag, förbereda RNAi plattorna i enlighet med steg 3.2 (Dag 3).
- Inkubera RNAi plattor med maskar i 20 ° C inkubator för 36-40 tim och överföra maskar till färska motsvarande RNAi plattor framställda i steg 3.3. Efter maskar överförs, inkubera plattorna i 20 ° C inkubator under 64 h (dag 4).
4. Förbered Salmonella för infektion
- Serie Salmonella -80 ° C frusna lager på ett XLD agarplatta och inkubera plattan vid 37 ° C över natten (Dag 5
- Välj en väl isolerad svart Salmonella koloni och ympa den i 2 ml LB-medium vid 37 ° C med skakning över natten (dag 6).
- Seed 80 ml Salmonella natten kultur på 1 C. elegans 60 x 15 mm (diameter x höjd) NGM agarplatta och förbereda 6 plattor totalt. Inkubera plattorna vid rumstemperatur i 6 timmar. Den bakteriella kulturen bör torka och bilda en matta på plattan (dag 7).
5. Infect RNAi-behandlade Worms med Salmonella
- Överför bec-1 RNAi-behandlade och kontroll tomma vektor RNAi-behandlade L4 N2 hermafroditer (avkomma av maskar som inrättats i steg 3) till Salmonella plattor. Placera 40 maskar per platta på 3 plattor för varje grupp. Inkubera snäck plattorna vid 20 ° C under 48 h (dag 7).
- Bered en uppsättning färska RNAi plattorna i enlighet med steg 3.1 och 3.2 (Dag 7 och
- Efter 48 h infektion, överföra salmonellainfekterade maskar till motsvarande RNAi plattorna framställda i steg 5,2 och inkubera vid 20 ° C (dag 9).
6. Överlevnadsanalys
- Betyg överlevnad maskar dagligen och överföra maskar till färska motsvarande RNAi plattor under äggläggning tid. Bered en uppsättning färska RNAi plattor före varje mask överföring som beskrivs i steg 3.1 och 3.2. Tryck masken kroppen (huvud, mellandelen och svans) försiktigt med en slut tillplattad platinatråd. En mask görs som död om ingen rörelse av snäckkroppen observeras.
- Betyg överlevnad maskar dagligen eller varannan dag, och överföra maskar till färska motsvarande RNAi plattor två gånger i veckan efter maskar sluta lägga ägg.
- Efter alla maskar dör, slå samman överlevnadsdata från trippelplattor som en datamängd. Mata in överlevnadsdata för varje grupp till lämplig statistisk programvara såsom GraphPad Prism att generera överlevnadskurvor och utföra Kaplan-Meier-överlevnadsanalys. Hela försöket upprepas åtminstone en gång för att bekräfta avslutning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid 20 ° C är median livslängd vildtyp N2 maskar 17 dagar (figur 2A och tabell 2). Salmonella-infektion minskar signifikant medianen livslängd N2 maskar till 10,5 dagar (p = 0,0002, log-rank test) (Figur 2A ).
Om ett C. elegans genen spelar en viktig roll i försvaret mot Salmonella-infektion, är det förutspås att dess hämning kommer att ge känslighet för salmonellainfektion. Faktum är att jämfört med salmonella-infekterade kontroll RNAi-behandlade N2 djur, är median livslängd Salmonella-smittade bec-1 RNAi-behandlade N2 maskar minskat från 10,5 dagar till 9 dagar (p <0,0001, log-rank test) (Figur 2B och tabell 2). Den maximala livslängden dramatiskt förkortas med 14 dagar (från 24 dagar till 10 dagar, fig 2B och tabell 2). Dessutom varac-1 RNAi har någon tydlig effekt på livslängden på N2 maskar som inte är infekterade med Salmonella (p = 0,2593, log-rank test) (Figur 2C och tabell 2), vilket indikerar att Salmonella infektion, inte bec-1 RNAi behandling, minskar livslängden på Salmonella-smittade bec-1 RNAi-behandlade maskar. Dessutom är bec-1 en viktig gen i C. elegans försvar mot Salmonella infektion.
Figur 1. Flödesschema av de experimentella förfaranden.
Figur 2. Inhibering av Bec-1-genen genom RNAi förlänar susceptibility till Salmonella infektion i C. elegans. AC) Överlevnads kurvor av vild typ N2 djur som behandlats med antingen kontroll tom vektor RNAi eller bec-1 genen RNAi efter en 2 dagars exponering för Salmonella typhimurium eller icke-patogena Escherichia coli vid 20 ° C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1. Salmonellainfektion protokoll tidsram.
Tabell 2. Statistisk analys avlivslängd Data i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans är en enkel genetisk modell organism som äter bakterier som sin näringskälla. Således är det lätt att ersätta dess normala bakterie mat med en intestinal patogen för att undersöka interaktioner mellan C. elegans och vald patogen. Häri ett protokoll beskrivs kombinera Salmonella infektion och C. elegans RNAi utfodring behandling för att undersöka betydelsen av värdgener i försvar mot salmonellainfektion. Tidigare infektionsprotokoll utsätta C. elegans maskar till patogena bakterier inklusive salmonella under sin livstid 20. I det nuvarande protokollet, Salmonella infekterar maskar i en två-dagars period. Efter det, maskarna inte längre exponeras för Salmonella. Denna Salmonella infektion minskar avsevärt livslängden på C. elegans vildtyp djur. Således invaderade Salmonella replikera inne maskar och döda djuren 10 Salmonella härmar mänsklig Salmonella infektion, vilket bör bidra till att avslöja användbar information för att förstå människans livsmedelsburna sjukdomar orsakade av Salmonella infektion. Dessutom, detta protokoll kombinerar RNAi utfodring behandling med salmonellainfektion, vilket gör det möjligt att testa alla gener som kan vara inblandade i värd försvar mot Salmonella infektion, speciellt när de genetiska mutanter är inte tillgängliga. Den autophagy gen bec-1 kända för att vara inblandade i försvar mot Salmonella infektion används som exempel i den aktuella studien. Bec-1 mutationer är dödliga 21, vilket förhindrar att testa sin roll i försvaret mot Salmonella-infektion hos vuxna. Med hjälp av det nuvarande protokollet, visade det sig att hämning av bec-1 av RNAi ger känslighet för salmonellainfektion i C. elegans. I den aktuella studien, N2 vildtyp maskar fed med L4440 bakterier har liknande livslängd som djur som utfodrats med OP50. Djuren börjar dö runt dag 6 och den maximala livslängden är cirka fyra veckor. N2 maskar som smittats av salmonella leva några dagar kortare. Däremot bec-1 RNAi-behandlade maskar infekterade med Salmonella dör ungefär två gånger snabbare än kontrolldjur, även om början datum för djur att dö i båda grupperna är bara några dagars mellanrum (Figur 2). Hela experimentet varar ca 1 månad.
I detta protokoll, är samordningen av RNAi utfodring och Salmonella förberedelser som krävs för att RNAi-behandlade L4 scen hermafroditer utsätts för salmonellainfektion. En typisk tidsram av protokoll som används i författarnas lab beskrivs i tabell 1. Har RNAi utfodring bakterier beredda varje vecka och den bakteriekultur förvaras vid 4 ° C när den inte används. Notera, på dag 7, kommer infektionen startar 60, h efter Salmonella natten kulturer placeras på NGM plattor. Under denna 6 h period, är RNAi-behandlade L4 N2 hermafroditer plockas från motsvarande bec-1 och styra tomma vektor RNAi plattor. De icke-infekterade maskar används som kontroller för att förvissa sig om salmonellainfektion förkortar livslängden på infekterade maskar och om bec-1 RNAi behandling har någon påverkan på mask livslängd.
För närvarande, överlevnad C. elegans efter infektion används ofta för att mäta patogenen virulens 3-5. Emellertid RNAi hämning av viss C. elegans gener leda till minskad livslängd. Därför bör man vara försiktig när man tolkar data. När denna situation uppstår, olika koncentrationer av RNAi-induceraren, IPTG, kan testas för att identifiera den önskade koncentrationen som endast påverkar värdens svar på patogena infektioner utan påverkan på djurets livslängd. Som tidigare rapporterats <sup> 10, den 1 nM IPTG koncentration med framgång använts för att undersöka betydelsen av autophagy i IGF-signalering-medierad patogenresistens i C. elegans.
Med tanke på att C. elegans genomet har sekvenserats och C. elegans RNAi utfodring bibliotek har genere 16,18, är det möjligt att se över den beskrivna protokollet för att utföra en genomet hela RNAi screening för att identifiera alla värd gener involverade i försvar mot salmonellainfektion. Till exempel, istället för att använda medianöverlevnad för mätning av virulensen hos Salmonella, är den maximala överlevnads användas. Dessutom kan infekterade maskar steriliseras genom att komplettera plattor med fluordeoxiuridin, en DNA-synteshämmare. Således är onödig överföring av infekterade maskar så länge maten levereras för att förhindra att maskar från svält. Dessa ändringar kommer att minska arbetsbördan för en hög genomströmning skärm oerhört. Denna typ av storskalig studie kan shed ljus på att förstå den mänskliga svar på salmonellainfektion som många biologiska banor i C. elegans är evolutionärt bevarad hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Diane Baronas-Lowell för kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av ett FAU Charles E. Schmidt högskolan av vetenskap Seed Grant och en åldrande stipendium från Ellison Medical Foundation till KJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
