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Immunology and Infection

Un protocole d'infecter Published: June 26, 2014 doi: 10.3791/51703
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University

Summary

C. elegans a émergé comme un nouveau modèle génétique pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ici, nous décrivons un protocole pour infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium couplé avec la technique d'interférence double-brin ARNi pour étudier le rôle des gènes de l'hôte dans la défense contre l'infection à Salmonella.

Abstract

Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions entre hôtes et pathogènes, y compris la défense de l'hôte contre les bactéries gram-négatif bactérie Salmonella typhimurium. Salmonella établit une infection persistante dans l'intestin de C. elegans et entraîne la mort précoce des animaux infectés. Un certain nombre de mécanismes de l'immunité ont été identifiés en C. elegans pour se défendre contre les infections à Salmonella. Autophagy, une voie de dégradation lysosomale évolutif conservé, a été montré pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères. Ici, un protocole est décrit à infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium, dans laquelle les vers sont exposés à Salmonella pendant une durée limitée, semblable à une infection à Salmonella chez l'homme. infection à Salmonella raccourcit considérablement la durée de vie de C. elegans </ Em>. Utilisation du gène de l'autophagie essentiel bec-1, par exemple, nous avons combiné cette méthode d'infection à C. elegans ARNi alimentation approche et montré ce protocole peut être utilisé pour examiner la fonction de C. gènes de l'hôte elegans dans la défense contre l'infection à Salmonella. Depuis C. elegans génome des bibliothèques entières de RNAi sont disponibles, ce protocole permet à l'écran complètement pour C. gènes elegans qui protègent contre les salmonelles et d'autres agents pathogènes intestinaux utilisant des bibliothèques de l'ARNi du génome entier.

Introduction

Le nématode du sol vivant librement Caenorhabditis elegans est un organisme simple et génétiquement traitable modèle utilisé pour étudier plusieurs questions biologiques. C. elegans existe dominante comme hermaphrodites auto-fertilisation. Les mâles sont spontanément générées par des non-disjonction du chromosome X durant la gamétogenèse 1,2. En présence d'une alimentation abondante, C. elegans développer en continu à travers quatre stades larvaires à l'âge adulte. La température influe aussi C. développement elegans; On observe un développement plus rapide à des températures plus élevées. En laboratoire, C. elegans est cultivé à une température standard de 20 ° C sur gélose ensemencée avec la bactérie Escherichia coli (souche OP50) que la nourriture 1,2.

Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions hôte-pathogène 3-5. Dans la nature, C. elegans mange des bactéries comme nutrient la source 1,2. Sa nourriture de laboratoire bactérienne normale, OP50, peut être facilement remplacé par d'autres agents pathogènes d'étudier les interactions entre C. elegans et n'importe quel agent pathogène choisi. Dans ces conditions, l'intestin est le site primaire de l'infection. En effet, une large gamme de pathogènes bactériens a été montré pour infecter léthalement C. elegans 5.3.

La bactérie Salmonella Gram négatif est un agent pathogène gastro-intestinal qui provoque une maladie d'origine alimentaire humaine dans le monde 6,7. C. elegans est un bon hôte de modèle pour Salmonella typhimurium que cette bactérie se réplique et présente infections intestinales persistantes 8-10. C. elegans a été utilisé pour identifier à la fois roman et les facteurs précédemment connu virulence de Salmonella 11. Fait intéressant, l'C. système immunitaire elegans limite efficacement la réplication de la bactérie Salmonella. Il a été rapporté précédemment que inhibition des gènes de l'autophagie rend réplication accrue de Salmonella dans C. elegans, entraînant la mort précoce de vers infectées 10. Macroautophagie (ci-après appelé autophagie) est un processus dynamique impliquant le réarrangement des membranes intracellulaires de séquestrer cytoplasme et des organites pour la livraison vers le lysosome pour dégradation 12. Autophagy a été rapportée pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères 10,13.

Le C. génome elegans a été le premier génome eucaryote multicellulaire séquencé; il est sensible à l'ARNi traitement 14-16. En outre, l'ARNi peut être administré efficacement en soumettant les vers à ingérer des bactéries contenant de l'ARN à double brin du gène cible, connu sous le nom de RNAi alimentation 16,17. Bibliothèques d'alimentation ARNi du génome entier ont été générés pour l'ARNi du génome de dépistage 16,18. Ici, une infection pro Salmonellaprotocole est couplé avec l'ARNi alimentation pour permettre de tester C. gènes elegans d'intérêt pour leur capacité à protéger contre l'infection à Salmonella.

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Protocol

1. XLD (xylose-lysine-désoxycholate) des plaques de gélose

gélose XLD est un milieu de croissance sélective de Salmonella, qui apparaît comme des colonies noires sur des plaques de gélose XLD. Toutefois, s'il n'y a pas des préoccupations de contamination, une plaque régulière LB peut être substitué.

  1. Peser 5,5 g XLD agar et remettre en suspension dans 5 ml d'eau déminéralisée.
  2. Bien mélanger jusqu'à ce que tous agar est humide. Ajouter 95 ml d'eau déminéralisée jusqu'à ce que tous les grumeaux et le milieu est complètement remises en suspension.
  3. Faire bouillir le milieu pour dissoudre complètement (ne pas l'autoclave).
  4. Refroidir le milieu à la température ambiante à 50 ° C.
  5. Verser 25 ml d'agar dans chacune 95 x 15 mm (diamètre x hauteur) plaque (plaques scellées avec du Parafilm peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1 mois).

2. Nématode Croissance moyenne (NGM) ARNi alimentation Plaques

C. Préparation d' des plaques NGM elegans a été décrit précédemment une9. Voici une procédure est décrite brièvement à ajouter l'antibiotique ampicilline et l'ARNi inducteur chimique isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans le support NGM pour fabriquer les plaques d'alimentation d'ARNi.

  1. Dissoudre 3 g de NaCl et 2,5 g Bacto peptone dans 1 L d'eau déminéralisée.
  2. Ajouter 17 g de gélose Bacto dans les médias.
  3. Autoclaver le support pendant 45 minutes et refroidir le support à 50 ° C dans un bain d'eau.
  4. Ajouter les solutions suivantes: 1 ml de cholestérol (5 mg / ml dans de l'éthanol à 95%), 1 ml de 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4, et 25 ml de 1 M de tampon phosphate de potassium (pH 6,0). Mélangez bien.
  5. Ajouter 1 ml de 1 M d'IPTG et 500 ul d'ampicilline (100 mg / ml dans de l'eau stérile).
  6. Bien mélanger la solution et verser dans les 60 x 15 mm (diamètre x hauteur) des plaques de Pétri en utilisant une aide Pipet et 25 ml de pipettes sérologiques suivants procédures stériles. Remplir chaque plaque avec 12 ml de gélose. Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant jusqu'à 1 mois.

Le gène de l'autophagie essentiel bec-1 est utilisé comme un exemple d'examiner la fonction d'un gène de l'hôte dans la défense contre l'infection à Salmonella. Les procédures expérimentales sont illustrées à la Figure 1 et le Tableau 1. Le protocole de préparation des animaux RNAi-traités pour une infection résulte, avec le jour de chaque étape expérimentale donnée entre parenthèses.

  1. Inoculer bec-1 ARNi alimentation et de contrôler le vecteur vide L4440 ARNi nourrir les bactéries en plaçant un flocon de -80 ° C bactéries congelées dans 2 ml de milieu LB additionné de 100 mg / ml d'ampicilline (Jour 1). Répétez cette étape une fois par semaine pendant toute l'expérience d'avoir des bactéries ARNi frais. Rangez la culture dans le réfrigérateur à 4 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé.
  2. Ensemencer 100 ml de culture bactérienne nuit ARNi sur des plaques de RNAi. Préparer trois bec-1 ARNi et commande trois vide vEctor plaques ARNi. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit (Jour 2).
  3. Retirer les plaques d'ARNi de 37 ° C incubateur et les laisser refroidir à la température ambiante sur le banc. Pick-up bien nourris L4 type sauvage hermaphrodites N2 et les transfèrent à Bec-1 ARNi et contrôlent vides vecteur plaques de RNAi. Placez trois vers par plaque, sur des plaques en triple. Le même jour, préparer des plaques ARNi comme décrit dans l'étape 3.2 (Jour 3).
  4. Incuber les plaques d'ARNi avec des vers dans l'incubateur à 20 ° C pour 36-40 h et de transfert vers Fresh plaques d'ARNi correspondants préparés à l'étape 3.3. Après les vers sont transférés, incuber les plaques à 20 ° C incubateur pendant 64 heures (jour 4).

4. Préparer Salmonella de l'infection

  1. Streak Salmonella -80 ° C stock congelé sur une plaque de gélose XLD et incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit (Jour 5
  2. Choisissez une colonie de Salmonella noir bien isolé et l'inoculer dans 2 ml de milieu LB à 37 ° C avec agitation pendant la nuit (Jour 6).
  3. Seed 80 ml ​​Salmonella culture de la nuit sur ​​une C. elegans 60 x 15 mm (diamètre x hauteur) plaque de gélose NGM et préparer 6 plaques au total. Incuber les plaques à température ambiante pendant 6 heures. La culture bactérienne doit sécher et former une pelouse sur la plaque (jour 7).

5. Worms Infect ARNi traités avec Salmonella

  1. Transfert bec-1 ARNi traités et témoins vides vecteur ARNi traité hermaphrodites L4 N2 (de la descendance des vers mis en place à l'étape 3) des plaques de Salmonella. Placez 40 vers par plaque 3 plaques pour chaque groupe. Incuber les plaques à vis sans fin à 20 ° C pendant 48 heures (Jour 7).
  2. Préparer un ensemble de plaques d'ARNi frais comme décrit dans les étapes 3.1 et 3.2 (Jour 7 et
  3. Après 48 heures de l'infection, transférer vers infectés par Salmonella sur les plaques d'ARNi correspondants préparés à l'étape 5.2 et incuber à 20 ° C (Jour 9).

6. Survival Assay

  1. Note la survie des vers tous les jours et transférer vers les plaques ARNi correspondant fraîches pendant la période de ponte. Préparer une série de plaques de RNAi frais avant chaque transfert de ver comme décrit dans les étapes 3.1 et 3.2. Toucher le corps de vis sans fin (de la tête, partie centrale et la queue) délicatement avec un fil de platine fin aplatie. Un ver est marqué comme mort si aucun mouvement du corps du ver est observée.
  2. Note la survie des vers par jour ou tous les deux jours, et de les transférer vers des plaques ARNi correspondant frais deux fois par semaine après les vers ne pondent.
  3. Après tous les vers meurent, regrouper les données de survie à partir de plaques en triple comme un ensemble de données. Entrez les données de survie de chaque groupe dans le logiciel statistique approprié tel que GraphPad Prisme pour générer des courbes de survie et d'effectuer de Kaplan-Meier analyse de survie. L'expérience est répétée au moins une fois pour confirmer la conclusion.

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Representative Results

A 20 ° C, la durée de vie médiane de type sauvage vers N2 est de 17 jours (figure 2A et Tableau 2). L'infection à Salmonella diminue de manière significative la durée de vie médiane de vers N2 à 10,5 jours (p = 0,0002, log-rank test) (figure 2A ).

Si un C. gène elegans joue un rôle important dans la défense contre l'infection à Salmonella, il est prévu que son inhibition peut conférer la susceptibilité à l'infection à Salmonella. En fait, par rapport à contrôle ARNi animaux traités infectés par Salmonella N2, la durée de vie médiane des infectés par Salmonella bec-1 ARNi traité vers N2 est réduite de 10,5 à 9 jours (p <0,0001, test du log-rank) (Figure 2B et tableau 2). La durée de vie maximale est considérablement raccourcie de 14 jours (à partir de 24 jours à 10 jours, de la figure 2B et le tableau 2). En outre, le êtrec-1 RNAi n'a aucun effet évident sur ​​la durée de vie des vers N2 qui ne sont pas infectés par Salmonella (p = 0,2593, log-rank test) (figure 2C et tableau 2), ce qui indique que l'infection à Salmonella, pas Bec-1 traitement ARNi, diminue la durée de vie de bec-1 vers ARNi traités infectés par Salmonella. En outre, bec-1 est un gène essentiel à C. elegans défense contre l'infection à Salmonella.

Figure 1
Figure 1. Diagramme des procédures expérimentales.

Figure 2
Figure 2. Inhibition de bec-1 gène par ARNi confère sussusceptibilité à l'infection par Salmonella dans C. elegans. courbes AC) de survie des animaux N2 de type sauvage traitées avec soit le contrôle vecteur vide ARNi ou bec-1 gène ARNi après une exposition de 2 jours de Salmonella typhimurium ou non pathogène Escherichia coli à 20 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1
Tableau 1. Infection à Salmonella protocole délai.

Tableau 2
Tableau 2. Analyse statistique dedurée de vie des données dans la figure 2.

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Discussion

C. elegans est un simple organisme modèle génétique qui mange des bactéries comme source d'éléments nutritifs. Ainsi, il est aisé de substituer sa nourriture bactérienne normale avec un agent pathogène intestinal pour enquêter sur les interactions entre C. elegans et l'agent pathogène choisi. Ici, un protocole est décrit à combiner infection à Salmonella et C. elegans ARNi alimentation de traitement pour examiner le rôle des gènes de l'hôte dans la défense contre l'infection à Salmonella. Protocoles d'infection précédents exposent C. vers elegans à des bactéries pathogènes, notamment la Salmonella au cours de leur vie 20. Dans le présent protocole, Salmonella infecte les vers dans une période de deux jours. Après cela, les vers ne sont plus exposés à la bactérie Salmonella. Cette infection à Salmonella diminue de manière significative la durée de vie de C. elegans animaux de type sauvage. Ainsi, envahi Salmonella reproduire vers l'intérieur et de tuer les animaux 10 Salmonella imite d'infection humaine à Salmonella, ce qui devrait aider à découvrir des informations utiles pour comprendre la maladie d'origine alimentaire humaine causée par une infection à Salmonella. En outre, ce protocole combine le traitement d'alimentation ARNi avec une infection à Salmonella, permettant de tester des gènes candidats qui pourraient être impliquées dans la défense de l'hôte contre l'infection à Salmonella, en particulier lorsque les mutants génétiques ne sont pas disponibles. Le gène de l'autophagie bec-1 connue pour être impliquée dans la défense contre l'infection à Salmonella est utilisé comme un exemple dans la présente étude. Mutations bec-1 sont létales 21, ce qui empêche de tester son rôle dans la défense contre l'infection à Salmonella chez l'adulte. En utilisant le protocole actuel, il a été montré que l'inhibition de bec-1 par ARNi donne la susceptibilité à l'infection par Salmonella dans C. elegans. Dans la présente étude, N2 sauvages vers de type Fed avec des bactéries L4440 ont une durée de vie similaire à celui d'animaux nourris avec OP50. Les animaux commencent à mourir autour du jour 6 et la durée de vie maximale est d'environ quatre semaines. Vers N2 infectés par Salmonella vivent quelques jours de moins. En revanche, bec-1 vers ARNi traités infectés par Salmonella meurent environ deux fois plus vite que les animaux de contrôle, bien que la date de début pour les animaux de mourir dans les deux groupes est à seulement quelques jours d'intervalle (figure 2). L'expérience entière dure environ 1 mois.

Dans ce protocole, la coordination de l'ARNi alimentation et la préparation Salmonella est nécessaire pour que les hermaphrodites stade L4 ARNi traités sont soumis à une infection à Salmonella. Un calendrier typique du protocole utilisé dans le laboratoire des auteurs est décrite dans le tableau 1. Bactéries se nourrissant de RNAi sont préparés chaque semaine et la culture bactérienne est stocké à 4 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé. Fait à noter, le jour 7, l'infection va commencer 60; heures après Salmonella cultures de la nuit sont placés sur des plaques NGM. Au cours de cette période de 6 heures, l'ARNi traités hermaphrodites L4 N2 sont cueillies à partir correspondant bec-1 et contrôlent vides vecteur plaques d'ARNi. Les vers non infectés sont utilisés comme témoins pour déterminer si l'infection à Salmonella raccourcit la durée de vie des vers infectés, si bec-1 traitement ARNi a une influence sur la durée de vie ver.

Actuellement, la survie de C. elegans après l'infection est couramment utilisé pour mesurer la virulence de l'agent pathogène 3-5. Cependant, l'inhibition de l'ARNi certain C. gènes elegans entraînent une diminution de la durée de vie. Par conséquent, il faut être prudent dans l'interprétation des données. Lorsque cette situation est rencontrée, différentes concentrations de l'inducteur de l'ARNi, de l'IPTG, peut être testé pour déterminer la concentration désirée qui n'influe que sur la réponse de l'hôte aux infections pathogènes sans incidence sur la durée de vie de l'animal. Comme indiqué précédemment <sup> 10, la concentration de 1 nM d'IPTG a été utilisée avec succès pour étudier le rôle des IGF dans autophagy résistance aux agents pathogènes dans la signalisation médiée par C. elegans.

Étant donné que l'C. génome a été séquencé elegans et C. bibliothèques alimentation elegans ARNi ont été générées 16,18, il est possible de réviser le protocole décrit pour effectuer un dépistage de ARNi à grande échelle pour identifier tous les gènes de l'hôte impliqués dans la défense contre l'infection à Salmonella. Par exemple, au lieu d'utiliser la médiane de survie pour mesurer la virulence de Salmonella, la survie maximale est utilisée. En outre, les vers infectées peuvent être stérilisées en la complétant avec des plaques fluorodésoxyuridine, un inhibiteur de la synthèse de l'ADN. Ainsi, le transfert de vers infectées n'est pas nécessaire tant que la nourriture est fournie pour empêcher les vers de la famine. Ces modifications permettront de réduire la charge de travail pour un écran à haut débit énormément. Ce type d'étude à grande échelle peut shed lumière sur la compréhension de la réponse humaine à l'infection à Salmonella autant de voies biologiques dans C. elegans sont conservées dans l'évolution, les humains.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Diane Baronas-Lowell pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Charles E. Schmidt College FAU des sciences Subvention de démarrage et une bourse d'études du vieillissement de la Fondation médicale Ellison à KJ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm  Fisher 08-757-13A
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

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Immunologie Numéro 88, L'autophagie infection agent pathogène l'hôte l'ARNi
Un protocole d&#39;infecter<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Avec<em&gt; Salmonella typhimurium</em
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Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

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