Summary
C. elegans heeft zich ontpopt als een nieuwe genetische model om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium combinatie met een dubbele streng RNAi interferentie techniek om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht.
Abstract
In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om interacties tussen gastheren en ziekteverwekkers te bestuderen, met inbegrip van de afweer tegen gram-negatieve bacterie Salmonella typhimurium. Salmonella stelt persistente infectie in de darm van C. elegans en resulteert in vroege dood van de besmette dieren. Een aantal immuniteitsmechanismen geïdentificeerd in C. elegans te verdedigen tegen Salmonella infecties. Autophagy, een evolutionair geconserveerd lysosomale afbraak route, is aangetoond dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren. Hier wordt een protocol beschreven te infecteren C. elegans met Salmonella typhimurium, waarbij de wormen worden blootgesteld aan Salmonella gedurende een beperkte tijd, vergelijkbaar met Salmonella-infectie bij mensen. Salmonella infectie aanzienlijk verkort de levensduur van C. elegans </ Em>. De essentiële Autofagie gen BEC-1 als voorbeeld, combineerden we deze infectie methode C. elegans RNAi voeden benadering en toonde dit protocol kan worden gebruikt om de functie van C. onderzocht elegans genen van de gastheer in de verdediging tegen Salmonella infectie. Sinds C. elegans hele genoom RNAi bibliotheken beschikbaar zijn, dit protocol maakt het mogelijk om uitgebreid te screenen op C. elegans genen die beschermen tegen Salmonella en andere intestinale pathogenen met behulp van genoom-brede RNAi bibliotheken.
Introduction
De vrijlevende bodem nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudige en genetisch handelbaar modelorganisme gebruikt voor vele biologische vraagstukken te bestuderen. C. elegans overwegend bestaat als zelfbemestende hermafrodieten. Mannetjes worden spontaan gegenereerd door niet-scheiding van het X-chromosoom tijdens gametogenese 1,2. In aanwezigheid van overvloedig voedsel, C. elegans voortdurend te ontwikkelen door middel van vier larvale stadia tot volwassene. Temperatuur beïnvloedt ook C. elegans ontwikkeling; snellere ontwikkeling waargenomen bij hogere temperaturen. In het laboratorium, C. elegans is gekweekt bij een standaard temperatuur van 20 ° C op agar platen met zaadjes bacterie Escherichia coli (stam OP50) als voedsel 1,2.
In het laatste decennium, C. elegans heeft zich ontpopt als een ongewerveld organisme om gastheer-pathogeen interacties 3-5 te bestuderen. In de natuur, C. elegans eet bacteriën als nutrient bron 1,2. De normale bacteriële laboratorium voedsel, OP50, kan gemakkelijk worden vervangen door andere pathogenen om de interactie tussen C onderzocht elegans en elke gewenste pathogeen. Onder deze omstandigheden, de darm is de primaire plaats van de infectie. Inderdaad, een groot aantal bacteriële pathogenen aangetoond dodelijk infecteren C. elegans 3-5.
De Gram-negatieve bacterie Salmonella is een gastro-intestinale ziekteverwekker die menselijk voedsel overgedragen ziekte veroorzaakt wereldwijd 6,7. C. elegans is een goed model gastheer voor Salmonella typhimurium als deze bacterie repliceert en vertoont aanhoudende darminfecties 8-10. C. elegans is gebruikt om zowel nieuwe identificatie en eerder bekende Salmonella virulentiefactoren 11. Interessant is dat de C. elegans immuunsysteem succes beperkt Salmonella replicatie. Eerder is gerapporteerd dat inhibvulle van autofagie genen maakt verhoogde Salmonella replicatie in C. elegans, resulterend in vroege dood van geïnfecteerde wormen 10. Macroautofagie (hierna autophagy) is een dynamisch proces, waarbij de herschikking van subcellulaire membranen cytoplasma en organellen sekwestreren voor levering aan het lysosoom voor afbraak 12. Autophagy is gemeld dat de Salmonella replicatie in C. beperken elegans en zoogdieren 10,13.
De C. elegans genoom was de eerste meercellige eukaryote genoom in kaart gebracht; Het reageert op RNAi behandeling 14-16. Bovendien kan RNAi effectief worden beheerd door het onderwerpen wormen bacteriën die de dubbelstrengs RNA van doelwitgen, bekend als RNAi voeden 16,17 innemen. Hele genoom RNAi voeden bibliotheken zijn gegenereerd voor genoom-brede RNAi screening 16,18. Hierin, een Salmonella-infectie proprotocol is gekoppeld RNAi voeden beproefd C. toestaan elegans genen van belang vanwege hun vermogen om te beschermen tegen Salmonella infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. XLD (Xylose Lysine desoxycholaat) Agar Plates
XLD agar is een selectieve groei medium voor Salmonella, die verschijnt als zwarte kolonies op XLD agar platen. Echter, als er geen problemen van verontreiniging, bijvoorbeeld een LB plaat kan worden vervangen.
- Weeg 5,5 g XLD agar en resuspendeer in 5 ml gedeïoniseerd water.
- Meng grondig tot alle agar is nat. Voeg 95 ml gedemineraliseerd water tot alle klontjes zijn verdwenen en het medium is volledig geresuspendeerd.
- Kook de middellange tot volledig oplossen (niet in een autoclaaf).
- Koel het medium bij kamertemperatuur tot 50 ° C.
- Giet 25 ml agar elk 95 x 15 mm (diameter x hoogte) plaat (platen met Parafilm afgesloten kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand).
2. Nematoden groeimedium (NGM) RNAi Feeding Plates
Bereiding van C. elegans NGM platen is eerder beschreven 19. Hier procedure kort beschreven om het antibioticum ampicilline en RNAi chemische inductor isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen aan de NGM media om de RNAi voeden plates.
- Los 3 g NaCl en 2,5 g Bacto pepton in 1 liter gedemineraliseerd water.
- Voeg 17 g Bacto agar in de media.
- Autoclaaf de media voor 45 minuten en koel het medium tot 50 ° C in een waterbad.
- Voeg de volgende oplossingen: 1 ml cholesterol (5 mg / ml in 95% ethanol), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, en 25 ml 1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 6,0). Meng goed.
- Voeg 1 ml 1 M IPTG en 500 ul ampicilline (100 mg / ml in steriel water).
- Meng de oplossing goed en giet het in 60 x 15 mm (diameter x hoogte) petri platen met behulp van een pipet hulp en 25 ml serologische pipet volgende steriele procedures. Vul elke plaat met 12 ml agar. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 1 maand.
De essentiële Autofagie gen BEC-1 wordt als voorbeeld de functie van een gastheer gen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht. De experimentele procedures zijn weergegeven in figuur 1 en tabel 1. Het protocol voor de bereiding RNAi-behandelde dieren geïnfecteerd volgt met de dag van elke experimentele stap haakjes.
- Inoculeer BEC-1 RNAi voeden en besturen lege vector L4440 RNAi voeden bacteriën door een vlok van -80 ° C bevroren bacteriën in 2 ml LB-medium aangevuld met 100 mg / ml ampicilline (dag 1). Herhaal deze stap een keer per week gedurende het hele experiment om verse RNAi bacteriën. Bewaar de cultuur in de 4 ° C koelkast wanneer ze niet gebruikt.
- Zaad 100 ml overnacht RNAi bacteriecultuur op RNAi-platen. Bereid drie bec-1 RNAi en drie controle lege vector RNAi platen. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende de nacht (Dag 2).
- Verwijder de RNAi platen uit de 37 ° C incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur op de bank. Pick up weldoorvoede L4 wild type N2 hermafrodieten en overbrengen naar bec-1 RNAi en controle lege vector RNAi platen. Plaats drie wormen per plaat, op drievoud platen. Op dezelfde dag, bereiden RNAi platen zoals beschreven in stap 3.2 (dag 3).
- Incubeer de RNAi platen met wormen in de 20 ° C incubator voor 36-40 uur en overdracht wormen frisse overeenkomstige RNAi platen bereid in stap 3.3. Na wormen worden overgedragen, incubeer de platen in de 20 ° C incubator gedurende 64 uur (dag 4).
4. Bereid je voor Salmonella-infectie
- Streak Salmonella -80 ° C bevroren bestand op 1 XLD agar plaat en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende de nacht (Dag 5
- Kies een goed geïsoleerde zwart Salmonella kolonie en beënt in 2 ml LB-medium bij 37 ° C onder schudden gedurende de nacht (dag 6).
- Zaad 80 ml Salmonella overnachtkweek op 1 C. elegans 60 x 15 mm (diameter x hoogte) NGM agar plaat en bereiden 6 borden in totaal. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 6 uur. De bacteriecultuur moet drogen en vormen een grasveld op de plaat (Dag 7).
5. Infect RNAi-behandelde Worms met Salmonella
- Transfer bec-1-RNAi behandelde en controle lege vector-RNAi behandeld L4 N2 hermafrodieten (nakomelingen van wormen is ingesteld in stap 3) Salmonella platen. Plaats 40 wormen per plaat op 3 platen voor elke groep. Incubeer de worm platen bij 20 ° C gedurende 48 uur (dag 7).
- Bereid een set van verse RNAi platen zoals beschreven in stap 3.1 en 3.2 (Dag 7 en
- Na 48 uur infectie overdraagbaar Salmonella geïnfecteerde wormen in de overeenkomstige RNAi platen bereid in stap 5.2 en incubeer bij 20 ° C (dag 9).
6. Overleving Assay
- De score van de overleving van wormen dagelijkse en overdragen wormen frisse overeenkomstige RNAi borden tijdens de eierleggende tijd. Bereid een reeks verse RNAi platen voorafgaand aan elke worm overdracht zoals beschreven in stap 3.1 en 3.2. Raak de worm lichaam (hoofd, middenstuk en staart) voorzichtig met een-end afgevlakt platina draad. Een worm wordt gescoord als dood als er geen beweging van de worm lichaam wordt waargenomen.
- De score van de overleving van wormen dagelijks of om de andere dag, en breng wormen frisse overeenkomstige RNAi platen twee keer per week na wormen stoppen het leggen van eieren.
- Immers wormen sterven, bundelen de overleving gegevens van drievoud platen als een dataset. Voer de overleving gegevens van elke groep in de juiste statistische software zoals GraphPad Prism om overlevingscurven genereren en Kaplan-Meier survival analyses uit te voeren. Het gehele experiment ten minste eenmaal herhaald om de conclusie te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij 20 ° C, de gemiddelde levensduur van wild-type N2 wormen is 17 dagen (Figuur 2A en tabel 2). Salmonella-infectie vermindert aanzienlijk de mediane levensduur van N2 wormen tot 10,5 dagen (p = 0,0002, log-rank test) (Figuur 2A ).
Als een C. elegans gen een belangrijke rol in de verdediging tegen Salmonella infectie speelt, wordt voorspeld dat de remming gevoeligheid zal geven Salmonella infectie. In feite, in vergelijking met Salmonella besmette controle RNAi-behandelde N2 dieren, de mediane levensduur van Salmonella besmette BEC-1-RNAi behandeld N2 wormen is gedaald van 10,5 dagen tot 9 dagen (p <0,0001, log-rank test) (Figuur 2B en Tabel 2). De maximale levensduur drastisch verkort met 14 dagen (van 24 dagen tot 10 dagen, figuur 2B en tabel 2). Bovendien zijn dec-1 RNAi heeft geen duidelijk effect op de levensduur van N2 wormen die niet besmet zijn met Salmonella (p = 0,2593, log-rank test) (figuur 2C en tabel 2), wat aangeeft dat Salmonella-infectie, niet bec-1 RNAi behandeling, vermindert de levensduur van Salmonella-infectie BEC-1-RNAi behandeld wormen. Ook BEC-1 is een essentieel gen in C. elegans verdediging tegen Salmonella-infectie.
Figuur 1. Stroomdiagram van de experimentele procedures.
Figuur 2. Remming van Bec-1 gen door RNAi verleent susceptibility Salmonella-infectie bij C. elegans. AC) Survival rondingen van wild-type N2 dieren behandeld met ofwel controle lege vector RNAi of bec-1 gen RNAi na een blootstelling van 2 dagen naar Salmonella typhimurium of niet-pathogene Escherichia coli bij 20 ° C. Klik hier om een grotere versie van te bekijken dit cijfer.
Tabel 1. Salmonella-infectie protocol tijdsbestek.
Tabel 2. Statistische analyse vanlevensduur gegevens in Figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans is een eenvoudige genetisch modelorganisme dat bacteriën eet als bron van voedingsstoffen. Zo is het gemakkelijk om de normale bacteriële voedsel te vervangen door een intestinale pathogeen interacties tussen C. onderzoeken elegans en de gekozen pathogeen. Hierin een protocol wordt beschreven aan Salmonella-infectie en C. combineren elegans RNAi voeden behandeling om de rol van ontvangende genen bij afweer tegen Salmonella infectie onderzocht. Vorige infectie protocollen bloot C. elegans wormen ziekteverwekkende bacteriën zoals Salmonella tijdens hun leven 20. In het huidige protocol, Salmonella infecteert de wormen in een periode van twee dagen. Daarna de wormen niet langer blootgesteld aan Salmonella. Dit Salmonella-infectie vermindert aanzienlijk de levensduur van C. elegans wild type dieren. Zo vielen Salmonella repliceren binnen wormen en doden de dieren 10 Salmonella bootst de menselijke Salmonella-infectie, die moeten helpen om nuttige informatie te ontdekken om te begrijpen menselijk voedsel overgedragen ziekte veroorzaakt door Salmonella-infectie. Bovendien is dit protocol combineert de RNAi voeden behandeling met Salmonella-infectie, waardoor het mogelijk is om te testen een kandidaat genen die mogelijk betrokken zijn bij de afweer tegen Salmonella infectie, vooral wanneer de genetische mutanten zijn niet beschikbaar. De autofagie gen bec-1 bekend betrokken te zijn in de verdediging tegen Salmonella infectie wordt als voorbeeld gebruikt in deze studie. BEC-1 mutaties zijn dodelijk 21, die het testen van haar rol in de verdediging tegen Salmonella infectie bij volwassenen voorkomt. De huidige protocol is aangetoond dat remming van Bec-1 door RNAi geeft gevoeligheid voor Salmonellabesmettingen C. elegans. In de huidige studie, N2 wild type wormen fed met L4440 bacteriën hebben een vergelijkbare levensduur als dieren gevoed met OP50. De dieren beginnen te sterven rond dag 6 en de maximale levensduur is ongeveer vier weken. N2 wormen besmet door Salmonella leven een paar dagen korter. Daarentegen BEC-1-RNAi behandeld wormen geïnfecteerd met Salmonella matrijs ongeveer twee keer sneller dan controledieren hoewel de begindatum voor dieren dood in beide groepen slechts een paar dagen uit elkaar (figuur 2). Het hele experiment duurt ongeveer 1 maand.
In dit protocol wordt de coördinatie van RNAi voeden en Salmonella voorbereiding nodig, zodat RNAi-behandelde L4 stadium hermafrodieten worden onderworpen aan Salmonella-infectie. Een typische looptijd van het protocol in lab de auteurs wordt beschreven in Tabel 1. RNAi voeden bacteriën wekelijks bereid en de bacteriekweek wordt bewaard bij 4 ° C wanneer ze niet gebruikt. Van de nota, op dag 7, zal de infectie start 60; uur na Salmonella overnachtcultures op NGM platen worden geplaatst. Tijdens deze 6 uur periode worden RNAi-behandelde L4 N2 hermafrodieten geplukt van overeenkomstige BEC-1 en besturen lege vector RNAi platen. De niet-geïnfecteerde wormen worden gebruikt als controles op basis waarvan Salmonella infectie verkort de levensduur van geïnfecteerde wormen en als BEC-1 RNAi behandeling heeft geen invloed op worm levensduur.
Momenteel overleving van C. elegans na infectie wordt vaak gebruikt om de pathogeen virulentie 3-5 meten. Echter, RNAi remming van bepaalde C. elegans genen resulteren in een verminderde levensduur. Daarom moet men voorzichtig zijn bij het interpreteren van de gegevens. Wanneer deze situatie zich voordoet, verschillende concentraties van de RNAi inductor, IPTG, worden getest om de gewenste concentratie die alleen beïnvloedt de gastheer respons op het pathogeen infecties zonder impact op het dier levensduur identificeren. Zoals eerder gerapporteerd <sup> 10, de 1 nM IPTG concentratie werd met succes gebruikt om de rol van autofagie in IGF-signalering gemedieerde pathogeenresistentie in C. onderzocht elegans.
Gezien het feit dat de C. elegans genoom gesequenced en C. elegans RNAi voeden libraries zijn gegenereerd 16,18, is het mogelijk de beschreven protocol herzien een genoom-brede RNAi screening uitvoeren om alle ontvangende genen betrokken bij afweer tegen Salmonella infectie te identificeren. Bijvoorbeeld, in plaats van de mediane overleving van de virulentie van Salmonella meten de maximale overleving gebruikt. Bovendien kunnen geïnfecteerde wormen worden gesteriliseerd door aanvulling platen met fluordeoxyuridine, een DNA-synthese-inhibitor. Zo, het overbrengen van besmette wormen is overbodig zolang voedsel wordt geleverd aan wormen voorkomen van de honger. Deze wijzigingen zullen de werklast voor een high-throughput screen enorm verminderen. Dit soort grootschalige studie kan shed licht op het begrip van de menselijke reactie op Salmonella-infectie zoveel mogelijk biologische routes in C. elegans zijn evolutionair geconserveerd bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken dr. Diane Baronas-Lowell voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant en een vergrijzende Scholarship van de Ellison Medical Foundation aan KJ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15 mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S.
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T.
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
