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Immunology and Infection

감염 프로토콜 Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
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1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans의 호스트 병원체 상호 작용을 연구 할 수있는 새로운 유전자 모델로 떠오르고있다. 여기에서 우리는 C. 감염 프로토콜을 설명 살모넬라 감염에 대한 방어의 숙주 유전자의 역할을 조사하는 이중 가닥의 RNAi 간섭 기법과 결합 된 살모넬라 티피 뮤 리움과의 elegans.

Abstract

지난 10 년, C. 엘레은 그람 음성 박테리아 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)에 대한 숙주 방어를 포함하여, 호스트와 병원체 사이의 상호 작용을 연구하는 무척추 생물로 떠오르고있다. 살모넬라 균은 C.의 소장에서 지속적인 감염을 설정 엘레 감염된 동물의 조기 사망의 결과. 면역기구의 수는 C.에서 확인되었다 살모넬라 균 감염에 대해 방어하는 엘레. autophagy에, 진화 적으로 보존 된 리소좀의 분해 경로는 C에서 살모넬라 균의 복제를 제한하기 위해 표시되었습니다 엘레와 포유류. 여기서, 프로토콜은 C. 감염 설명 벌레가 인간의 살모넬라 균 감염과 유사한 제한된 시간에 대한 살모넬라 균에 노출 된 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)와 엘레. 살모넬라 균 감염은 크게 C.의 수명을 단축 엘레 </ EM>. 예를 들어 필수 autophagy에 유전자 BEC-1을 사용하여, 우리는 C.으로이 감염 방법을 결합 엘레 RNAi의 접근법은 먹이와이 프로토콜은 C.의 기능을 검사하는 데 사용될 수 보였다 살모넬라 균 감염에 대한 방어 엘레 호스트 유전자. 이후 C. elegans의 전체 게놈 RNAi의 라이브러리를 사용할 수 있으며,이 프로토콜은 포괄적 C.에 대한 화면으로 가능하게한다 게놈 전체의 RNAi 라이브러리를 사용하여 살모넬라 균 등 장내 병원균에 대한 보호 elegans의 유전자.

Introduction

독립 생활 토양 선충 Caenorhabditis의 엘레 많은 생물학적 질문을 연구하는 데 사용하는 간단하고 유 전적으로 다루기 쉬운 모델 생물이다. C. 엘레 지배적 자기 시비 자웅 동체로 존재합니다. 남성은 자발적으로 배우자 형성 1,2 동안 X 염색체의 비 분리에 의해 생성됩니다. 풍부한 음식, C.의 존재 엘레 지속적으로 성인 네 애벌레 단계를 통해 개발. 온도는 C.에 영향을 elegans의 개발; 빠른 개발은 높은 온도에서 관찰된다. 실험실에서, C. 엘레 음식 1,2 시드 박테리아 대장균 (주 OP50)와 한천 플레이트에서 20 ° C의 표준 온도에서 배양.

지난 10 년, C. 엘레 호스트 병원체 상호 작용 3-5을 연구하는 무척추 생물로 떠오르고있다. 자연에서, C. 엘레는 nutrien으로 박테리아를 먹는다T 소스, 2. 정상 세균 실험실 음식, OP50은 쉽게 C. 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 다른 병원체로 치환 될 수있다 엘레 및 선택 병원체. 이러한 조건에서, 대장은 감염의 기본 사이트이다. 실제로, 세균성 병원체의 넓은 범위는 치명적 C. 감염을 보였다 엘레 3-5.

그람 음성 박테리아 살모넬라 균은 전 세계적으로 6,7 인간 식중독을 일으키는 위장 병원체이다. C. 이 박테리아가 복제 및 지속적인 장내 감염 8-10 전시로 엘레는 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)에 대한 좋은 모델 호스트입니다. C. 엘레 참신한 모두를 식별하는 데 사용되었으며, 이전에 공지 된 살모넬라 병원성 11 요인. 흥미롭게도, C. elegans의 면역 체계가 성공적으로 살모넬라 균의 복제를 제한합니다. 그것은 그 저해에게 이전에보고 된autophagy에 유전자의 ition는 C. 증가 살모넬라 복제를 렌더링 엘레 감염된 웜 (10)의 조기 사망의 결과. (여기에 autophagy라고 함) Macroautophagy이 저하 12 리소좀에 배달 세포질과 세포 기관을 격리시키는하기 위해 세포 내 세포막의 재 배열을 포함하는 역동적 인 과정이다. 에 autophagy는 C.에서 살모넬라 복제를 제한하기 위해보고되었다 엘레와 포유류 10, 13에.

C. elegans의 게놈 염기 서열 첫 번째 다세포 진핵 생물의 게놈이었다; 이는 RNAi의 치료 14-16에 응답한다. 또한,이 RNAi의 RNAi의이 (16, 17)를 먹이로 알려진 표적 유전자의 이중 가닥 RNA를 포함하는 박테리아를 섭취하도록 웜을 실시함으로써 효과적으로 투여 될 수있다. 전체 게놈 RNAi의 먹이 라이브러리는 게놈 전체의 RNAi는 16, 18 심사에 대해 생성되었습니다. 여기서, 살모넬라 균 감염 프로프로토 콜은 RNAi의이 테스트 C. 허용하도록 먹이와 결합 살모넬라 균 감염으로부터 보호하기 위해 자신의 능력에 대한 관심 elegans의 유전자.

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Protocol

1. XLD (크 실리 톨 리신 데스 옥시 콜레이트) 한천 플레이트

XLD 한천 XLD 한천 플레이트에 검은 식민지로 나타납니다 살모넬라 균에 대한 선택 성장 매체입니다. 오염 될 우려가없는 경우에는, 정규 LB 플레이트가 치환 될 수있다.

  1. 5 ㎖의 탈 이온수에 5.5 g의 XLD 한천과에 resuspend를 달다.
  2. 모든 한천 젖은 때까지 철저하게 섞는다. 모든 덩어리가 사라과 매체가 완전히 재현 탁 될 때까지 탈 이온수 95 ML을 추가합니다.
  3. 완전히 (압력솥하지 않음) 용해 매체를 끓인다.
  4. 50 ℃의 실온에서 매체를 냉각
  5. 각 95 x 15mm (직경 x 높이) 플레이트 (파라 필름으로 밀봉 플레이트가 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다)에 25 ㎖의 한천을 부어.

2. 선충류 성장 중간 (NGM)의 RNAi는 플레이트를 먹이는

C. 준비 엘레 NGM 플레이트는 이전에 설명 된 19. 다음 절차는 짧게 RNAi의 먹이 접시를 만들기 위해 NGM 미디어에 항생제 암피실린 및 RNAi의 화학 유도 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 추가 할 설명되어 있습니다.

  1. 3g의 NaCl 1 L 탈 이온수 2.5 g 박토 펩톤을 녹입니다.
  2. 미디어에 17g의 박토 한천을 추가합니다.
  3. 45 분 동안 미디어를 압력솥 수욕에서 50 ° C로 미디어를 냉각.
  4. 1 ㎖ 콜레스테롤 (95 % 에탄올에 5 ㎎ / ㎖) 1 ㎖ 1 M 염화칼슘, 1 ㎖ 1 M 망초, 25 ㎖의 1 M 인산 칼륨 완충액 (pH 6.0) : 다음과 같은 솔루션을 추가합니다. 잘 섞는다.
  5. 1 ㎖ 1 M IPTG 500 ㎕의 암피실린 (멸균 100 ㎎ / ㎖)를 추가합니다.
  6. 잘 솔루션을 섞어 피펫 보조를 사용하여 멸균 절차에 따라 25 ㎖의 혈청 피펫 (60) X 15mm (직경 x 높이) 페트리 접시에 붓는다. 12 ML 한천 각 접시를 채우십시오. 플레이트는 최대 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

autophagy에 필수적인 유전자는 BEC-1은 살모넬라 감염에 대한 방어의 숙주 유전자의 기능을 검사하는 예로서 사용된다. 실험 절차는도 1 및 표 1에 도시된다. 감염의 RNAi-처리 된 동물의 제조 프로토콜은 괄호 안에 각 실험 단계의 일로, 다음과 같다.

  1. BEC-1 RNAi의 먹이를 접종 및 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 (1 일) 보충 2 ㎖ LB 배지에 -80 ° C 냉동 박테리아의 조각을 배치하여 빈 벡터 L4440 RNAi의 박테리아 먹이를 제어 할 수 있습니다. 신선한 RNAi의 세균을 가지고 전체 실험 기간 동안 일주일에 한 번이 단계를 반복합니다. 사용하지 않을 경우 4 ° C의 냉장고에 문화를 저장합니다.
  2. RNAi의 접시에 하룻밤 RNAi의 세균 배양을 100 ㎖의 종자. 세 BEC-1 RNAi의 세 제어 빈 V를 준비RNAi의 판을 엑터. 37 ° C에서의 하룻밤 (2 일)에서 번호판을 품어.
  3. 37 ° C의 배양기에서 RNAi의 플레이트를 제거하고 벤치에서 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 잘 공급 L4 야생형 N2 자웅 동체를 들고 그들을의 RNAi-1 벡 빈 벡터 RNAi의 판을 제어하는 전송. 세중의 플레이트에 플레이트에 세 벌레를 놓습니다. 단계 3.2 (3 일)에 설명 된대로 같은 날, RNAi의 판을 준비합니다.
  4. 3.3 단계에서 제조 된 신선한 해당 RNAi의 플레이트에 36-40 시간 및 전송 웜에 대한 20 ° C 배양기에서 벌레와 RNAi의 번호판을 품어. 웜이 전송 된 후, 64 시간 (4 일)에 20 °의 C 배양기에서 접시를 품어.

4. 감염 살모넬라 준비

  1. 줄무늬 살모넬라 -80 ° C 냉동 1 XLD 한천 접시에 하룻밤 (5 일 37 ° C에서 접시를 품어
  2. 잘 고립 된 검은 살모넬라 식민지를 선택하고 (6 일) 밤새 진탕 37 ° C에서 2 ㎖ LB 배지에 접종.
  3. 1 C.에 씨 80 ㎖의 살모넬라 균 배양 물 엘레 60 X 15mm (직경 x 높이) NGM 한천 플레이트와 총 6 판을 준비합니다. 6 시간 동안 실온에서 번호판을 품어. 세균 배양 접시 (주 7)에 잔디를 건조 형성한다.

살모넬라 5.을 감염 RNAi의 처리 벌레

  1. 이동 BEC-1 RNAi의 처리 및 살모넬라 판에 빈 벡터 RNAi의 처리 L4 N2의 자웅 동체 (3 단계에서 설정 벌레의 자손)을 제어 할 수 있습니다. 각 그룹에 대해 3 접시에 접시 당 40 벌레를 놓습니다. 48 시간 (주 7) 20 ° C에서 웜 번호판을 품어.
  2. 단계 3.1 및 3.2 (일 7에 설명 된대로 신선한 RNAi의 접시의 한 세트를 준비하고
  3. 48 시간 감염 후, 단계 5.2에서 제조 된 해당 RNAi의 접시에 살모넬라 균에 감염된 웜을 전송하고 20 ° C (9 일)에 품어.

6. 생존 분석

  1. 매일 벌레의 생존을 점수와 알을 낳는 시간 동안 신선한 해당 RNAi의 플레이트로 웜을 전송합니다. 단계 3.1 및 3.2에 설명 된대로 이전에 각 웜 전송에 신선한 RNAi의 접시 세트를 준비합니다. 부드럽게 끝 평평 백금 와이어 웜 몸 (머리, 중간 부분 및 꼬리)를 터치합니다. 웜 본체의 어떠한 움직임이 관찰되지 않은 경우 웜 죽은로서 획득된다.
  2. 매일 웜 또는 매일의 생존을 점수와 벌레가 산란을 중단 한 후 일주일에 두 번 신선한 해당 RNAi의 플레이트로 웜을 전송합니다.
  3. 모든 벌레가 죽은 후에, 하나의 데이터 세트로 세중 판에서 생존 데이터를 풀. 같은 그래프 패드 P 적절한 통계 소프트웨어에 각 그룹의 입력 생존 데이터생존 곡선을 생성하고 Kaplan-Meier 생존 분석을 수행 할 rism. 전체 실험의 결론을 확인하기 위해 한 번 이상 반복한다.

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Representative Results

20 ° C에서, 야생 형 N2 벌레의 평균 수명은. 살모넬라 균 감염이 크게 10.5 일 N2 웜의 평균 수명을 감소 십칠일 (그림 2A 및 표 2)는 (P = 0.0002, 로그 순위 검정) (그림 2A ).

만약 C. 엘레 유전자는 살모넬라 감염에 대한 방어에 중요한 역할을, 그것은 그것의 억제는 살모넬라 감염에 대한 감수성을 부여 할 것으로 예상된다. 사실, 살모넬라 균에 감염된 제어 RNAi의 처리 N2 동물에 비해, 살모넬라 균에 감염된 BEC-1의 RNAi 처리 N2 웜의 평균 수명은 (그림 9 일 (p <0.0001, 로그 순위 검정) 10.5 일에서 감소 2b 및 표 2). 최대 수명은 극적으로 (25 일 ~ 십일,도 2b 및 표 2) 14 일까지 단축된다. 또한, 수C-1의 RNAi는, 살모넬라 감염, 벡 - 1하지 않는 것이 RNAi의 치료를 나타내는 살모넬라 균 (P = 0.2593, 로그 순위 검정) (그림 2C 표 2)에 감염되지 않은 N2 벌레의 수명에 명백한 영향을주지 않습니다 살모넬라 균에 감염된 BEC-1의 RNAi 처리 벌레의 수명을 감소시킨다. 또한, BEC-1은 C.에 필수적인 유전자 살모넬라 균 감염에 대한 elegans의 방어.

그림 1
그림 1. 실험 절차의 흐름도.

그림 2
RNAi에 의해 BEC-1 유전자의 그림 2. 억제는 지속 수여C.에있는 살모넬라 균 감염에 ceptibility 엘레. 20 ℃에서 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium) 또는 비병원성 대장균에 2 일 노출 다음과 같은 제어 빈 벡터의 RNAi 또는 BEC-1 유전자의 RNAi 하나 처리 야생형 N2 동물의 AC) 생존 곡선 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

표 1
표 1. 살모넬라 균 감염 프로토콜 기간.

표 2
표 2.의 통계 분석그림 2의 데이터를 수명.

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Discussion

C. elegans의는 영양원으로 세균을 먹는 간단한 유전자 모델 생물이다. 따라서, C. 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 장내 병원체 정상 세균 음식을 대체하기 쉽다 엘레 및 선택 병원체. 여기 프로토콜은 살모넬라 균 감염과 C를 결합하여 설명 엘레 RNAi의 살모넬라 균 감염에 대한 방어의 호스트 유전자의 역할을 조사하는 치료를 먹이. 이전 감염 프로토콜은 C. 노출 엘레의 일생 (20) 동안 살모넬라 균 등 병원성 세균에 웜. 본 프로토콜에서는, 살모넬라는 2 일 기간에 웜을 감염. 그 후, 웜은 살모넬라 균에 노출이 더 이상 없습니다. 이 살모넬라 감염은 현저히 C.의 수명을 감소 야생형 동물 엘레 간스. 따라서, 살모넬라 균 내부에 벌레를 복제하고 동물 10을 죽이는 침략 살모넬라 균을 모방 살모넬라 균 감염에 의한 인간의 음식을 매개로 질병을 이해하는 유용한 정보를 발견하는 데 도움이됩니다 인간의 살모넬라 균 감염에 노출이 짧은 기간. 또한,이 프로토콜은 유전자 돌연변이는 사용할 수 없습니다 특히이 가능, 살모넬라 균 감염에 대한 숙주 방어에 관여 할 수있는 후보 유전자를 테스트하기 위해 제작, 살모넬라 균 감염 RNAi의 먹이 치료를 결합합니다. autophagy에 유전자 BEC-1 살모넬라 균 감염에 대한 방어에 관여하는 것으로 알려져 본 연구에서 예제로 사용됩니다. BEC-1 돌연변이는 성인의 살모넬라 균 감염에 대한 방어의 역할을 테스트 방지하는 치명적인 21입니다. 현재의 프로토콜을 사용하여, 그것의 RNAi 순서 BEC-1의 억제는 C.에서 살모넬라 감염에 대한 감수성을 산출 것으로 나타났다 엘레. 본 연구에서, N2 야생 형 웜 FEL4440 박테리아와 D는 OP50가 공급 동물로 비슷한 수명이있다. 동물은 6 일 주위에 죽을 시작하고 최대 수명은 약 사주입니다. 살모넬라 균에 감염 N2 벌레는 며칠 짧은 살고 있습니다. 두 그룹 모두 죽을 동물의 시작 날짜가 며칠 간격 만 (그림 2)하지만 이와는 대조적으로, 살모넬라 균에 감염된 BEC-1의 RNAi 처리 벌레는 약 2 배 빠른 속도로 대조군에 비해 사망. 전체 실험은 1 개월 정도 지속됩니다.

RNAi의 처리 L4 단계 자웅 동체가 살모넬라 균 감염에 노출 될 수 있도록이 프로토콜에서, RNAi의 공급 및 살모넬라 준비의 조정이 필요합니다. 저자들의 실험실에서 사용하는 프로토콜의 전형적인 시간 프레임을 표 1에 기재되어있다. RNAi의 먹이 박테리아 주간 제조되고 사용하지 않을 경우 세균 배양 4 ℃에서 저장된다. 참고로, 7 일째에, 감염이 6 시작0; 살모넬라 하룻밤 문화가 NGM 플레이트에 배치 된 후 시간. 이 6 시간 기간 동안 RNAi의 처리 L4 N2의 자웅 동체는 BEC-1 대응에서 선택 및 빈 벡터 RNAi의 판을 제어 할 수 있습니다. 컨트롤을 확인하기로 살모넬라 균 감염은 감염된 벌레의 수명을 단축하고 BEC-1의 RNAi 치료는 웜의 수명에 어떤 영향이 있는지. 경우 감염되지 않은 웜이 사용됩니다

C.의 현재 생존 감염 후 엘레 일반적 병원체 병원성 3-5을 측정하는 데 사용된다. 그러나, 특정 C.의 RNAi의 억제 엘레 유전자 수명 저하의 원인. 데이터를 해석 할 때 따라서, 하나는주의해야합니다. 이러한 상황이 발생하면, RNAi의 유도제 IPTG의 상이한 농도는 단지 동물 수명에 영향이없는 병원체 감염에 대한 숙주 반응에 영향을 원하는 농도를 확인하기 위해 테스트 될 수있다. 이전에보고 된 바와 같이 <SUP> (10), 1 nM의 IPTG 농도가 성공적 C.에서 IGF 신호 - 매개 병원체 저항에 autophagy의 역할을 조사하기 위해 사용 하였다 엘레.

주어진 C. elegans의 게놈은 서열화 및 C.되었습니다 엘레 RNAi의 먹이 라이브러리는 살모넬라 감염에 대한 방어에 관련된 모든 호스트 유전자를 확인하기 위해 게놈 전체 RNAi의 선별을 수행하도록 설명 된 프로토콜을 수정하는 것이 가능하고, (16, 18)이 생성되었다. 예를 들어, 대신 살모넬라의 독성을 측정하기 위해 평균 생존을 사용하는 최대 생존 사용된다. 또한, 감염된 웜은 플루오로 데 옥시 우리 딘, DNA 합성 억제제와 접시를 보완하여 멸균 할 수 있습니다. 따라서, 감염된 웜의 전송은 한 음식이 기아에서 벌레를 방지하기 위해 공급되는 불필요합니다. 이러한 수정은 대단히 높은 처리량 스크린 대한 부하를 줄일 것이다. 대규모 연구의이 유형은 발 모른다살모넬라 감염에 대한 인간의 반응을 이해 HED 빛 C.의 많은 생물 학적 경로 엘레은 진화 적으로 인간에 보존되어있다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 원고의 비판적 읽기 박사 다이앤 Baronas - 로웰 감사합니다. 이 작품은 과학 씨 그랜트의 FAU 찰스 E. 슈미트 대학 KJ에 엘리슨 의료 재단에서 노화 장학금 지원

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

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References

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감염 프로토콜<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt;와<em&gt; 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)</em
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